БЕЛКИ И БЕЛКОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ С ПОВЫШЕННОЙ ГИДРОФОБНОСТЬЮ

Отсылки к родственным заявкам

Данная заявка претендует на преимущество приоритета в отношении следующих заявок: предварительной заявки на патент США № 62/086 294, представленной 2 декабря 2014 г.; заявки на патент США № 14/954 591, озаглавленной “Белки и белковые конъюгаты с повышенной гидрофобностью», представленной 30 ноября 2015 г. и заявки на патент США № 14/954 701, озаглавленной “Белки и белковые конъюгаты с повышенной гидрофобностью», представленной 30 ноября 2015 г. Содержание этих заявок во всех отношениях включено в настоящий документ путем отсылки.

Уровень техники

Обеспечение попадания лекарственного вещества, гормона, белка или иного активного в медицинском смысле агента в организм пациента сталкивается с рядом проблем. Медицинский активный агент должен попасть в организм пациента. Для этого существуют два пути: пероральный (проглатывание) и парентеральный (введение путем инъекции). В первом случае лекарственное вещество прежде чем оказаться в кровотоке или в подлежащем воздействию участке организма пациента должно пройти через его пищеварительный тракт. Введение медицинского активного агента путем инъекции позволяет ему попасть в кровоток или нужный участок организма быстро или напрямую, однако инъекции сами по себе могут оказаться неприемлемыми или чересчур болезненными для данного больного. Когда медицинский активный агент оказывается в организме пациента, его концентрация с течением времени может изменяться в зависимости от природы данного агента, присоединения к нему различных других веществ или функциональных групп, инкапсулирования внутри каких-либо структур или иных факторов. Если концентрация медицинского активного агента падает ниже некоторого порогового значения, его нужно вводить в организм снова. Многие медицинские активные агенты приходится вводить пациенту часто, например, несколько раз в сутки. При режиме введения, предполагающем частые инъекции, возрастает дискомфортность процедуры для пациента, снижается степень выполнения больным предписаний врача, так что в итоге эффект лечения становится меньше оптимального. Когда медицинский активный агент вводится путем инъекций, каждый последующий укол увеличивает степень болезненных ощущений пациента, повышает риск занесения инфекции и вероятность иммунного ответа в организме больного. Таким образом, существует настоятельная потребность в медицинских активных агентах, отличающихся концентрационным профилем, адекватным их назначению. Описанные в настоящем документе способы и композиции дают решение указанным проблемам.

Краткое изложение сущности изобретения

Медицинский активный агент может быть присоединен к алифатической цепи, к полиэтиленгликолю (PEG), к гидрофобному аниону или к иной структуре. В случае присоединения полиэтиленгликоля увеличивается молекулярная масса медицинского агента или же увеличивается его время полужизни. Также в случае присоединения полиэтиленгликоля, включая низкомолекулярные его варианты, или к гидрофобному аниону может увеличиться гидрофобность медицинского активного агента и он может стать амфифильным. Возможно, что медицинский активный агент будет лучше растворяться в органических растворителях с биоразлагаемыми полимерами. В присутствии таких полимеров медицинский активный агент может быть заключен в полимерную микросферу (инкапсулирован). Инкапсулирование медицинского активного агента продлевает его время полужизни. В описанных в настоящем документе композициях медицинский активный агент может высвобождаться медленно и равномерно на протяжении некоторого промежутка времени. Профиль высвобождения активного агента может быть таким, что на протяжении предполагаемого периода лечения обеспечивается постоянный, без всплесков уровень белка даже без необходимости в каких-либо вспомогательных компонентах. В результате концентрационный профиль медицинского активного агента в организме пациента может обеспечить более оптимальный клинический результат. Препараты, описанные в настоящем документе, можно вводить пациенту нечасто, например один раз в месяц. Процесс изготовления таких препаратов может быть эффективным, с высоким выходом и относительно недорогим.

Примеры по данному изобретению включают способ получения конъюгатов белков с полиэтиленгликолем в форме соли, обладающих повышенной гидрофобностью. Этот способ может включать создание водного белкового раствора, который включает собственно белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН среды. Этот способ может также включать взаимодействие полиэтиленгликоля c белком, в результате чего образуется конъюгат белка и полиэтиленгликоля. Этот способ может также включать протонирование аминогрупп в конъюгате белка и полиэтиленгликоля за счет гидрофобной органической кислоты. Такое протонирование может происходить в органической фазе. В результате протонирования может образовываться соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, в которой имеется гидрофобный анион, так что гидрофобность конъюгата белок-политиленгликоль увеличивается.

Примеры по данному изобретению включают способ получения конъюгатов белок-полиэтиленгликоль с повышенной гидрофобностью. Этот способ включает получение водного белкового раствор, в состав которого входят белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН. Этот способ также включает взаимодействие полиэтиленгликоля с белком, в результате чего образуется конъюгат белок-полиэтиленгликоль. Конъюгат белок-полиэтиленгликоль может обладать более высокой гидрофобностью, чем данный белок в отдельности.

Примеры по данному изобретению включают способ получения соли белка с повышенной гидрофобностью. Этот способ включает получение водного белкового раствор, в состав которого входят белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН. Этот способ также включает протонирование по меньшей мере одной аминогруппы в белке за счет гидрофобной органической кислоты. В результате такого протонирования образуется соль белка, в которой имеется гидрофобный анион, так что гидрофобность соли белка увеличивается.

В примерах по данному изобретению способ получения микросфер, обеспечивающих контролируемое высвобождение активного агента и содержащих соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, включает получение водного белкового раствора. Этот водный белковый раствор включает белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН среды. Этот способ также включает взаимодействие полиэтиленгликоля с белком, в результате чего образуется конъюгат белок-полиэтиленгликоль. Кроме того, этот способ включает протонирование аминогрупп в конъюгате белок-полиэтиленгликоль за счет гидрофобной органической кислоты. В результате такого протонирования образуется соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, в которой имеется гидрофобный анион. Также этот способ включает смешивание соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль в органическом растворителе с биоразлагаемым полимером. Благодаря гидрофобному аниону в составе соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль может увеличиваться растворимость этой соли в органическом растворителе. Этот способ также включает эмульгирование смеси соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль с биоразлагаемым полимером в водном растворе. Кроме того, этот метод также включает отверждение эмульгированной смеси соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера, с образованием микросфер, обеспечивающих контролируемое высвобождение нужного агента.

Примеры по данному изобретению включают микросферы. Композиция по данному изобретению включает биоразлагаемый полимер. Также микросферы по данному изобретению включают белковую смесь, выбираемую из группы, состоящей из: конъюгата белок-полиэтиленгликоль; конъюгата белок-полиэтиленгликоль и гидрофобного аниона органической кислоты; белка и гидрофобного аниона органической кислоты; их комбинаций.

Примеры по данному изобретению также включают композицию, содержащую биоразлагаемый полимер, органический растворитель и белковую смесь. Эта белковая смесь может включать белок, конъюгат белок-полиэтиленгликоль, гидрофобный анион органической кислоты или их комбинации. Указанная композиция может быть в виде раствора или суспензии.

В пример по данному изобретению предлагаемые способы могут включать получение раствора или суспензии биоразлагаемого полимера и соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Эти способы могут включать получение конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Конъюгат белок-полиэтиленгликоль по данному изобретению может не содержать соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Способы по данному изобретению могут также включать смешивание биоразлагаемого полимера, конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Эти способы могут включать получение конъюгата белок-полиэтиленгликоль, гидрофобной органической кислоты и органического растворителя. Способы по данному изобретению могут включать образование соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль, в состав которой входят конъюгат белок-полиэтиленгликоль и анион гидрофобной органической кислоты. Кроме того, способы по данному изобретению могут включать перемешивание указанной смеси для образования раствора или суспензии.

Некоторые примеры по данному изобретению включают способы получения раствора или суспензии биоразлагаемого полимера и соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль могут включать растворение биоразлагаемого полимера в органическом растворителе для образования смеси. Эти способы также могут включать прибавление к образовавшейся смеси конъюгата белок-полиэтиленгликоль и гидрофобной органической кислоты. Эти способы могут включать еще протонирование аминогрупп в конъюгате белок-полиэтиленгликоль за счет гидрофобной органической кислоты. В результате такого протонирования образуется соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, в состав которой входит гидрофобный анион. Также эти способы могут включать перемешивание указанной смеси для образования раствора или суспензии.

