СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛОИДНОГО РАСТВОРА НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА С ЭКСТРАКТАМИ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ

Настоящее изобретение относится к биохимическим методам получения коллоидных растворов наночастиц серебра (Ag-НЧ) с использованием экстрактов листьев растений и может быть использовано в онкологии, косметологии и пищевой промышленности, при разработке биосенсоров, в микроэлектронике.

Известен способ получения наночастиц серебра [Патент 2477172 С1 (РФ) МПК B01J 19/00, В82В 3/00, C12N 15/63, B22F 9/24, 10.11.2011], характеризующийся тем, что культуру клеток растения перед получением экстракта каллуса предварительно трансформируют агробактериальным вектором Agrobacterium tumefaciens GV3101/pMP90RK/pPCV002/35S-LoSilAl-nos, содержащим ген силикатеина LoSilAl, который обеспечивает биосинтез мономорфных Ag-НЧ, приготавливают экстракт из каллуса путем растирания каллусной массы в воде с дальнейшим центрифугированием, смешивают экстракт каллуса с нитратом серебра, инкубируют раствор на шейкере с последующим центрифугированием.

Недостатком известного способа является наличие предварительной стадии модификации растения агробактериальным вектором Agrobacterium tumefaciens GV3101/pMP90RK/pPC V002/35S-LoSilAl-nos, который обеспечивает синтез Ag-НЧ. Природа указанного недостатка обусловлена тем, что рост растения определяется районом произрастания и климатическими факторами. Поэтому стадия предварительной модификации может зависеть от условий развития и роста растения, что может оказывать нежелательное влияние на размер и форму образующихся Ag-НЧ.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ синтеза наночастиц серебра, золота и цинка с использованием экстрактов семян растений [Patent 9.428.399 B1 (USA) Int. Cl. C01G 9/02 (2006.01) A61K 33/30 (2006.01) A61K 33/38 (2006.01) A61K 33/24 (2006.01) C02F 1/72 (2006.01) B22F 9/24 (2006.01) B22F 1/00 (2006.01) С22В 7/00 (2006.01) С22В 3/00 (2006.01) С22В 9/20 (2006.01) С22В 9/34 (2006.01) C02F 101/10 (2006.01) C02F 101/12 (2006.01) U.S. Cl. C01G 9/02 (2013.01), A61K 33/24 (2013.01), A61K 33/30 (2013.01), A61K 33/38 (2013.01), B22F 1/0018 (2013.01), B22F 1/0044 (2013.01), B22F 9/24 (2013.01), C02F 1/725 (2013.01), C22B 7/006 (2013.01), C22B 11/042 (2013.01), C22B 19/20 (2013.01), C22B 19/34 (2013.01), C02F 2101/10 (2013.01), C02F 2101/101 (2013.01), C02F 2101/12 (2013.01), C02F 2303/04 (2013.01), Y10S 977/773 (2013.01). Aug. 30, 2016], который в случае получения Ag-НЧ включает следующие стадии: около 15 мг семян растения Trigonella foenum-graecum (пажитник сенной - однолетнее растение семейства бобовых [Дудченко Л.Г., Козьяков А.С., Кривенко В.В. // Пряно-ароматические и пряно-вкусовые растения: Справочник / Отв. ред. К.М. Сытник. - Киев: Наукова думка, 1989. - С. 172]) замачивали в течение ночи в 30 мл дистиллированной воды, потом фильтровали полученный раствор для получения водного экстракта семян растения Trigonella foenum-graecum, около 5 мл экстракта были добавлены к 50 мл водного раствора нитрата серебра с концентрацией 0,001 моль/литр и затем перемешаны в течение 15 минут при 45°С; осуществляли восстановление ионов серебра экстрактом семян Trigonella foenum-graecum, которое приводит к образованию Ag-НЧ; контроль за протеканием процесса восстановления осуществляли по изменению окраски раствора от бесцветной до темно-коричневой; контроль формы и размеров образующихся наночастиц серебра проводили методом просвечивающей электронной микроскопии; функцию распределения Ag-НЧ по размерам определяли методом лазерного рассеяния света. Недостатками известного способа являются: для приготовления экстракта необходимо использовать семена растения Trigonella foenum-graecum, собранные в фазе зрелости [Дудченко Л.Г., Козьяков А.С., Кривенко В.В. // Пряно-ароматические и пряно-вкусовые растения: Справочник / Отв. ред. К.М. Сытник. - Киев: Наукова думка, 1989. - С. 172]. В зависимости от условий произрастания, образование семян растения Trigonella foenum-graecum, может происходить несколько раз в году, что может влиять на доступность субстрата и его качество; длительность процесса восстановления ионов серебра и образования Ag-НЧ.

