Способ оценки биосовместимости скаффолдов

Изобретение относится к медицине, биологии, ветеринарии, фармакологии и предназначено для оценки биосовместимости используемых в тканевой инженерии для стимуляции регенерации тканей скаффолдов на основе биохимического определения маркеров ангиогенного потенциала.

Множество факторов влияют на заселение скаффолда клетками (его регенераторный потенциал), включая параметры возникающей при имплантации в организм воспалительной реакции и способность к васкуляризации. Биосовместимость матрицы является основополагающим свойством, определяющим как развитие воспаления, так и васкуляризацию, а также заселение клетками. В связи с чем параметры ангиогенного ответа при имплантационных тестах, наравне с показателями воспалительного ответа может выступать в качестве основных критериев оценки биосовместимости.

Известен способ определения биосовместимости гемосорбентов [авторское свидетельство SU на изобретение №1176249], включающий инкубацию адсорбента со стандартной лейковзвесью донора с добавлением раствора нитросинего тетразолия в конечной концентрации 2-4 мг/мл, приготовление мазков и определение числа нейтрофилов, имеющих отложения диформазона. По соотношению числа нейтрофилов, имеющих отложения диформазона до и после инкубации с гемосорбентом, судят об его биосовместимости с кровью. Однако, проведение способа в условиях in vitro, не позволяет провести оценку биосовместимости в динамике.

Известен способ определения биосовместимости инородного материала с организмом, включающий отбор исследуемого материала у индивидуума, добавление непосредственно в клеточную субстанцию инородного материала в виде порошка с размером частиц от 0,5 до 1 мм³ в количестве 500 мкг и определение цитохимических показателей ферментативной активности клеток до и после внесения в клеточную субстанцию инородного материала [патент RU на изобретение №2402773]. Недостатком этих методов, и аналогичных им, основанных на использование клеточных культур, является то, что они не позволяют оценить иммунную реакцию целого организма, а также не дают возможности оценки сосудистых реакций на имплантацию и отсроченных результатов.

Известна также группа методов оценки биосовместимости, основанных на имплантации скаффолдов под кожу экспериментальным животным. Известны методы оценки биосовместимости, включающие исследование гистологических препаратов биоптатов тканей, полученных из области имплантации скаффолдов у экспериментальных животных (Оценка биосовместимости имплантационных кальций-фосфатных материалов в зависимости от их минерального состава/ И.А. Талашова, Т.А. Силантьева, Н.А. Кононович, С.Н. Лунева // Бюллетень сибирской медицины. № 3. 2012. C 62-69; Robocasting nanocomposite scaffolds of poly(caprolactone)/hydroxyapatite incorporating modified carbon nanotubes for hard tissue reconstruction/ B. Dorj, J.E. Won, J.H. Kim, S.J. Choi, U.S. Shin, H.W. Kim // J Biomed Mater Res A. 2013 Jun. 101(6). Р. 1670-1681.). Недостатком этих методов является то, морфологические методы оценки результатов имплантации являются полуколичественными, что затрудняет сравнение биосовместимости различных скаффолдов и требует стандартизации. Кроме того, согласно межгосударственному стандарту ISO в течение первых двух недель после имплантации реакция тканей обусловлена самой процедурой хирургического вмешательства, которую трудно отделить от реакции на имплантируемый материал (ГОСТ ISO 10993-6—2011. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации /Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 6. Tests for local effects after implantation. Дата введения: 01.01.2013). Согласно ранее опубликованным данным с помощью морфологических методов оценки выявление признаков васкуляризации биодеградируемых матриц возможно с 14-х суток после имплантации под кожу белым крысам (Исследование биосовместимости матриц на основе поликапролактона и гидроксиапатита в условиях in vivo / А.Н. Иванов, M.Н. Козадаев, Н.В. Богомолова, О.В. Матвеева, Д.М. Пучиньян, И.А. Норкин, Ю.Е. Сальковский, Г.П. Любунь // Цитология. 2015. Т. 57, № 4. С. 286-293).