Примеры, описанные в настоящем документе, обеспечивают превосходный концентрационный профиль. После присоединения полиэтиленгликоля и инкапсулирования белок может сохранять свою активность. Высвобождение белка in vitro, in vivo и/или in situ может происходить с небольшим первоначальным «залпом». Изменение концентрации активного агента при его высвобождении может характеризоваться кинетикой реакции почти нулевого порядка, то есть концентрация высвобождаемого медицинского активного агента очень мало изменяется с течением времени или в зависимости от его концентрации в микросферах. Будучи введен пациенту, белок по данному изобретению может практически полностью высвобождаться из микросфер.

Краткое описание чертежей

В настоящем документе технология по данному изобретению описывается в сочетании с прилагаемыми иллюстрациями.

Фиг. 1 представляет блок-схему способа получения соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль с повышенной гидрофобностью по примерам данного изобретения.

Фиг. 2 представляет блок-схему способа получения конъюгата белок-полиэтиленгликоль по примерам данного изобретения.

Фиг. 3 представляет блок-схему способа получения соли белка с повышенной гидрофобностью по примерам данного изобретения.

Фиг. 4 представляет блок-схему способа получения микросфер, обеспечивающих контролируемое высвобождение активного агента, содержащих соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, по примерам данного изобретения.

Фиг. 5 представляет блок-схему способа получения раствора или суспензии биоразлагаемого полимера и соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль по примерам данного изобретения.

Фиг. 6 представляет блок-схему способа получения раствора или суспензии биоразлагаемого полимера и соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль по примерам данного изобретения.

Фиг. 7A и 7B представляют микрофотографии, полученные с помощью светового микроскопа, микросфер из PLGA, содержащих медицинские активные агенты.

Фиг. 8 представляет график, иллюстрирующий результаты изучения контролируемого высвобождения активного агента из микросфер по примерам данного изобретения.

Фиг. 9 представляет график, иллюстрирующий результаты изучения контролируемого высвобождения активного агента из микросфер по примерам данного изобретения.

Фиг. 10 представляет результаты фармакокинетического анализа GLP-1 в образцах плазмы крови крыс после введения микросфер по примерам данного изобретения.

Фиг. 11 представляет результаты фармакокинетического анализа инсулина в образцах плазмы крови крыс после введения микросфер по примерам данного изобретения.

Осуществление изобретения

Медицинские активные агенты, во введении которых может нуждаться пациент, включают лекарства, гормоны и белки. Одним из таких белков является человеческий гормон роста (hGH), которые представляет собой полипептид из 191 аминокислотного остатка, усиливающий клеточный рост и регенерацию. Человеческий гормон роста можно использовать для лечения расстройств и состояний недостаточности, связанных с ростом. Например, этот гормон можно использовать для лечения малого роста у детей и состояний недостаточности hGH у взрослых. Обычно человеческий гормон роста вводят нуждающемуся в том пациенту путем ежедневных подкожных инъекций. В одном исследовании (Rosenfeld R.G., Bakker B. 2008. Compliance and persistence in pediatric and adult patients receiving growth hormone therapy. Endocr. Pract. 14(2):143-154) было показано, что отношение больных к лечению гормоном роста (соблюдают ли они назначенный врачами режим лечения или нет) в большинстве случаев лишь случайно.

В качестве медицинского активного агента может также служить другой белок – глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1). Этот пептид, состоящий из 31 аминокислотного остатка, является одним из инкретинов: он снижает уровень глюкозы в крови. Влияние GLP-1на уровень глюкозы в крови осуществляется путем стимулирования высвобождения инсулина и подавления высвобождения глюкагона. Также этот пептид может снижать скорость всасывания питательных веществ в кровоток, замедляя опорожнение желудка, и сокращать потребление пищи. Благодаря своей способности влиять на уровень глюкозы в крови GLP-1 в принципе может служить для лечения диабета типа 2 и некоторых других расстройств. Интактный глюкагоноподобный пептид 1 обладает временем полужизни in vivo менее двух минут вследствие протеолиза. Лечение с использованием агонистов рецептора GLP-1 можно усовершенствовать, если свести к минимуму побочные явления, добиться большей действенности и увеличить продолжительность желаемого эффекта.

Обычное лечение диабета и других состояний может приводить к побочным эффектам. Эти побочные эффекты включают гипогликемию, увеличение массы тела, иммунологические реакции, воспаление поджелудочной железы, повышение вероятности рака щитовидной железы, тошноту или боли, связанные с инъекциями, совершаемыми в ходе лечения. Кроме того, обычное лечение указанных расстройств может не достигать желаемого уровня гликемии у больных диабетом. При использовании некоторых препаратов возможно неравномерное введение нужного белка в организм пациента, включая первоначальный всплеск концентрации лекарственного вещества. При получении пригодного для введения в человеческий организм препарата возможна денатурация или агрегация белка. Процесс изготовления эффективных препаратов может оказаться дорогостоящим или иметь низкий выход продукта.

Подобно гормону роста и глюкагоноподобному пептиду 1 препарат энфувиртид (Fuzeon®) является медицинским активным агентом, с введением которого больным связаны определенные проблемы. Энфувиртид может способствовать лечению инфекции вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ, или HIV) и синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИДа, или AIDS). Это препарат нужно вводить два раза в сутки путем подкожной инъекции. Эти инъекции могут вызывать в коже побочные эффекты, связанные с реакцией чувствительности, из-за которых пациент может не желать продолжения применения данного препарата. Для того чтобы пациент соблюдал режим лечения, стоимость лечения снизилась и качество жизни больного повысилось (в случае ВИЧ-инфекции и СПИДа), может понадобиться проведение лечения энфувиртидом по схемам с менее частыми введениями иди более продолжительным курсом.

Еще один медицинский активный агент - гормон околощитовидной железы (PTH) или его фрагмент. Гормон околощитовидной железы является анаболическим (способствует образованию костной ткани). Он секретируется околощитовидными железами в виде полипептида, состоящего из 84 аминокислотных остатков, с молекулярной массой 9425 дальтон. Первые 34 аминокислотных остатка являются биологически активным элементом в отношении минерального гомеостаза. Препарат под названием терипаратид (Forteo®, производство Lilly) представляет собой синтетический укороченный вариант PTH. Гормон околощитовидной железы или его фрагмент можно использовать для лечения остеопороза. Нередко терипаратид, который стоит дорого и вводится путем ежедневных инъекций, назначают лишь после других лечебных средств. Как и в случае других медицинских активных агентов может оказаться желательной такая схема лечения гормоном околощитовидной железы, которая предполагает менее частое введение и более продолжительный курс.

Не измененные белки зачастую не обладают желаемым концентрационным профилем или иными нужными свойствами. Введению в организм пептидов и белков может способствовать их ПЭГилирование, как называют присоединение полиэтиленгликоля к белковой/пептидной молекуле, в результате чего могут улучшиться фармакологические свойства белка/пептида и увеличиться эффективность лечебного воздействия. Полиэтиленгликоль – это линейный полимер, состоящий из этиленгликолевых субъединиц; он растворим как в воде, так и во многих органических растворителях. Полиэтиленгликоль представляет собой гибкое вещество, способное к биологической деградации и не токсичное. В силу свойств полиэтиленгликоля ПЭГилирование может продлевать время полужизни и/или повышать растворимость белка или пептида. Полиэтиленгликоль может быть присоединен к метокси-группе. Полиэтиленгликоль может быть представлен альдегидом, в том числе метоксиполиэтиленгликольальдегидом.

На концентрационный профиль медицинского активного агента можно повлиять также иначе – путем инкапсулирования его в биоразлагаемый материал. По мере распада такого материала медицинский активный агент будет постепенно высвобождаться. При инкапсулировании медицинского активного агента может потребоваться использование органического растворителя. Медицинский активный агент может быть гидрофильным и не растворимым в органических растворителях. Чтобы облегчить инкапсулирование, можно увеличить гидрофобность медицинского активного агента.

