Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДСТВО С ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫМ ПОЛИПЕПТИДОМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к области фармации и касается технологии приготовления фармацевтического средства в форме раствора для назального применения на основе гликозилированных полипептидов (ГПП), выделенных из отходов переработки промысловых морских ежей Strongylocentrotus droebachiensis и предназначенного для терапии постгриппозных осложнений. Средство для интраназального применения обладает стабильностью, удобно для применения, безопасно для клинического применения. Средство имеет преимущества простой технологии получения, простого и удобного контроля качества и более низкой стоимости производства по сравнению с твердыми дозированными формами. Таким образом, средство является выгодным с экономической точки зрения для промышленного производства.

Одной из актуальных проблем медицины на всех ее этапах развития являются острые и хронические заболевания верхних дыхательных путей. Большую часть среди инфекционных заболеваний (около 90%) занимают грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) [Сергеева И.В., Камзалакова Н.И., Тихонова Е.П., Булыгин Г.В. Патогенез острых респираторных вирусных инфекций и гриппа // Практическая медицина. - 2012. - Т. 61, №6. - С. 47-51]. Экономические потери в Российской Федерации из-за гриппа и ОРВИ составляют 86% от всего ущерба, наносимого инфекционными болезнями, что сопоставимо с травматизмом, сердечнососудистыми заболеваниями и злокачественными новообразованиями [Осидак Л.В., Дриневский В.П., Цыбалова Л.М. Острые респираторные инфекции у детей и подростков: практическое руководство для врачей / под ред. Л.В. Осидак. - 3-е изд., доп.- СПб.: ИнформМед, 2010. - 216 с]. Высокая частота ОРВИ в значительной степени обусловлена разнообразием возбудителей, среди которых доминируют вирусы гриппа, парагриппа, адено-, рино-, рео- и PC-вирусы. Нередко встречаются ОРВИ, обусловленные вирусно-бактериальными, вирусно-микоплазменными ассоциациями, что затрудняет профилактику и эффективное лечение этих заболеваний и в большинстве случаев приводит к осложнениям [Носуля Е.В., Ким И.А., Винников А.К. Острые респираторные инфекции в практике оториноларинголога: трудности и перспективы лечения // Фарматека. - 2013. - №1. - С. 85-87].

Грипп считается респираторной инфекцией с трудно предсказуемым течением и быстро развивающимися осложнениями. Тем не менее, в связи с быстрым распространением вирусных инфекций химиотерапия в текущей практике лечения инфекционных заболеваний и предупреждения осложнений начинает играть все возрастающую роль [Киселев О.И. Химиопрепараты и химиотерапия гриппа/ О.И. Киселев - СПб.: ООО «Издательство «Росток»», 2012. - 272 с.]. Частым осложнением гриппа являются пневмония, ринит, синусит, бронхит, отит, причем по данным ВОЗ примерно у 10% всех заболевших и у 50% госпитализированных пациентов с гриппом развивается пневмония [Паньков А.С Бактериальные осложнения гриппа и их прогнозирование // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2012. - Т. 12, №5(2). - С. 490-493].

В арсенале современной медицины имеется относительно небольшой перечень этиотропных химиопрепаратов, которые получили международное признание (циклоферон, ремантадин, озельтамивир, занамивир). Но, несмотря на это, проблема терапии постгриппозных осложнений сохраняет свою актуальность, так как применяющиеся средства обладают преимущественно антибиотической активностью и высокой токсичностью. Таким образом, разработка лекарственных средств для предупреждения развития постгриппозных осложнений является весьма актуальной задачей.

Известно средство, обогащенное пептидами, аминокислотами и фосфолипидами, обладающее противовоспалительными свойствами путем ингибирования ЦОГ-2, нормализации показателей антиоксидантной системы. Показана активность средства при экспериментальном остром риносинусите и экспериментальном остром бронхите крыс. Согласно описанному способу получают комплексный препарат, в состав которого входят как низкомолекулярные олигопептиды, аминокислоты и минеральные вещества, так и полипептиды. В спиртовой экстракт переходит значительное количество соединений липидной природы, которые в процессе высушивания соосаждаются на поверхности, происходит процесс "залипания" полученного продукта и быстрое его окисление (Патент RU 2481119, опубликовано 10.05.2013).