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ динамической оценки биосовместимости скаффолдов, включающий подкожную имплантацию в межлопаточную область крысы скаффолда и проведение инструментального исследования, отличающийся тем, что перед имплантацией скаффолда крысе в качестве инструментального исследования проводят лазерную допплеровскую флоуметрию микрокровотока (ЛДФ), определяя показатель перфузии и, используя спектральный вейвлет-анализ, нормированные амплитуды эндотелиальных, нейрогенных и миогенных колебаний микрокровотока, принимая полученные результаты за исходный уровень; имплантируют скаффолд в форме диска диаметром порядка 15 мм, толщиной порядка 0,1 мм; затем трехкратно на 7, 14, 21 сутки после имплантации проводят ЛДФ микрокровотока кожи над областью имплантации с определением указанных показателей; анализируют полученные результаты, сравнивая их с показателями исходного уровня; скаффолд считают биосовместимым, если повышение показателя перфузии сопровождается сдвигом нормированных амплитуд нейрогенных и миогенных колебаний кровотока на 7-е сутки после имплантации и показатели нормированных амплитуд полностью нормализуются к 14-м суткам, а полное восстановление показателя перфузии наблюдается к 21-м суткам после имплантации [патент RU на изобретение №2571232]. Данный способ основан на оценке функциональных вазомоторных реакций микроциркуляторного русла перифокальной зоны и позволяет количественно оценить биосовместимость скаффолдов не ранее через 14 суток после имплантации. Способ не позволяет судить о формировании сосудистого русла в матрице, а также достоверно оценить биосовместимость в первые две недели после имплантации.

Задачей заявляемого изобретения является уменьшение сроков количественной оценки биосовместимости скаффолда с тканями организма, а также снижение трудоемкости при оценке васкуляризации биодеградируемых скаффолдов.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в способе оценки биосовместимости скаффолдов, включающем имплантацию скаффолда в форме диска под кожу крысам, через 7 суток после имплантации под наркозом выполняют забор крови в объеме 3-5 мл, кровь центрифугируют для получения сыворотки, в которой определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов-А (VEGF) и синдекана-1, рассчитывают их соотношение, для нормировки величины соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 ее умножают на поправочный коэффициент К, определяемый как соотношение медианного значения концентраций синдекана-1 и VEGF у интактных животных, если нормированная величина соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 не превышает 2, то у скаффолда биосовместимость отсутствует.

Технический результат заявляемого способа.

Проведение оценки биосовмесимости с помощью заявляемого способа, не требует приготовления морфологических препаратов и кратных функциональных тестов, что позволяет добиться сокращения сроков исследования до 7 суток и снизить трудоемкость.

Заявляемый способ позволяет количественно охарактеризовать интенсивность структурного ремоделирование микроциркуляторного русла с высокой точностью для оценки биосовместимости на ранних сроках подкожного имплантационного теста.

Нормирование результатов измерения концентраций маркеров ангиогенного потенциала посредством поправочного коэффициента позволяет добиться универсальности данного метода с возможностью использования реагентов различных производителей, а также разных линий животных. Сохранение дублей аликвот сыворотки в условиях морозильной камеры дополнительно обеспечивает возможность контроля воспроизводимости и точности результатов биохимических исследований при использовании различных реагентов, пород белых крыс, а также изучаемых скаффолдов.

Заявляемое изобретение поясняется с помощью Фиг. 1-2, на которых изображено: на Фиг. 1 – Препарат зоны имплантации скаффолда, содержащего чужеродный белок, у крысы № 187, выведенной из эксперимента на 7-е сутки, окраска гематоксилином и эозином: А – Объектив 5х, Б – Объектив 63х;

на Фиг. 2 –Препарат зоны имплантации скаффолда, минерализованного ватеритом, у крысы № 172, выведенной из эксперимента на 7-е сутки, окраска гематоксилином и эозином: А – Объектив 5х, Б – Объектив 63х.

Способ оценки биосовместимости скаффолдов используют следующим образом.

Белым крысам выполняют имплантацию скаффолда в форме диска под кожу крысам. Согласно действующему стандарту ГОСТ ISO 10993-6—2011 скаффолд имплантируют в виде дисков (пластин) диаметром от 10 до 12 мм и толщиной от 0,3 до 1 мм. Через 7 суток после имплантации под наркозом выполняют забор крови в объеме 3-5 мл в пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем путем пункции правых отделов сердца; кровь центрифугируют для получения сыворотки (возможно хранение аликвот сыворотки крови при температуре -20 С). Определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов-А (VEGF) и синдекана-1 методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов видоспецифических реагентов на микропланшентном спектрфотометре. Рассчитывают соотношение концентраций VEGF и синдекана-1. Для нормировки величины соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 ее умножают на поправочный коэффициент К, определяемый как соотношение медианного значения концентраций синдекана-1 и VEGF у интактных животных. Если нормированная величина соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 не превышает 2, то у скаффолда биосовместимость отсутствует.

Пример 1

Заявляемый способ был апробирован при оценки биосовместимости скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита на 24 лабораторных белых крысах-самцах массой 200-250 г. Животные были разделены на 3 равные группы: 1-я группа включала интактных крыс, 2-я группа – крысы, которым проводилась имплантация в рану скаффолда на основе поликапролактона с адсорбированным на нем чужеродным белком (отрицательный контроль – скаффолд, не обладающий биосовместимостью), 3-я группа –крысы, которым проводилась подкожная имплантация скаффолда из поликапролактона и ватерита. Забор крови у крыс 2-й и 8 крыс 3-й групп осуществлялся на 7-й день эксперимента. Морфологическая верификация биосовместимости скаффолдов выполнялась путем исследовался гистологического материала, забранный у белых крыс, которые выводились из эксперимента непосредственно после забора крови на 7-й день эксперимента.