Чтобы увеличить гидрофобность медицинского активного агента, его можно ПЭГилировать. Однако в результате ПЭГилирования не у всех медицинских активных агентов возрастает растворимость и сохраняется изначальная биологическая активность. Например, для увеличения растворимости белка присоединения небольших молекул полиэтиленгликоля может оказаться недостаточно. Присоединение более длинных молекул полиэтиленгликоля может в итоге привести к увеличению гидрофобности и растворимости данного белка, но эти более длинные цепи могут оказаться чересчур большими относительно размеров белковой молекулы и ухудшить биологическую активность белка. Например, чем больше ПЭГилирован человеческий гормон роста, тем меньше его сродство к соответствующему рецептору (см. Clark R. et al. 1996. Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol. J. Biol. Chem. 217: 21969-21977). А ПЭГилирование альфа-интерферона (IFN-α) может приводить к снижению удельной активности белка in vitro в зависимости от места присоединения полиэтиленгликоля к белковой молекуле и от размеров молекулы полиэтиленгликоля (см. Grace M.J. et al. 2005. Site of pegylation and polyethylene glycol molecule size attenuate interferon-alpha antiviral and antiproliferative activities through the JAK/STAT signaling pathway. J. Biol. Chem. 280: 6327-6336). Кроме того, в результате ПЭГилирования не обязательно возрастает растворимость белка. Например, конъюгат инсулина с небольшими молекулами полиэтиленгликоля (молекулярной массой 2000 дальтон) не растворяется желаемым образом в органических растворителях. Другой пример: обнаружено, что из-за ПЭГилирования колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF) усиливается агрегация G-CSF и снижается его растворимость (см. Veronese F. M. et al. 2007. Site-specific pegylation of G-CSF by reversible denaturation. Bioconjug. Chem. 18(6): 1824-30).

Гидрофобность медицинского активного агента можно увеличить путем присоединения гидрофобного иона к молекуле этого вещества. Как и в случае ПЭГилирования, в результате присоединения гидрофобного аниона возрастет гидрофобность не всякого медицинского активного агента. Так, в белке может не иметься или иметься недостаточно положительно заряженных мест для связывания гидрофобного аниона. Тогда количество анионов, присоединяющихся к белковой молекуле, и возрастание ее гидрофобности буде ограничено. Например, в «кислых» белках – скажем, в сывороточном альбумине - содержание кислотных аминокислотных остатков превышает содержание основных аминокислотных остатков. Такие белки затруднительно протонировать при помощи гидрофобных кислот.

Сочетание ПЭГилирования с присоединением гидрофобного иона к медицинскому активному агенту может давать синергический эффект, то есть гидрофобность данного агента увеличится больше при этой комбинации, нежели можно ожидать от просто суммарного – в результате ПЭГилирования самого по себе и в результате присоединения гидрофобного иона самого по себе - возрастания гидрофобности. Эффект от применения белка у больного может быть превосходным, если этот белок превращен в соль конъюгата данного белка и полиэтиленгликоля.

Как показано на фиг. 1, примеры технологии по данному изобретению включают способ 100 получения соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль с повышенной гидрофобностью. Этот способ включает получение водного белкового раствора 102. Этот водный белковый раствор содержит нужный белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН среды. В состав этого буферного раствора может входить неорганическая соль фосфорной кислоты.

Белок, используемый по данному изобретению, имеет молекулярную массу 3000 дальтон (Да) или больше, в диапазоне 3000-10 000 Да; 10 000 Да или больше, в диапазоне 10 000-15 000 Да; 15 000 Да или больше, в диапазоне 15 000-20 000 Да либо 20 000 Да или больше в зависимости от конкретного примера. В этих и других примерах взятый белок содержит 30 аминокислотных остатков или больше, в диапазоне 30-100 аминокислотных остатков; 100 аминокислотных остатков или больше, в диапазоне 100-150 аминокислотных остатков либо 150 аминокислотных остатков или больше. Белки, которые можно использовать в примерах по данному изобретению, включают человеческий гормон роста, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1), инсулин, гормон околощитовидной железы, фрагмент гормона околощитовидной железы, энфувиртид (Fuzeon®) или октреотид (Sandostatin®). В случае GLP-1 может использоваться пептид, выделенный из природного источника, или же синтетический. Возможно использование аналогов или производных GLP-1. Комбинация белков может входить в состав водного раствора. Например, в водном растворе могут содержаться как GLP-1, так и инсулин.

Способ 100 включает взаимодействие полиэтиленгликоля и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль 104. В результате взаимодействия полиэтиленгликоля и белка может образоваться конъюгат белок-полиэтиленгликоль, в котором полиэтиленгликоль присоединен к N-концу белковой молекулы.

В результате взаимодействия полиэтиленгликоля и белка может образоваться конъюгат белок-полиэтиленгликоль, в котором молекулы полиэтиленгликоля присоединены в определенных местах белковой молекулы, а именно к определенным остаткам цистеина, или же указанное взаимодействие не приводит к образованию конъюгата белок-полиэтиленгликоль, в котором молекулы полиэтиленгликоля присоединены в определенных местах белковой молекулы, а именно к определенным остаткам цистеина, или таких конъюгатов образуется ничтожно мало. Взаимодействие белок-полиэтиленгликоль может включать образование по меньшей мере одной связи с участием аминогруппы, амидной связи, эфирной связи или дисульфидного мостика между молекулами полиэтиленгликоля и белка. Взаимодействие полиэтиленгликоля и белка может не включать образование каких бы то ни было связей или групп связей. Связи с белковой молекулой могут образовываться с участием реакционноспособных групп на конце полимерной цепи полиэтиленгликоля.

Взаимодействие полиэтиленгликоля с белком может включать присоединение молекулы полиэтиленгликоля, способной реагировать с тиоловой группой, к остатку цистеина белка. Полиэтиленгликоли, способные реагировать с тиоловой группой, включают различные реакционноспособные группы, в том числе малеимидную и винилсульфоновую группы. Полиэтиленгликоли, способные к взаимодействию с тиоловой группой, обладают молекулярной массой от 2 до 4 кДа. Реакции ПЭГилирования с участием полиэтиленгликолей, способных взаимодействовать с тиоловой группой, могут протекать при нейтральном рН. В некоторых белках остатки цистеина могут образовывать дисульфидные мостики, и тогда они не доступны для получения производных соединений. Применяя метод сайт-направленного мутагенеза in vitro, можно ввести дополнительные остатки цистеина в определенные места белковой молекулы. Эти дополнительные остатки цистеина могут служить местами присоединения молекул полиэтиленгликоля. Использование дополнительных остатков цистеина позволяет избежать гетерогенности продукта и потери активности, которые могут быть следствием случайного взаимодействия аминогрупп при ПЭГилировании.

В этих и других примерах используемый по данному изобретению полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу 5000 дальтон или меньше, либо 2000 дальтон или меньше. При использовании более крупных молекул полиэтиленгликоля может увеличиться время полужизни белка. При использовании более мелких молекул полиэтиленгликоля может увеличиться растворимость конъюгата белок-полиэтиленгликоль, но время полужизни не будет продолжительным. Например, у полиэтиленгликоля с молекулярной массой 2000 дальтон время полужизни может составлять менее часа. Более мелкие молекулы полиэтиленгликоля можно использовать для увеличения растворимости конъюгата белок-полиэтиленгликоль и, кроме того, для инкапсулирования белка, что позволяет достигнуть большей части желаемого продления времени полужизни. Способ 100 может и не включать взаимодействие эфира полиэтиленгликоля с белком. Полиэтиленгликоль может быть избирателен в отношении первичных аминов, тогда как эфир полиэтиленгликоля может взаимодействовать с другими функциональными группами и аминокислотными остатками.

Способ 100 также включает протонирование аминогрупп в конъюгате белок-полиэтиленгликоль (106) за счет гидрофобной органической кислоты. Протонирование аминогруппы может осуществляться не в водной, а органической фазе. Молярное соотношение между гидрофобной органической кислотой и конъюгатом белок-полиэтиленгликоль может составлять от 1:1 до 11:1, от 1:1 до 5:1, от 5:1 до 11:1, от 1:1 до 2:1 или от 3:1 до 8:1 в зависимости от конкретного примера. В результате протонирования может образоваться соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, содержащая гидрофобный анион, что увеличивает гидрофобность конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль по данному изобретению может включать моноПЭГилированную соль. Используемые по данному изобретению гидрофобные органические кислоты включают памоевую (эмбоновую, то есть 4,4'-метилен-бис-(3-окси-2-нафталиновую) кислоту, докузат (диоктилсульфоянтарную кислоту), пирослизевую (2-фуранкарбоновую) кислоту или их смеси. Используемые по данному изобретению органические кислоты также включают карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, спирты или соединения с тиоловыми группами. Используемые по данному изобретению гидрофобные органические кислоты могут и не включать какие-либо из описанных здесь кислот или какие-либо из описанных здесь групп.