Известна фармацевтическая композиция, обладающая противотромботическим, тромболитическим, иммуномодулирующим, противовоспалительным действиями, нормализующая липидный и углеводный обмен, полученная из лиофилизированной медицинской пиявки. При этом состав лиофилизата медицинской пиявки не описан и не рассматривается возможность использования средства для предупреждения развития постгриппозных осложнений (Патент RU 2519741, опубликовано 27.12.2013).

Описан способ получения нового гликопептидного антибиотического производного против ванкомицин-устойчивой бактерии (Патент RU 2481354, опубликовано 10.05.2013). Недостатком данного изобретения является то, что его применение ограничено только терапией постгриппозных осложнений, вызванных ванкомицин-устойчивыми бактериями.

Описываются новые производные гликопептидные соединения, проявляющие широкую активность против грамположительных микроорганизмов, а также улучшенную противомикробную активность против устойчивых к ванкомицину изолятов (Патент RU 2145609, опубликовано 20.02.2000). Однако в данном патенте описаны гликопептиды, проявляющие активность против грамположительных микроорганизмов, что ограничивает их применение.

Описан синтез так называемых «фукопептидов» и их фармацевтическая композиция, а также способ профилактики или лечения расстройств или заболеваний, которые опосредованы связыванием селектинов, в частности хронических воспалений и аутоиммунных заболеваний (Заявка на патент RU 97117356, опубликовано 10.07.1999). Синтез соединений сложен и многостадиен, что влечет за собой значительные экономические издержки на его производство и не позволит применить их в практике в качестве доступных средств для лечения постгриппозных осложнений.

Предложены гликопротеины, выделенные изоэлектрическим фокусированием из межклеточного пространства тканей различных органов, сыворотки крови, желчи человека и животных, растворимые в насыщенном (100%-ном) растворе сернокислого аммония и имеющие кажущуюся молекулярную массу 10-45 кДа. Такие гликопротеины обладают биологической активностью в сверхмалых дозах 10^-12-10^-29 моль/л и ниже. Предложены также фармацевтические композиции, включающие указанные гликопротеины в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель (Патент RU 2223781, опубликовано 20.02.2004). В данном изобретении не приведены примеры in vivo, подтверждающие возможность использования гликопротеинов для лечения постгриппозных осложнений.

Предложены новые антибиотики и способ их получения путем проведения реакции ацилирования 11,12-циклического карбоната 2'-O-ацетил-4''-O-(ω-аминоалкил)карбамоилазитромицина эремомицином, ванкомицином или агликоном тейкопланина в присутствии конденсирующего агента с последующим удалением 2'-О-ацетил-защитной группы (Патент RU 2570425, опубликовано 10.12.2015). В описании изобретения приведены данные только об антимикробной активности in vitro. Нет данных о фармакологической активности in vivo.

Известны новые композиции и способы облегчения симптомов атеросклероза и других воспалительных состояний, таких как ревматоидный артрит, красная волчанка, узелковый полиартериит, остеопороз, болезнь Альцгеймера и вирусные болезни, такие как грипп А. Пептид имеет длину в интервале 3 до 10 аминокислот; включает последовательность аминокислот, где последовательность содержит кислые и основные аминокислоты, чередующиеся с ароматическими, гидрофобными или незаряженными полярными аминокислотами; включает гидрофобные концевые аминокислоты или концевые аминокислоты, несущие гидрофобную защитную группу, и не является последовательностью LAEYHAK (SEQ ID NO:2), включающей все L-аминокислоты; причем пептид превращает провоспалительный липопротеин высокой плотности (ЛВП) в противовоспалительный ЛВП или делает противовоспалительный ЛВП более противовоспалительным (Патент RU 2448977, опубликовано 27.04.2012). Недостатком является многостадийный сложный синтез с низким выходом.