При проведении экспериментов на животных соблюдались этические принципы в соответствии с Женевской конвенцией (Geneva, 1990). Всем животным за 5 минут до проведения манипуляций вводилась внутримышечно комбинация золетила («Virbac Sante Animale», Франция) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг для достижения наркоза.

Во второй и третьей группах белым крысам в межлопаточной области (в области холки) проводилась подкожная имплантация скаффолда в форме диска диаметром 10 мм, толщиной 1 мм.

Кровь забирали в объеме 3-5 мл в пробирки Vacuettе с активатором свертывания и разделительным гелем. Сыворотку крови получали путем центрифугирования 3000 об/мин. Аликвоты сыворотки крови замораживали и хранили при температуре -20 0С.

Для оценки механизмов регуляции ангиогенеза проводилось определение концентрации VEGF в сыворотке крови экспериментальных животных методом ИФА с использованием набора реактивов Rat VEGF Immunoassay (R&D Systems, США). Для оценки стабильности микрососудистого русла оценивали концентрацию фрагментов гликокаликса эндотелиальных клеток – растворимых форм синдекана-1 в сыворотке крови методом ИФА с использованием наборов реагентов «ELISA Kit For Syndecan 1 Rat» (Cloud-Clone Corp., США). ИФА реализован в точном соответствии с инструкциями производителей реагентов на микропланшентном спектрфотометре Anthos 2020 (Biochrom, Великобритания).

При использовании наборов реагентов Rat VEGF Immunoassay (R&D Systems, США) и ELISA Kit For Syndecan 1 Rat (Cloud-Clone Corp., США) концентрация в сыворотке крови VEGF у 8 интактных животных составила 9,4 (7,3;15,7) пг/мл, а концентрация синдекана-1 1,11 (0,82;1,51). Поправочный коэффициент определен как частное от деления медиан концентраций синдекана-1 и VEGF в сыворотке крови: К=1,11/9,4=0,12

Для верификации использовались морфологические методы оценки состояния мягких тканей области имплантации на 7-е сутки. После выведения животных из эксперимента путем передозировки препаратов для наркоза забирали материал для морфологического исследования. Для этого скаффолд с окружающими тканями извлекали единым блоком. Материал для исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах. После чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли среду Bio-Monht («BioOptica», Италия).

Препараты исследовали при помощи микроскопа AxioImager Z2 (CarlZeiss, Германия) и микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «ЛОМО ФО-ТОНИКА», Россия). На гистологических препаратах выявляли локальные признаки воспалительной реакции: отек, гиперемия, инфильтрация скаффолда иммунокомпетентными клетками.

Статистическую обработку данных осуществляли средствами программ MS Excel 2013 и Statistica 10.0. Большинство полученных данных имели распределение отличное от нормального, поэтому при статистической обработке вычислялись медианна, верхний и нижний квартили, а для сравнения групп использовали U-критерий Мана-Уитни, на основании которого рассчитывался показатель достоверности р. Различия считали значимыми при р < 0,05.

У крыс группы отрицательного контроля на 7-е сутки после имплантации матриц, не обладающих биосовместимостью, концентрации VEGF в сыворотке крови в 3,3 раза выше, чем у интактных животных группы контроля (табл.). При этом на 7-е сутки эксперимента у крыс группы отрицательного контроля в два раза по сравнению с контролем увеличена концентрация в сыворотке крови синдекана-1, что свидетельствует о его интенсивном отщеплении с поверхности эндотелиальных клеток.

На 7-е сутки эксперимента у животных группы отрицательного контроля соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 варьирует от 7,77 до 16,73 составляя в среднем 12,5 (10,7;15), что статистически значимо превышает значения контроля. Нормированная величина данного соотношения у животных группы отрицательного контроля изменялась в пределах от 0,93 до 2,0 составляя в среднем 1,5 (1,3;1,8), что также значимо выше, чем у крыс контрольной группы.

У животных опытной группы на 7-е сутки после имплантации скаффолдов из поликапролактона и ватерита концентрация VEGF в сыворотке крови значимо выше, чем у крыс групп контроля и отрицательного контроля в 5,3 и 1,6 раза соответственно. При этом в отличие от животных группы отрицательного контроля у крыс опытной группы не отмечается значимого увеличения концентрации синдекана-1 в сыворотке крови, что свидетельствует об отсутствии признаков повреждения гликокаликса эндотелиоцитов.