Используемые по данному изобретению гидрофобные анионы включают анионы, гидрофобных органических кислот. Например, гидрофобный анион по данному изобретению может быть анионом памоевой кислоты, докузат-ионом или анионом пирослизевой кислоты. В этих и других примерах гидрофобным анионом может служить анион жирной кислоты, фосфолипидный анион, анион полистиролсульфоновой кислоты или их смеси. Фосфолипид фосфолипидного аниона может быть фосфатидилхолином, фосфатидилглицерином, фосфатидилсерином, фосфатидилинозитом, фосфатидилэтаноламином, фосфохолином или их смесью. Используемые по данному изобретению гидрофобные анионы могут и не включать какие-либо из описанных здесь анионов или групп анионов. Гидрофобный анион может быть присоединен к определенной боковой группе в белковой молекуле или же он может быть присоединен к множеству боковых групп белка. Гидрофобный анион по данному изобретению характеризуется коэффициентом липофильности logP больше 1. Коэффициент logP – это коэффициент распределения вещества в смеси вода-октанол; он представляет собой логарифм отношения концентрации соли белка в октаноле к концентрации соли белка в воде. Если коэффициент logP больше 1, это значит, что концентрация вещества в октаноле в 10 раз больше, чем в воде Коэффициент распределения вещества между октанолом и водой используется для сравнения различных веществ по их способности включаться в гидрофобную фазу, хотя молекулы данного вещества могут быть и амфипатическими. Способы по данному изобретению также включают прибавление катионных детергентов, например додециламина гидрохлорида или цетилтриметиламмония бромида (CTAB), которые могут компенсировать электрический заряд отрицательно заряженных пептидов и тем самым увеличить их гидрофобность.

Как показано на фиг.2, примеры по данному изобретению включают способ 200 получения конъюгата белок-полиэтиленгликоль с повышенной гидрофобностью. Способ 200 включает получение водного белкового раствора 202, в состав которого могут входить белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН. Указанный здесь белок может быть любым из белков, описанных выше в настоящем документе. Указанные здесь водный белковый и буферный растворы могут быть любыми из описанных в настоящем документе водных белковых и буферных растворов.

Способ 200 также включает взаимодействие белка и полиэтиленгликоля с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль (204). В составе этого конъюгата могут быть молекулы полиэтиленгликоля с молекулярной массой любого из приведенных в настоящем документе значений. Белок в конъюгате может быть любым из описанных в настоящем документе белков. Реакция образования конъюгата белок-полиэтиленгликоль может происходить любым из описанных в настоящем документе путей. Способ 200 может не включать протонирование аминогрупп в белке за счет гидрофобной органической кислоты. Способ 200 может не приводить к образованию соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль.

Как показано на фиг. 3., примеры по данному изобретению включают способ 300 получения соли белка с повышенной гидрофобностью. Способ 300 включает получение водного белкового раствора 302, в состав которого входят белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН. Указанный здесь белок может быть отделен от воды. Способ 300 также включает протонирование аминогрупп в белке за счет гидрофобной органической кислоты 304. Протонирование аминогрупп может осуществляться в органической фазе и без присутствия воды. В результате протонирования аминогрупп может образоваться соль белка, содержащая гидрофобный анион, что увеличивает гидрофобность этой соли белка. Способ 300 не включает введение полиэтиленгликоля в водный белковый раствор. При осуществлении способа 300 не образуются конъюгат белок-полиэтиленгликоль или соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль. В качестве указанных здесь водного белкового раствора, белка, буферного раствора, гидрофобной органической кислоты и гидрофобного аниона могут служить любые из соединений, описанных выше в настоящем документе.

Как показано на фиг. 4, способ 400 получения микросфер, обеспечивающих контролируемое высвобождение активного агента, которые содержат соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, включает получение водного белкового раствора 402. Указанный водный белковый раствор включает белок и буферный раствор, обеспечивающий определенный рН. Указанный белок может быть любым из белков, описанных выше в настоящем документе. Способ 400 также включает взаимодействие белка и полиэтиленгликоля с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль (404). Образовавшийся конъюгат белок-полиэтиленгликоль может быть отделен от воды. В таком случае конъюгат белок-полиэтиленгликоль затем растворяют в органическом растворителе.

Кроме того, способ 400 включает протонирование по меньшей мере одной аминогруппы в конъюгате белок-полиэтиленгликоль за счет гидрофобной органической кислот 406. Гидрофобную органическую кислоту можно добавлять к органической фазе и не добавлять к водной фазе. Сходным образом, протонирование аминогрупп может происходить в органической фазе и без присутствия воды. В результате этого протонирования может образоваться соль конъюгата белко-полиэтиленгликоль, содержащая гидрофобный анион. В качестве гидрофобной органической кислоты может служить любая из описанных в настоящем документе кислот, а соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль может быть любой из описанных в настоящем документе солей конъюгатов.

Также способ 400 включает смешивание соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль в органическом растворителе с биоразлагаемым полимером 408. Указанный органический растворитель не смешивается с водной фазой. Органические растворители, используемые по данному изобретению, включают метиленхлорид, бензилбензоат, дихлорметан. хлороформ, этиловый эфир, этилацетат, изопропиловый эфир уксусной кислоты (изопропилацетат), втор-бутиловый эфир уксусной кислоты, ацетофенон, н-амилацетат, анилин, бензальдегид, бензол, бензофенон, бензиловый спирт, бензиламин, бромбензол, бромоформ, н-бутилацетат, метиловый эфир масляной кислоты, капроновую кислоту, дисульфид углерода, четыреххлористый углерод, орто-хлоранилин, хлорбензол, 1-хлорбутан, хлорметан, мета-хлорфенол, мета-крезол, орто-крезол, цианоэтан, цианопропан, циклогексанол, циклогексанон, 1,2-дибромэтан, дибромметан, дибутиламин, мета-дихлорбензол, орто-дихлорбензол, 1,1-дихлорэтан, 1,2-дихлорэтан, дихлорфторметан, диэтилкарбонат, диэтилмалонат, диэтилсульфид, дибутиловый эфир диэтиленгликоля, диизобутилкетон, диизопропилсульфид, диметилфталат, диметилсульфат, диметилсульфид, N,N-диметилаланин, энантовую кислоту, этилацетоацетат, этилбензоат, этилпропионат, этилбензол, монобутилового эфира этиленгликоля ацетат, оксоацетаты Exxate 600, 800 и 900, фторбензол, фуран, гексаметилфосфорамид, 1-гексанол, н-гексилацетат, изоамилолвый спирт (3-метил-1-бутанол), изобутилацетат, метоксибензол, метиламилкетон, метилбензоат, метилформиат, метилизоамилкетон, метилизобутенилкетон, метилизобутилкетон, метил-н-бутилкетон, метилпропилкетон, 4-метил-2-пентанол, N-метиланилин, нитробензол, нитроэтан, 1-нитропропан, 2-нитропропан, 1-октанол, 2-октанол, 1-пентанол, 3-пентанон, 2-фенилэтанол, н-пропилацетат, хинолин, стирол, 1,1,2,2-тетрахлорэтан, 1,1,2,2-тетрахлорэтилен, толуол, 1,1,1-трихлорэтан, 1,1,2-трихлорэтилен, 1,1,2-трихлорэтан, трифторметан, валериановую кислоту, мета-ксилол, орто-ксилол, пара-ксилол, 2,4-ксиленол или их смеси. Используемые по данному изобретению органические растворители могут не включать любой растворитель или группу растворителей.

В способах по данному изобретению может использоваться смесь растворителей. Смесь растворителей может включать растворитель, смешивающийся с водой, но сама смесь может не смешиваться с водой. Например, к не смешивающемуся с водой растворителю может быть добавлен такой смешивающийся с водой растворитель, как диметилсульфоксид (DMSO), метиловый спирт, диметилфорамид (DMF), ацетонитрил, тетрагидрофуран или их смесь.

Используемые по данному изобретению биоразлагаемые полимеры включают полиактид, полигликолид, поли(d,1-лактид-ко-гликолид), поликапролактон, поли(ортоэфир), сополимер простого полиэфира и сложного полиэфира или сополимер полилактида и полиэтиленгликоля. Используемые по данному изобретению биоразлагаемые полимеры могут не включать какие-либо из указанных здесь полимеров или групп этих полимеров. Молекулярную массу биоразлагаемого полимера по данному изобретению подбирают в зависимости от размеров молекул полиэтиленгликоля для обеспечения желаемого фармакокинетического профиля.

Поли(d,1-лактид-ко-гликолил) (PLGA), используемый в примерах по данному изобретению, имеет молекулярную массу от 5000 Да до 7000 Да, от 7000 Да до 17 000 Да, от 17 000 Да до 20 000 Да, от 20 000 Да до 24 000 Да, от 24 000 Да до 38 000 Да, от 38 000 Да до 40 000 Да или от 40 000 Да до 50 000 Да. Соотношение лактида и гликолида в PLGA может составлять 50:50 или 75:25. В некоторых примерах по данному изобретению это соотношение в PLGA составляет от 40:60 до50:50, от 50:50 до 60:40, от 60:40 до 70:30, от 70:30 до 75:25 или от 75:25 до 90:10. Соотношение лактида и гликолида в PLGA может быть меньше или равно 50:50, меньше или равно 60:40 либо меньше или равно 75:25, причем здесь слово «меньше» относится к меньшей доле лактида по сравнению с гликолидом. Наличие гидрофобного аниона органической кислоты может улучшить показатели высвобождения в случае некоторых PLGA, но в случае других таких соединений этого не наблюдается.