Таким образом, прямых аналогов, т.е. готовых лекарственных средств на основе ГПП для терапии постгриппозных осложнений, не обнаружено.

Наиболее близким к предлагаемому является изобретение, описывающее получение и применение средства на основе ГПП из отходов переработки промысловых морских ежей Strongylocentrotus droebachiensis, обладающего противовоспалительным действием (Патент RU 2545703, опубликовано 10.04.2015). Недостатком данного изобретения является отсутствие описания композиции для интраназального применения и дальнейшего применения в клинике.

В основу изобретения положена задача создания фармацевтического препарата в форме водного раствора для интраназального применения, который содержит необходимое и достаточное количество ГПП, выделяемых из морских ежей Strongylocentrotus droebachiensis и обладает стабильностью при хранении.

Задача решена тем, что заявляемое средство для интраназального применения в форме водного раствора для терапии постгриппозных осложнений согласно изобретению содержит терапевтически эффективное количество ГПП из отходов переработки (внутренностей) промысловых морских ежей Strongylocentrotus droebachiensis и биоадгезивный компонент в водном растворе с рН от 6 до 7.

Заявляемый состав в качестве действующего вещества содержит ГПП, выделяемые из внутренностей морских ежей Strongylocentrotus droebachiensis путем экстракции свежих, замороженных или сушеных внутренностей этиловым спиртом при соотношении сырье:экстрагент 1:1-1:3 при температуре от 0 до плюс 10°С в течение от 2 ч до 10 суток, отделения экстракта на сепараторе или центрифуге, его упаривания до 1/50-1/70 объема, фильтрации концентрата через фильтр с размером пор 1 кДа, гель-хроматографирования концентрата, отделения фракции с молекулярной массой 5,5-7,0 кДа и ее высушивания,

Предпочтительно эффективное количество ГПП составляет 0,001-0,500 г/100,0 мл.

Заявляемый состав в качестве биоадгезивного компонента содержит поликарбофил.

Предпочтительно эффективное количество поликарбофила составляет 0,05-0,2 г/100,0 мл.

Заявляемый состав дополнительно может содержать 1,0-2,5 г глицерина, 0,025-0,15 г динатрия эдетат дигидрат и 0,005-0,02 г бензалкония хлорид в 100,0 мл раствора.

Предпочтительный вариант заявляемого состава содержит 0,01 г ГПП, 0,1 г поликарбофила, 2,1 г глицерина, 0,05 г динатрия эдетат дигидрат и 0,01 г бензалкония хлорид в 100,0 мл раствора и достаточное количество натрия гидроксида для обеспечения рН 6,5 в объеме 100,0 мл.

Для получения лекарственной формы в реактор заливают воду, добавляют расчетное количество бензалкония хлорида, динатрия эдетата, глицерина и ГПП, перемешивают до растворения, к полученному раствору добавляют биоадгезивный компонент, перемешивают до однородности и нейтрализуют раствором натрия гидроксида до рН 6-7, перемешивают, фильтруют и разливают во флаконы темного стекла с навинчивающимся дозатором-распылителем.

Все стадии технологического процесса проводились при комнатной температуре и относительной влажности 30-50%.

При изучении свойств полученных растворов также установлено, что при охлаждении, замораживании и размораживании растворов в течение суток свойства препарата не изменяются.

При изучении стабильности для контроля препарата были выбраны следующие показатели: описание, подлинность, рН, вязкость, средняя масса дозы, количественное определение. Установлено, что за весь срок хранения раствора ГПП для интраназального введения он оставался стабильным по всем показателям.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в получении стабильного при хранении и нетоксичного при применении водного раствора ГПП для интраназального применения с рН 6-7, получаемого без применения токсичных органических растворителей и высоких температур.

Применение заявляемого изобретения на практике для терапии постгриппозных осложнений обеспечивает ему критерий «промышленная применимость».