На 7-е сутки эксперимента у животных опытной группы соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 варьирует от 20,1 до 57,5 составляя в среднем 30,1 (24,9; 55,8), что статистически значимо превышает как значения контроля, так и отрицательного контроля. Нормированная величина данного соотношения у животных опытной группы варьировала от 2,41 до 6,9 составляя в среднем 3,6 (3;6,7), что также значимо выше, чем у крыс контрольной группы и группы отрицательного контроля.

Таблица – Концентрация VEGF и Синдекана-1 в сыворотке крови у экспериментальных животных на 7-е сутки после имплантации матриц с чужеродным белком в сравнении с интактными крысами группы контроля

Примечание – в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. р1- по сравнению с животными группы контроля; р2 – по сравнению животными группы отрицательного контроля.

Таким образом, было подтверждено, что величина соотношения концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-11 до 16,73 и его нормированная величина до 2,0 характерны при имплантации под кожу крысам матриц с чужеродным белком, не обладающих биосовместимостью. При имплантация скаффолдов из поликапролактона и ватерита соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 выше 16,73 и его нормированная величина выше 2, что свидетельствует о биосовместимости матриц данного типа.

Пример 2

Животному № 187 (крыса-самец, масса 320 г.) под кожу был имплантирован скаффолд, содержащий чужеродный белок. Через 7 суток, проведен забор крови, и животное было выведено из эксперимента передозировкой препаратов для наркоза. После вывода из эксперимента произведен забор тканей области имплантации, включая скаффолд, единым блоком, для приготовления по стандартной методике гистологического препарата, окрашенного гематоксилином и эозином.

С помощью иммуноферментного анализа выполнено определение концентраций VEGF и синдекана-1 в сыворотке крови. Концентрация VEGF составила 26,1 пг/мл, синдекана-1 – 1,89 нг/мл. Соотношение концентраций VEGF и синдекана-1 равно 13,81. Нормированное по контролю соотношение концентраций VEGF и синдекана-1 определено 13,81х0,12=1,66.

При гистологическом исследовании тканей зоны имплантации скаффолда, содержащего чужеродный белок, обнаружены отек подкожной жировой клетчатки, полнокровие сосудов артериального и венозного русла (Фиг. 1. А). Скаффолд не васкуляризован, инфильтрирован лейкоцитами, преимущественно нейтрофилами, заселение клетками соединительной ткани не выражено (Фиг. 1. Б). По периферии скаффолда располагаются многочисленные гигантские многоядерные клетки инородных тел.

Таким образом, соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 равное 13,81 и его нормированная величина 1,66 у животного № 187 соответствуют развитию на 7-е сутки эксперимента воспалительных изменений в зоне имплантации, включая гиперемию, отек и инфильтрацию лейкоцитами матрицы без заселения элементами соединительной ткани, которые отражают отсутствие биосовместимости скаффолда, содержащего чужеродный белок.

Пример 3

Животному № 172 (крыса-самец, масса 300 г.) под кожу был имплантирован скаффолд, минерализованный ватеритом. Через 7 суток, проведен забор крови, и животное было выведено из эксперимента передозировкой препаратов для наркоза. После вывода из эксперимента произведен забор тканей области имплантации, включая скаффолд, единым блоком, для приготовления по стандартной методике гистологического препарата, окрашенного гематоксилином и эозином.

С помощью иммуноферментного анализа выполнено определение концентраций VEGF и синдекана-1 в сыворотке крови. Концентрация VEGF составила 32,34 пг/мл, синдекана-1 – 1,12 нг/мл. Соотношение концентраций VEGF и синдекана-1 равно 28,88. Нормированное по контролю соотношение концентраций VEGF и синдекана-1 определено 28,88х0,12=3,46.

При гистологическом исследовании тканей зоны имплантации скаффолда, минерализованного ватеритом, обнаружены отек подкожной жировой клетчатки, умеренное кровенаполнение сосудов артериального и венозного русла (Фиг. 2. А). Скаффолд не васкуляризован, его периферическая часть заселена фибробластами, центральная часть не заселена (Фиг. 2. Б). Инфильтрация скаффолда лейкоцитами не выражена, в отдельных полях зрения обнаруживаются единичные лимфоциты и макрофаги (сидерофаги, гигантские многоядерные клетки инородных тел).

Таким образом, соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 равное 28,88 и его нормированная величина 3,46 у животного № 172 соответствуют частичному заселению периферии скаффолда фибробластическими элементами на фоне слабовыраженных воспалительных изменений, что свидетельствует в пользу биосовместимости матрицы и характеризует начальный этап ее интеграции в ткани. Как соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1, так и его нормированная величина у животного №172 превышают таковые значения у крысы № 187, что свидетельствует о прямой взаимосвязи этих показателей с биосовместимостью матриц.