Используемые по данному изобретению PLGA включают PLGA 502, PLGA 503, PLGA 752 и PLGA 753. В полимере PLGA 502 соотношение лактида и гликолида составляет 50:50, его характеристическая вязкость составляет от 0,16 дo 0,24 дл/г, а молекулярная масса – от 7000 Да до 17 000 Дa. В полимере PLGA 503 соотношение лактида и гликолида составляет 50:50, его характеристическая вязкость составляет от 0,32 дo 0,44 дл/г, а молекулярная масса – от 24 000 Да до 38 000 Дa. В полимере PLGA 752 соотношение лактида и гликолида составляет 75:25, его характеристическая вязкость составляет от 0,14 дo 0,22 дл/г, а молекулярная масса – от 4000 Да до 15 000 Дa. В полимере PLGA 753 соотношение лактида и гликолида составляет 75:25, его характеристическая вязкость составляет от 0,32 дo 0,44 дл/г, а молекулярная масса – от 24 000 Да до 38 000 Дa. Также молекула полимера PLGA может иметь кислотную либо сложноэфирную концевую группу.

Наличие гидрофобного аниона в соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль может повышать ее растворимость в органических растворителях. Способ 400 включает также эмульгирование смеси соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера 410 в водном растворе. Кроме того способ 400 включает отверждение эмульгированной смеси 412 соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера с образованием микросфер, обеспечивающих контролируемое высвобождение активного агента. В состав этих микросфер может входить гидрофобный анион органической кислоты. Если органическую кислоту добавляют не в органическую фазу, а в водную, то органическая кислота и какие-либо анионы из нее могут не входить в состав микросфер или могут содержаться в них в гораздо меньшей концентрации.

В способе получения микросфер, обеспечивающих контролируемое высвобождение активного агента, может использоваться не соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, а конъюгат белок-полиэтиленгликоль или соль белка. Конъюгат белок-полиэтиленгликоль или соль белка могут быть получены любым из описанных в настоящем документе способов.

В примерах по данному изобретению могут использоваться микросферы с биоразлагаемым полимером. Диаметр этих микросфер составляет менее 1 мм. Например, диаметр этих микросфер может составлять от 10 мкм до 20 мкм, от 20 мкм до 30 мкм, от 30 мкм до 40 мкм, от 40 мкм до 50 мкм, от 50 мкм до 60 мкм, от 60 мкм до 70 мкм, от 70 мкм до 80 мкм, от 80 мкм до 90 мкм или от 90 мкм до 100 мкм. Кроме того, множество микросфер может характеризоваться распределением по диаметру, значения которого находятся в пределах указанных здесь диапазонов. Величина диаметра характеризуется средним значением, медианой (D50), 10-м процентилем (D10) или 90-м процентилем (D90) распределения. Если микросферы слишком крупные, может оказаться невозможным ввести их индивиду, подлежащему лечению по данному изобретению, путем инъекции с помощью шприца. Также при чересчур больших размерах микросфер может задерживаться высвобождение медицинского активного агента. Однако если диаметр микросфер слишком мал, то они могут теряться в процессе обработки, просеивания и/или отбора.

Микросферы по данному изобретению могут содержать конъюгат белок-полиэтиленгликоль, сам белок и гидрофобный анион органической кислоты или их смеси. Микросферы по данному изобретению могут не содержать конъюгат белок-полиэтиленгликоль или гидрофобный анион органической кислоты. Белком в составе микросфер может быть любой из описанных в настоящем документе белков. Композиция по данному изобретению может содержать комбинацию белков. Например, в состав композиции по данному изобретению могут входить глюкагоноподобный пептид 1 и инсулин. GLP-1 и инсулин могут присутствовать в микросферах как часть конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Термин «премикс» в настоящем документе относится к микросферам с комбинацией белков или конъюгатов белок-полиэтиленгликоль. Или же в примерах по данному изобретению используется постмикс. Термин «постмикс» в настоящем документе относится к смеси микросфер, в которой каждая микросфера содержит только один медицинский активный агент, но в смеси микросфер содержится комбинация медицинских активных агентов. Органическая кислота и гидрофобный анион органической кислоты в составе микросфер могут быть любыми из соединений, описанных выше в настоящем документе.

Композиция по данному изобретению может содержать биоразлагаемый полимер и быть представлена микросферами. Для получения этих микросфер вначале получают эмульсию из водного раствора и раствора, не смешивающегося с водой, и затем ее экстрагируют растворителем и высушивают. Для эмульгирования используют статические либо динамические смесители или же эмульгаторные установки с диспергирующей насадкой.

Композиции по данному изобретению, содержащие биоразлагаемый полимер, могут быть в виде раствора или суспензии в органическом растворителе. Эти растворы можно вводить в организм человека, причем введенный органический растворитель растворяется в жидкости тела, оставляя композицию по данному изобретению, включающую биоразлагемый полимер. При этом используется такой органический растворитель, который смешивается с водой и не токсичен, чтобы его можно было вводить человеку. Для получения раствора ПЭГилированный белок, органическую кислоту и биоразлагаемый полимер нужно растворить в указанном органическом растворителе. Для получения суспензии по меньшей мере один из компонентов (ПЭГилированного белка, органической кислоты и биоразлагаемого полимера) не должен полностью растворяться во взятом органическом растворителе. Органические растворители, используемые в примерах по данному изобретению, включают N-метилпирролидон, диметилсульфоксид, пропиленгликоль, этилбензоат, бензилбензоат, триацетин, полиэтиленгликоль 400 и их смеси. Композиция по данному изобретению может не включать какие-либо из указанных здесь органических растворителей или групп органических растворителей. В примерах по данному изобретению могут применяться способы получения композиций с биоразлагаемым полимером, растворенным в органическом растворителе.

На фиг. 5 показан способ 500 получения раствора или суспензии, содержащих биоразлагаемый полимер и соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Способ 500 включает получение конъюгата белок-полиэтиленгликоль 502. Способ 500 также включает смешивание биоразлагаемого полимера, конъюгата белок-полиэтиленгликоль, гидрофобной органической кислоты и органического растворителя с образованием смеси 504. В этом способе конъюгат белок-полиэтиленгликоль может не содержать соли этого конъюгата. Используемый в этом способе конъюгат белок-полиэтиленгликоль может быть представлен конъюгатом глюкагоноподобного пептида 1 с полиэтиленгликолем. При смешивании может использоваться также второй конъюгат белок-полиэтиленгликоль, который может быть представлен конъюгатом инсулин-полиэтиленгликоль.

Способ 500 также выключает образование соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль 506. Соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль включает конъюгат белок-полиэтиленгликоль и анион гидрофобной органической кислоты. Образование соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль можно осуществлять одновременно с растворением компонентов в органическом растворителе, а не растворять в нем уже полученную соль. Способ 500 включает также перемешивание указанной смеси для образования раствора или суспензии 508. После перемешивания может получиться прозрачный раствор. При этом используются любые конъюгат белок-полиэтиленгликоль, биоразлагаемый полимер, гидрофобная органическая кислота и органический растворитель из числа описанных в настоящем документе соответствующих соединений. Каждый из указанных компонентов и этапов может быть безводным.

На фиг. 6 показан способ 600 получения раствора или суспензии биоразлагаемого полимера и соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Способ 600 включает растворение биоразлагаемого полимера в органическом растворителе для образования смеси 602. В способ 600 может не входить растворение соли конъюгата белок-полиэтиленгликоль в органическом растворителе. Способ 600 также включает прибавление конъюгата белок-полиэтиленгликоль и гидрофобной органической кислоты к смеси (604). Также способ 600 включает протонирование аминогрупп в конъюгате белок-полиэтиленгликоль за счет гидрофобной органической кислоты (606). В результате этого протонирования может образоваться соль конъюгата белок-полиэтиленгликоль, содержащая гидрофобный анион. Кроме того, способ 600 включает перемешивание полученной смеси для образования раствора или суспензии (608). После перемешивания моет получиться прозрачный раствор. В способе 600 используются любые конъюгат белок-полиэтиленгликоль, биоразлагаемый полимер, гидрофобная органическая кислота и органический растворитель из числа описанных в настоящем документе соответствующих соединений. Каждый из указанных компонентов и этапов может быть безводным.