Настоящее изобретение поясняется следующими примерами приготовления композиции и ее применения в качестве средства для терапии постгриппозных осложнений, которую можно вводить интраназально.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг. 1 представлена зависимость количества фосфо-форм МАР-киназы р38 в культуре клеток линии U937 от концентрации ГПП.

По оси абсцисс концентрация ГПП в мкг/мл; по оси ординат количество фосфо-форм МАР-киназы р38 в % от контроля.

На Фиг. 2 представлено влияние введения препаратов на количество бокаловидных клеток при оценке противовоспалительного действия на модели острого риносинусита. Средство по примеру 1 на основе ГПП (3) вводили в дозах 25, 50 и 100 мкл/носовой ход в сравнении с интактными животными (1), контролем (патология) (2) и препаратами сравнения Аква Марис (4) в дозе 100 мкл/носовой ход и Полидекса с фенилэфрином (5) в дозе 100 мкл/носовой ход. По оси абсцисс группа и доза; по оси ординат количество клеток на 1 мм слизистой носовых ходов.

* - р<0,05, статистически значимое отличие от контрольной группы (тест Тьюки).

# - р<0,05, статистически значимое отличие от интактной группы (тест Тьюки).

На Фиг. 3 представлено влияние введения препаратов на клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа через 48 часов после индукции воспаления на модели острого бронхита. Средство по примеру 1 на основе ГПП (3) вводили в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг в сравнении с интактными животными (1), контролем (патология) (2) и препаратом сравнения Беклометазон (4) в дозе 5,7 мкг/кг. По оси абсцисс группа и доза; по оси ординат количество нейтрофилов и лейкоцитов 10⁹/л.

* - р<0,05, статистически значимое отличие от контрольной группы (тест Тьюки).

На Фиг. 4 представлены фармакокинетические кривые распределения ГПП после однократного интраназального введения крысам средства по примеру 1 в дозе 100 мкг/кг в плазме (1) и в слизистой носа (2).

По оси абсцисс время в часах; по оси ординат уровень обнаруженного ГПП в мкг/мл для плазмы и в мкг/г для слизистой носа.

На Фиг. 5 суммарный график тканевой доступности ГПП после однократного интраназального введения крысам средства по примеру 1.

По оси абсцисс органы и ткани; по оси ординат тканевая доступность в %.

Пример 1. Приготовление раствора для интраназального применения на основе ГПП

Для получения лекарственной формы в реактор заливают 703 мл воды очищенной деионизированной, подсоединяют мешалку и при включенной мешалке в емкость осторожно добавляют отвешенные на весах 0,0763 г ГПП, 0,072 г бензалкония хлорида и 0,362 г динатрия эдетата. Перемешивание ведут до получения прозрачного раствора. После этого в раствор загружают предварительно отвешенные на весах 15,22 г глицерина и перемешивают до получения прозрачного раствора. Процесс перемешивания ведут при комнатной температуре. Скорость перемешивания 100-200 об/мин.

Затем добавляют 0,72 г поликарбофила и перемешивают для равномерного расхождения полимера 1-2 минуты, затем, не останавливая процесс перемешивания, раствор нейтрализуют, добавляя 5,0 мл 1М раствора натрия гидроксида. Перемешивание ведут при комнатной температуре, в течение 25 минут до получения однородного гелеобразного раствора. После образования геля раствор ГПП после контроля рН фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр. рН полученного раствора должен быть 6,0-7,0. Далее полученный раствор разливают во флаконы из темного стекла и укупоривают дозатором-распылителем. Получают 71 флакон с дозирующим устройством по 10 мл.

Пример 2. Оценка стабильности средства на основе ГПП.

Изучение стабильности средства по примеру 1 проводили методом естественного хранения при температуре (+2…+8°С) для контроля качества препарата были выбраны следующие показатели: прозрачность, степень окраски (цветность), рН, вязкость, однородность дозирования, средняя масса дозы, количество доз в упаковке.