В результате применения способов 500 и 600 или сходных способов получается раствор. Этот раствор может быть введен путем инъекции нуждающемуся в том индивиду. При контакте этого раствора с водой может образоваться твердофазное депо. Затем из этого депо постепенно высвобождается нужный белок или иной медицинский активный агент.

Пример 1

Мутантный белок, представляющий собой глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1 [7-36] с добавленным на С-конце полипептидной цепи цистеином в положении 37, клонировали в виде слитого белка (слитый с более крупным полипептидом), содержащим самоотщепляющуюся путем аутопротеолиза последовательность между GLP-1 и этим другим полипептидом. Слитый белок экспрессировался в клетках Escherichia coli, для чего использовали индукцию транскрипции изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) и полимеразу фага T7.

Пример 2

Слитый белок, содержащий GLP-1, выделяли из клеточных лизатов в денатурирующих условиях, проводили его ренатурацию, расщепление (аутопротеолиз) и затем очистку путем катионной хроматографии. Для подтверждения идентичности пептидов проводили анализ свойств, включавший высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (RP-HPLC), электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и масс-спектрометрию. В качестве контроля при этом использовали имеющийся в продаже синтетический мутантный GLP-1 с цистеином.

Пример 3

К мутантному GLP-1 с цистеином (полученному рекомбинантным путем или путем химического синтеза) присоединяли через малеимид, который взаимодействует с цистеином, полиэтиленгликоль с молекулярной массой 5 кДа или 10 кДа. Для этого поступали следующим образом. Вначале пептид растворяли в буферном растворе (фосфат натрия 20 мМ; pH 7,5) в концентрации 1-5мг/мл и прибавляли эквивалентное молярное количество полиэтиленгликоля, содержащего малеимид. Оставляли эту реакционную смесь на ночь. Затем очищали ПЭГилированный GLP-1 путем катионной ионообменной хроматографии, используя SP-сефарозу HP, в качестве уравновешивающего буферного раствора ацетат натрия 10 мМ (рН 3,5) и для элюирования в ступенчатом градиенте 0,02%-ный раствор бикарбоната аммония. Фракции, содержащие искомый продукт, объединяли, диализовали против 0,02%-ного раствора бикарбоната аммония и лиофилизировали. Определяли концентрацию очищенного ПЭГилированного пептида путем ультрафиолетовой спектроскопии или определяли белок методом Бредфорда. После ПЭГилирования проводили дополнительный анализ, включавший эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (SEC-HPLC), электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), масс-спектрометрию, определение N-концевой аминокислотной последовательности и определение эндотоксина. Использовали также более крупные молекулы полиэтиленгликоля, а именно с молекулярной массой 20 кДа. Могут быть использованы еще более крупные молекулы полиэтиленгликоля (например, с молекулярной массой 40 кДа).

Пример 4

GLP-1 с присоединенным к его N-концу полиэтиленгликолем получали следующим образом. Вначале 30 мг GLP-1 растворяли в буферном растворе (ацетат натрия 20 мМ; pH 4,5) до концентрации GLP-1 1-5 мг/мл. Затем прибавляли 55 мг ПЭГ-пропионового альдегида с молекулярной массой 5 кДа и после этого 2 мг цианборгидрида натрия. Полученную реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре. Спустя 16 часов PEG-GLP-1 очищали путем катионной ионообменной хроматографии, используя SP-сефарозу HP.

Пример 5

Человеческий гормон роста (hGH) субклонировали в клетках Escherichia coli, для чего использовали индукцию транскрипции изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) и полимеразу фага T7. Клетки культивировали до оптической плотности при 600 нм OD₆₀₀=0,5 и прибавляли IPTG (1 мМ) для индукции экспрессии. Индуцированную культуру инкубировали в течение ночи (16 часов). Клетки осаждали путем центрифугирования, клеточный осадок хранили при температуре -20°C.

Клеточный осадок оттаивали, суспендировали в буферном растворе для лизиса (1 мM этилендиаминтетраацетат (EDTA), 150 мM хлорид натрия, 50 мM трис(гидроксиметил)аминометан (Tris), 1% полиэтиленгликоля моно(тетраметилбутанол)фениловый эфир (Triton X-100); pH 7,5) и гомогенизировали три раза в микрофлюидизаторе. Нерастворимый материал собирали путем центрифугирования, суспендировали в солевом буферном растворе (50 мМ хлорид натрия, 50 мМ Тris; рН 7,5) и еще раз собирали путем центрифугирования. Нерастворимый осадок (тельца включения) хранили при температуре -20°C.

Часть полученного нерастворимого осадка (~ 15 мг hGH) оттаивали, растворяли в 10 мл раствора, содержащего мочевину (8 М), цистеин (10 мM) и BisTris (20 мМ), перемешивали 60 минут при комнатной температуре, после чего разводили в 100 мл раствора, содержащего Tris (20 мМ) и глицерин (15%); pH 8,5. Для ренатурации эту смесь держали при температуре 4°C в течение суток, затем центрифугировали и наносили на колонку объемом 5 мл с Q-сефарозой XL, уравновешенную буферным раствором А, содержащим BisTris (20 мМ); pH 7,0. Связавшиеся белки элюировали в солевом/рН градиенте (0-100%) буферным раствором B, содержащим хлорид натрия (50 мM), BisTris (20 мМ); pH 5. Полученные с колонки фракции анализировали путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC); фракции, содержавшие ренатурированный hGH, объединяли и хранили при температуре -20°C.

Пример 6

К N-концу ренатурированного очищенного человеческого гормона роста (hGH) присоединяли полиэтиленгликоль по следующему протоколу. Вначале 30 мг hGH растворяли в растворе ацетата натрия (20 мМ; pH 4,5) до концентрации 5 мг/мл. Прибавляли 40 мг полиэтиленгликоля-пропионового альдегида с молекулярной массой 10 кДа и затем 8 мг цианборгидрида натрия. Реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре. Через 16 часов проводили очистку полученного ПЭГилированного человеческого гормона роста, используя колонку HiTrap объемом 5 мл с Q-сефарозой.

Пример 7

Микросферы из поли(лактид-ко-гликолид)а (PLGA), нагруженные глюкагоноподобным пептидом 1 (GLP-1), с гидрофобным противоионом получали следующим образом. Вначале 30 мг конъюгата полиэтиленгликоля с молекулярной массой 5 кДа и глюкагоноподобного пептида 1 (PEG-GLP-1) растворяли в 2 мл дихлорметана. Затем прибавляли 50 мкл раствора памоевой кислоты (50 мг/мл в диметилформамиде [DMF]). После этого к раствору пептида прибавляли 170 мг PLGA 502 и с помощью мешалки типа «Vortex» перемешивали до тех пор, пока смесь не становилась прозрачной. Прибавляли 5 мл агента, стабилизирующего эмульсию (1%-ный поливиниловый спирт), и полученную смесь тут же перемешивали на максимальной скорости с помощью миксера Vortex-Genie в течение 7-8 секунд. Образовавшуюся эмульсию сразу соединяли, быстро перемешивая, с 100 мл 0,3%-ного винилового спирта и через 10 минут прибавляли 150 мл 2%-ного изопропанола. Полученную суспензию перемешивали в течение 3-12 часов, чтобы растворитель испарился и произошло отверждение микросфер. Полученные микросферы отделяли путем отстаивания, промывали очищенной водой (три раза по 200 мл) и лиофилизировали. Для получения микросфер с GLP-1 и памоевой кислотой использовали различные полимеры PLGA (например, PLGA 502 для получения препарат, вводимого раз в неделю, или PLGA 753 для получения препарата, вводимого раз в месяц).

Пример 8

Чтобы проверить включение медицинского активного агента и гидрофобного иона в микросферы, нагруженные микросферы вначале растворяли в ацетонитриле, затем осаждали полимер путем разведения полученного раствора в воде. Отделяли супернатант и анализировали его путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC). Этот анализ показал, что микросферы, нагруженные PEG-GLP-1 и включающие памоевую кислоту, содержали от 2% до 18% медицинского активного агента (PEG-GLP-1) и около 0,3-0,5% памоевой кислоты. Таким образом, результаты анализа RP-HPLC подтверждали включение памоевой кислоты в микросферы.

Пример 9

Определяли размер микросфер с помощью анализатора размеров частиц Beckman. Средний диаметр полученных частиц составлял от 20 до 45 мкм; частицы такого размера вполне можно вводить подкожно с помощью шприца с иглой калибра 27. При изучении частиц с помощью светового микроскопа было обнаружено, что они имеют ровную сферическую форму с минимальными изменениями или включениями на поверхности. У частиц по данному изобретению было меньше поверхностных изменений и включений, нежели у обычных частиц, содержащих медицинские активные агенты. На фиг. 7A представлена микрофотография, полученная с помощью светового микроскопа, микросфер из PLGA 502, нагруженных PEG-GLP-1 с памоевой кислотой. Размеры частиц, которые можно видеть на фиг. 7A, характеризуются D10 = 16 мкм, D50 = 33 мкм, D90 = 50 мкм. На фиг. 7В представлена микрофотография, полученная с помощью светового микроскопа, микросфер из PLGA 502, нагруженных конъюгатами полиэтиленгликоль-инсулин и полиэтиленгликоль-глюкагоноподобный пептид 1 с памоевой кислотой (премикс). Размеры частиц, которые можно видеть на фиг. 7В, характеризуются D10 = 18 мкм, D50 = 30 мкм, D90 = 42 мкм. Полученные значения размеров частиц группируются преимущественно вблизи диаметра, позволяющего вводить их с помощью шприца.

Пример 10

Чтобы изучить первоначальный всплеск концентрации активного агента при его высвобождении, для получения микросфер брали по 170 мг различных полимеров PLGA, 30 мг конъюгата глюкагоноподобного пептида 1 с полиэтиленгликолем (PEG-GLP-1) и 50 мкл раствора памоевой кислоты (50 мг/мл в диметилформамиде [DMF]). Для контроля микросферы получали, взяв также PLGA и PEG-GLP-1 и либо в присутствии 50 мкл DMF, либо без него. Микросферы после лиофилизации суспендировали в 0,4%-ном поливиниловом спирте, содержащем 0,05% азида натрия, и инкубировали при температуре 37°C при роторном перемешивании в горизонтальной плоскости. Через 24 часа полученную суспензию центрифугировали и супернатант анализировали путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC); при этом количество высвобождающегося ПЭГилированного пептида определяли с помощью стандартных кривых. В таблице 1 представлены данные о количестве высвободившегося ПЭГилированного пептида, в процентах относительно суммарного его количества, исходно присутствовавшего в микросферах. При лечении больных, как правило, желательно, чтобы первоначальный всплеск концентрации активного агента был как можно меньше. Судя по данным, представленным в таблице 1, памоевая кислота сводит к минимуму первоначальный всплеск концентрации активного агента при высвобождении PEG-GLP-1 из микросфер, полученных с использованием полимеров PLGA с молекулярной массой около 12-18 кДа (PLGA 502 и PLGA 752). В случае микросфер из PLGA 503 памоевая кислота усиливала первоначальный всплеск концентрации активного агента при его высвобождении из этих микросфер. Из таблицы 1 также следует, что изменение в первоначально высвобождающемся количестве активного агента определяется не растворителем (диметилформамидом), а памоевой кислотой.

Таблица 1. Влияние памоевой кислоты на относительное количество активного агента, первоначально высвобождающегося из микросфер, полученных с использованием различных полимеров PLGA

Пример 11

Чтобы изучить контролируемое высвобождение активного агента, для получения микросфер брали по 170 мг различных полимеров PLGA, 30 мг конъюгата глюкагоноподобного пептида 1 с полиэтиленгликолем (PEG-GLP-1) и 50 мкл раствора памоевой кислоты (50 мг/мл в диметилформамиде [DMF]). Для контроля микросферы получали, взяв также PLGA и PEG-GLP-1 и либо в присутствии 50 мкл DMF, либо без него. Микросферы после лиофилизации суспендировали в 0,4%-ном поливиниловом спирте, содержащем 0,05% азида натрия, и инкубировали при температуре 37°C при роторном перемешивании в горизонтальной плоскости. Через определенные промежутки времени суспензию центрифугировали и супернатант анализировали путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC); при этом количество высвобождающегося ПЭГилированного пептида определяли с помощью стандартных кривых. На фиг. 8 и 9 изображены графики, представляющие результаты изучения контролируемого высвобождения активного агента из микросфер. Для построения этих графиков брали значения количества (в процентах) высвободившегося ПЭГилированного пептида относительно суммарного его количества, исходно присутствовавшего в микросферах. На фиг. 8 и 9 видно, что памоевая кислота сводит к минимуму первоначальный всплеск концентрации высвобождающегося PEG-GLP-1, но мало влияет на окончательный профиль высвобождения. Время полного высвобождения активного агента из микросфер зависело главным образом от гидрофобности полимера PLGA. В PLGA 502 соотношение лактида и гликолида составляет 50:50, а в PLGA 752 это соотношение 75:25 (лактид/гликолид). Чем это отношение больше, тем гидрофобнее полимер PLGA. Соответственно, в случае PLGA 752 для высвобождения PEG-GLP-1 требуется больше времени, чем в случае PLGA 502.

Пример 12

Для определения сродства связывания ПЭГилированного глюкагоноподобного пептида 1 (PEG-GLP-1) с рецептором GLP-1 in vitro использовали биосенсорную систему анализа межмолекулярных взаимодействий Biacore (GE Healthcare). Рецептор, связывающий GLP-1, ковалентно иммобилизовали на поверхности биосенсора, на которую затем наносили ПЭГилированный GLP-1 либо GLP-1 сам по себе. Константа диссоциации (K_D) при связывании с рецептором GLP-1 для PEG(5 кДа)-GLP-1(вариант с цистеином) получилась 1,6 мкМ, а для интактного GLP-1 она составила 1,0 мкМ. Константа равновесия для PEG(5 кДа)-GLP-1(присоединение к N-концу) не определялась – вероятно, из-за того, что взаимодействие между рецептором и пептидом, несущим на N-конце молекулу полиэтиленгликоля, слишком слабое. Присоединение полиэтиленгликоля к С-концу GLP-1 не влияло существенно на удельную активность этого пептида, тогда как присоединение полиэтиленгликоля к N-концу, по всей видимости, мешает связыванию с рецептором.

Пример 13

Определяли биологическую активность конъюгатов глюкагоноподобного пептида 1 и полиэтиленгликоля in vitrо, используя клетки линии CHO-K1/Gα15 и отслеживая связывание GLP-1 с его рецептором по индуцируемой GLP-1 зависимой от концентрации стимуляции внутриклеточной мобилизации кальция. Перед стимуляцией агонистом рецептора GLP-1 клетки нагружали реагентами аналитического набора «Calcium-4». Изменения внутриклеточной концентрации кальция измеряли с помощью спектрофотометра FlexStation. Строили график зависимости значений флуоресценции в относительных единицах (RFU) от логарифма суммарной дозы (5-кратное разведение) GLP-1. В таблице 2 приведены значения полумаксимальной эффективной концентрации (EC₅₀) – концентрации, при которой достигается 50% наибольшей активности. Чем меньше величина EC₅₀, тем больше активность. Оказалось, что GLP-1, несущий молекулу полиэтиленгликоля на С-конце, обладал почти такой же активностью, что и не модифицированный пептид GLP-1, что согласовалось с результатами, полученными с помощью биосенсорной системы Biacore в Примере 12. Наличие молекулы полиэтиленгликоля с молекулярной массой 5 кДа на С-конце GLP-1 не влияло существенно на активность пептида. У пептидов, несущих полиэтиленгликоль на N-конце, удельная активность была значительно ниже, чем у GLP-1 с полиэтиленгликолем на С-конце. Замена N-концевого полиэтиленгликоля на менее крупный (2 кДа вместо 5 кДа) не влияла существенно на активность GLP-1.

Таблица 2. Связывание GLP-1 с его рецептором

Пример 14

Были получены микросферы, несущие двойной «груз»: конъюгат глюкагоноподобногопептида 1 с полиэтиленгликолем (PEG-GLP-1) и конъюгат инсулина с полиэтиленгликолем (PEG-I); эти микросферы содержали также памоевую кислоту. Для их получения использовали экстракцию растворителем стабилизированной эмульсии масло/вода и испарение растворителя. Масляная фаза состояла из 170 мг полимера PLGA, 10 мг PEG-I, 20 мг PEG-GLP-1 и 2,5 мг памоевой кислоты (из исходного раствора памоевой кислоты 50 мг/мл в DMF), растворенных в 2 мл дихлорметана. Масляную фазу эмульгировали путем встряхивания с 5 мл 1%-ного (масса/объем) поливинилового спирта; в эту первичную эмульсию прибавляли 100 мл 0,3%-ного поливинилового спирта при перемешивании со скоростью 300 об/мин. Приблизительно через 10 минут прибавляли 150 мл 2%-ного изопропилового спирта (IPA) и полученную суспензию перемешивали, чтобы способствовать испарению растворителя. Через 3 часа отвержденные микросферы промывали очищенной водой (три раза по 200 мл) и лиофилизировали.