Было установлено, что разработанная композиция ГПП для интраназального применения стабильна при хранении. Не происходит изменение цветности раствора, появления каких-либо механических включений. Также не наблюдается значимого изменения содержания концентрации действующего вещества и появления примесей. Полученные данные свидетельствуют, что предложенная композиция соответствует требованиям Государственной Фармакопеи РФ XIV, том II, предъявляемым к аэрозолям и спреям (ОФС.1.4.1.0002.15).

Было установлено, что все показатели остаются в пределах нормы.

Пример 3. Влияние средства по примеру 1 на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАР-киназ р38 в культуре клеток U937

Исследование проводилось в культуре моноцитов человека линии U937. Для индукции фосфорилирования использовали липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий Е. coli. Метод определения - иммуноблоттинг.

Оценка количества фосфорилированных форм МАР-киназы р38 в реализованной модели выявила, что средство оказывает ингибирующее действие на ЛПС-индуцированную активацию (фосфорилирование) МАР-киназы р38 в широком диапазоне концентраций от 0,00041 мкг/мл до 0,0025 мкг/мл (Фиг. 1). IC₅₀ субстанции ГПП составила 0,00133 мкг/мл или 1,33 нг/мл.

Пример 4. Влияние средства по примеру 1 на активность ферментов циклооксигеназа-1, циклооксигеназа-2 и 5-липоксигеназа.

Метод тестирования - иммуноферментный метод. Препарат сравнения индометацин.

Установлено, что средство по примеру 1 является специфичным ингибитором фермента ЦОГ-2. Средство по примеру 1 дозозависимо ингибирует активность фермента ЦОГ-2 в диапазоне концентраций 0,01-10 мкг/мл. При тестировании растворов большей концентрации наблюдали провоспалительную активность. IC50 составило 0,73±0,06 мкг/мл. Необходимо также отметить, что максимальное ингибирование для тестируемой субстанции получилось не более 70%. IC50 индометацина составило 0,25±0,03 мкг/мл. Снижение активности фермента ЦОГ-2 и, следовательно, снижение концентрации провоспалительных простагландинов и др. продуктов, может являться одним из механизмов противовоспалительного действия средства на основе ГПП.

Таким образом, данные примера 3 и 4 позволили установить, что средство по примеру 1 напрямую воздействует на патогенез гриппа, в основе которого лежит воспаление.

Пример 5. Влияние средства по примеру 1 в сравнении с референтными препаратами на течение экспериментального острого риносинусита, индуцированного формалином у крыс.

Индукцию воспаления вызывали путем интраназального введения 20 мкл в каждый носовой ход 7,5% раствора формалина. Препараты вводили в ежедневно в течение 7 дней.

Результаты представлены в таблицах 1 и 2 и на фигуре 2.

При обработке экспериментальных данных выявлены статистически значимые различия между экспериментальными группами по показателям «инфильтрация слизистой мононуклеарами», «инфильтрация слизистой лейкоцитами», «повреждение слизистых желез», «десквамация эпителия» «воспалительные изменения носовых ходов (ОКР и ОКГР)», а также «воспалительные изменениях в различных отделах (преддверие носа, обонятельная область и респираторный отдел)» (р<0,05). Установлено, что при тестировании средства по примеру 1 количество бокаловидных клеток снижается более чем в 2 раза по сравнению с патологией и сравнимо с действием референтных препаратов (Фиг. 2). Последующее множественное сравнение средних рангов исследуемых групп выявило статистически значимые различия по данным показателям у животных контрольной группы от животных интактной группы и животных, получавших средство по примеру 1 и референтные препараты в дозе 100 мкл/каждый носовой ход. Также по показателям «повреждение слизистых желез», «десквамация эпителия» «воспалительные изменения носовых ходов (ОКР; ОКГР)» и «воспалительные изменения в различных отделах (обонятельная область и респираторный отдел)» результаты исследования группы животных, получавших средство по примеру 1 в дозе 50 мкл/каждый носовой ход, отличались от контрольной группы крыс, получавших плацебо (таблицы 1 и 2). Достоверных отличий между результатами интактной группы животных и крыс, получавших средство по примеру 1 в дозах 50 и 100 мкл/каждый носовой ход и референтные препараты, не выявлено.