Пример 15

Для фармакокинетического исследования продолжительностью 20 суток использовали самцов крыс линии Sprague Dawley. Животным (по 6 особей в группе) вводили путем подкожных инъекций микросферы, содержащие либо ПЭГилированный глюкагоноподобный пептид (PEG-GLP-1), либо PEG-GLP-1 и ПЭГилированный инсулин (PEG-I), которые смешивали предварительно (премикс). И те, и другие микросферы содержали также памоевую кислоту и PLGA 502. Дополнительный контроль включал группу крыс, получавших плацебо, которым служил только разбавляющий раствор (1% карбоксиметилцеллюлоза натрия, 5% D-маннит и 1% полисорбат-20). Определяли профиль высвобождения указанных активных агентов in vivo, для чего у подопытных животных в определенные моменты времени брали образцы плазмы крови и анализировали их путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор для определения GLP-1 производства EM Millipore. На фиг. 10 и 11 изображены результаты фармакокинетического анализа глюкагоноподобного пептида 1 и инсулина в плазме крови крыс после введения им микросфер по данному изобретению. В обоих случаях высвобождение ПЭГилированного пептида (GLP-1 либо инсулина) in vivo характеризовалось наличием максимума концентрации приблизительно на 17-е сутки. Добавление PEG-I к GLP-1 в составе микросфер не влияло существенно на профиль высвобождения GLP-1. Из микросфер, содержавших смесь (премикс) этих двух агентов, инсулин высвобождался примерно в то же время, что и GLP-1. Таким образом, как микросферы, содержавшие один активный агент, так и микросферы, содержавшие два активных агента, характеризовались примерно одинаковым временем их высвобождения.

Пример 16

Получали также микросферы из PLGA, содержащие энфувиртид и памоевую кислоту, используя экстракцию растворителем стабилизированной эмульсии масло/вода и испарение растворителя. Энфувиртид не ПЭГилировали. Масляная фаза состояла из 170 мг PLGA 502, 30 мг энфувиртида, 8 мг памоевой кислоты и 2 мл дихлорметана. Масляную фазу эмульгировали путем встряхивания с 5 мл 1%-ного (масса/объем) поливинилового спирта; в эту первичную эмульсию прибавляли 100 мл 0,3%-ного поливинилового спирта при перемешивании со скоростью 300 об/мин. Приблизительно через 10 минут прибавляли 150 мл 2%-ного изопропилового спирта (IPA) и полученную суспензию перемешивали, чтобы способствовать отверждению микросфер. Через 3 часа отвержденные микросферы отфильтровывали, промывали большим объемом дважды дистиллированной воды и лиофилизировали. Вторую партию микросфер получали так, как описано выше, за тем исключением, что в смесь не добавляли памоевую кислоту. Анализ распределения частиц по размерам показал, что микросферы с энфувиртидом, полученные с памоевой кислотой, отличались большей гомогенностью (средний размер 28 мкм; S.D. 9,5 мкм), нежели микросферы с энфувиртидом, полученные без памоевой кислоты (средний размер 32,75 мкм; S.D. 34, 07 мкм).

Пример 17

Были получены препараты in situ, содержащие PLGA, PEG-GLP-1, памоевую кислоту и N-метилпирролидон (NMP). Для этого вначале 340 мг PLGA (PLGA 503, PLGA 752 или же PLGA 753) растворяли в 1 мл N-метилпирролидона. Затем прибавляли 30 мг PEG-GLP-1 вместе с 2,5 мг памоевой кислоты (из исходного раствора 200 мг/мл в диметилсульфоксиде (DMSO)). Смесь перемешивали путем вращения сосуда до тех пор, пока она не становилась прозрачной. Для высвобождения активного агента каждый раствор помещали в кассету для диализа Slide-A-lyzer (порог отсечения по молекулярной массе 3,5 кДа) и суспендировали в химическом стакане в 900 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), содержащего 0,05% полисорбата. Диализный буферный раствор осторожно перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Через 16 часов при комнатной температуре в кассетах образовывался осадок и поверх него слой жидкости. Жидкость и твердую фазу разделяли и определяли содержание PEG-GLP-1 путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC). По расчетам, высвобождение составило 11% в случае использования PLGA 503, 62% в случае PLGA 752 и 40% в случае PLGA 753. Очевидно, на высвобождение активного агента влияла гидрофобность полимера PLGA.

Пример 18

Были получены препараты in situ, содержащие PLGA, PEG-GLP-1, памоевую кислоту и смесь растворителей, одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA). Для этого вначале 340 мг PLGA 752 растворяли в 1 мл смеси, содержавшей 50% N-метилпирролидона и 50% бензилбензоата, или же смеси, содержавшей 50% диметилсульфоксида (DMSO) и 50% бензилбензоата. Затем прибавляли 30 мг PEG-GLP-1 вместе с 2,5 мг памоевой кислоты (из исходного раствора в диметилсульфоксиде 200 мг/мл). Смесь перемешивали путем вращения сосуда до тех пор, пока она не становилась прозрачной. Для высвобождения активного агента каждый раствор помещали в кассету для диализа Slide-A-lyzer (порог отсечения по молекулярной массе 3,5 кДа) и суспендировали в химическом стакане в 900 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), содержащего 0,05% полисорбата. Через 16 часов при комнатной температуре в кассетах образовывался осадок и поверх него слой жидкости. Жидкость и твердую фазу разделяли и определяли содержание PEG-GLP-1 путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC). По расчетам, высвобождение составило в случае смеси диметилсульфоксида с бензилбензоатом 2,6%, а в случаем смеси N-метилпирролидона с бензилбензоатом 0,2%. Диметилсульфоксид - более полярное соединение, чем N-метилпирролидон. Желаемую скорость высвобождения в зависимости от режима введения – раз в неделю или раз в месяц - можно подбирать на основе гидрофобности и концентрации PLGA, смешиваемости растворителей с водой и/или добавления памоевой кислоты.

Пример 19

Примеры 1-18 осуществили также, используя в качестве активного агента вместо GLP-1, инсулина и/или энфувиртида человеческий гормон роста, инсулин, энфувиртид, гормон околощитовидной железы, фрагмент гормона околощитовидной железы, октреотид или другие медицинские активные агенты. Примеры по данному изобретению также включали получение микросфер и композиций с органическими растворителями для любой из композиций из примеров 1-19. В этих примерах был продемонстрирован отличный концентрационный профиль и другие свойства, по которым композиции и способы по данному изобретению превосходят обычные способы и композиции.

В настоящем описании с целью пояснения приведены многие детали, чтобы обеспечить понимание различных примеров предлагаемой технологии. Специалистам в данной области техники должно быть ясно, однако, что определенные примеры можно осуществить на практике и без некоторых из этих деталей или же с дополнительными деталями.

Специалисту в данной области техники по прочтении описания нескольких примеров будет понятно, что можно использовать различные модификации, альтернативные и эквивалентные конструкции без отступления от сущности данного изобретения. Ряд хорошо известных в данной области техники процессов и элементов не описаны в настоящем документе во избежание затруднения понимания данного изобретения. Также подробности какого-либо конкретного примера не обязательно имеются в вариантах данного примера или они могут быть включены в другие примеры.

Там, где в настоящем документе приводятся диапазоны значений, подразумевается, что, если из контекста не следует иного, данное описание включает также каждое из промежуточных значений между верхней и нижней границами указанного диапазона до десятой доли его нижней границы. Настоящим описанием охватываются также каждый из более узких диапазонов между любым из указанных значений и промежуточных значения данного диапазона. Верхняя и нижняя границы этих более узких диапазонов могут независимо включаться или не включаться в данный диапазон, и всякий диапазон, одна, обе или ни одна из границ которого входит в более узкий диапазон, тоже входит в объем данного изобретения с учетом исключения из данного диапазона любой конкретно указанной его границы. Также в тех случаях, когда приведенный диапазон включает одну или обе границы, в объем данного изобретения входят диапазоны, не включающие одну или обе из этих включенных границ.

В настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения единственное число определенного и неопределенного артиклей “a”, “an” и “the” включают значение множественного числа, если из контекста не явствует иное. Так, например, когда речь идет о «способе», подразумевается множество таких способов и когда речь идет о «белке», подразумевается один или более белков и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники и т.п. Данное изобретение описано в настоящем документе в деталях с целью ясности изложения и его понимания. Однако следует иметь в виду, что в пределах объема прилагаемой формулы изобретения возможно осуществлять определенные изменения и модификации.