Таким образом, анализ гистологических препаратов показал у животных с модельной патологией развитие микроскопической картины острого катарального и острого катарально-гнойного риносинусита. Введение средства по примеру 1 в дозах 50 и 100 мкл/каждый носовой ход, как и референтных препаратов в дозе 100 мкл/каждый носовой ход, оказало положительное лечебное действие в отношении острого риносинусита, индуцированного формалином у крыс и приводило к излечиванию патологии.

Пример 6. Изучение специфической фармакологической активности средства по примеру 1 в сравнении с референтным препаратом на модели липополисахарид-индуцированного острого бронхита у крыс

Индукция воспаления путем эндотрахеального введения ЛПС в концентрации 1 мг/мл. Введение препаратов через 6 и 25 ч после индукции воспаления.

На модели ЛПС-индуцированного острого бронхита у крыс при введении, как средства по примеру 1 в дозах 50 и 100 мкг/кг, так и референтного препарата беклометазон в дозе 5,7 мкг/кг, было установлено статистически значимое дозозависимое снижение инфильтрации лейкоцитов за счет снижения популяции нейтрофилов в очаге воспаления (Фиг. 3).

По результатам морфометрии и гистологической оценки, введение средства по примеру 1 в дозах 50 и 100 мкг/кг, как и референтного препарата беклометазон в дозе 5,7 мкг/кг, оказало положительное лечебное действие в отношении острого бронхита, вызванного введением липополисахарида.

Таким образом, проведенные исследования специфической фармакологической активности средства по примеру 1 на модели ЛПС-индуцированного острого бронхита и острого синусита позволили сделать следующие выводы:

- средство по примеру 1 в дозах 50 и 100 мкг/кг обладает противовоспалительным действием;

- противовоспалительное действие средства по примеру 1 в дозе 100 мкг/кг по выраженности действия фармакологического эффекта сопоставимо с действием референтных препаратов.

Пример 7. Оценка фармакокинетики при однократном и многократном интраназальном введении средства по примеру 1 на крысах и кроликах.

Установлено, что после однократного введения средства по примеру 1 действующее вещество быстро проникает в слизистую носа и незначительно в кровь. При этом абсолютная биодоступность действующего вещества из исследуемого препарата составила более 80%. Фармакокинетика препарата является линейной в широком диапазоне для обоих видов животных.

Основной параметр, характеризующий степень биологической доступности препарата, AUC_0-t, а также максимальная концентрация C_max для крыс увеличиваются с увеличением дозы вводимого препарата. Для кроликов AUC_0-24, статистически значимо увеличивается с увеличением дозы вводимого препарата, C_max имеет тенденцию к увеличению, но различия статистически незначимы.

Время достижения C_max для кроликов составило 1,00-1,13 ч и не имеет статистически значимых различий, среднее время удержания (MRT) и период полувыведения (Т1/2) для крыс в плазме крови составили 4,63-9,53 ч и 2,63-6,73 ч, имеют статистически значимые отличия для максимальной дозы (200 мкг/кг) от минимальной (50 мкг/кг) и средней (100 мкг/кг) (Фиг. 4).

После введения средства по примеру 1 действующее вещество интенсивно распределяется в органы с различной степенью васкуляризации: наиболее интенсивное распределение наблюдается в ткани слизистой оболочки носа, являющиеся зоной введения и терапевтического действия препарата, а также сильно васкуляризированные органы (селезенка, надпочечники) (Фиг. 5).

Выведение препарата осуществляется с мочой (около 28%) и с калом - около 53%.

Многократное введение средства по примеру 1 в течение 7 дней в дозе 100 мкг/кг крысам привело к кумуляции действующего вещества, выраженной в статистически значимом повышении C_max и AUC_0-24, для остальных параметров статистически значимых различий после однократного и многократного введения препарата не обнаружено.