Указанные недостатки обусловлены необходимостью получения наночастиц серебра, обладающих высокой антибактериальной активностью, низкими константами скорости реакции восстановления катионов серебра восстанавливающими агентами, выделившимися из семян растения Trigonella foenum-graecum.

Техническим результатом изобретения является упрощение процесса подготовки растительного экстракта для получения наночастиц серебра; упрощения технологии «зеленого» синтеза коллоидных растворов наночастиц серебра с экстрактами листьев растений.

Этот технический результат реализуется способом получения коллоидного раствора наночастиц серебра с экстрактами листьев растений, включающим замачивание листьев растения в дистиллированной воде, фильтрацию раствора с получением растительного экстракта, его смешение с водным раствором нитрата серебра, восстановление ионов серебра экстрактом с образованием наночастиц серебра Ag-НЧ, контроля размеров, формы и концентрации Ag-НЧ с помощью оптической спектрофотометрии, просвечивающей электронной микроскопии и лазерного светорассеяния, при этом в качестве листьев растения для приготовления растительного экстракта используют листья вечнозеленого тропического растения Murraya paniculata, водный раствор нитрата серебра берут в концентрации 1⋅10^-3÷5⋅10^-4 моль/л, фильтрование проводят с помощью ядерных фильтров в виде дисков диаметром до 60 мм из материала полиэтилентерефталат, толщиной 9÷11 мкм, средним размером пор 0,22÷0,50 мкм, поверхностной плотностью пор 10⁶÷10⁸ см^-2, а затем проводят восстановление ионов серебра экстрактом Murraya paniculata на воздухе при комнатной температуре под действием естественного освещения и вторично фильтруют вышеописанным фильтром с теми же характеристиками для извлечения образованных наночастиц серебра от полученного водного коллоидного раствора.

Пример №1.

В качестве субстрата для синтеза растительного экстракта использовали листья Murraya paniculata, вечнозеленого тропического растения, собранные в Мьянме. После измельчения 2,5 г навески обрезков высушенных листьев Murraya paniculata замачивали при комнатной температуре в 50 мл дистиллированной воды, затем фильтровали с помощью складчатого бумажного фильтра. Синтез Ag-НЧ проводили посредством добавления 50 мл водного раствора AgNO³ с концентрацией 5⋅10^-4 моль/л к 3 мл водного экстракта Murraya paniculata и последующего хранения полученного восстановительного раствора при комнатной температуре, на воздухе в отсутствие естественного света в течение 16 дней. Образования Ag-НЧ в заметных концентрациях не обнаружено (Фиг. 1, спектр 3).

Фиг. 1 Спектры оптического поглощения: (ось абсцисс - длина волны, λ, нм, ось ординат - оптическая плотность, OD) 1 - водный раствор 1⋅10^-3 моль/литр AgNO₃ после хранения в темноте на воздухе при комнатной температуре в течение 16 дней; 2 - растительный экстракт, полученный в результате замачивания 2,5 г тонко измельченных листьев растения Murraya paniculata в дистиллированной воде; 3 - раствор, полученный в результате смешения 50 мл водного раствора 5⋅10^-4 моль/л AgNO₃ с 3 мл растительного водного экстракта Murraya paniculata, после хранения в темноте на воздухе при комнатной температуре в течение 16 дней; 4 - восстановительный раствор, полученный в результате смешения 50 мл водного раствора 1⋅10^-3 моль/л AgNO₃ с 3 мл растительного экстракта Murraya paniculata, после хранения в условиях естественного освещения на воздухе при комнатной температуре в течение 2 дней. На вставке: аппроксимация спектральной формы полосы плазмонного резонанса Ag-НЧ во вновь синтезированном коллоидном растворе набором функций Гаусса (I-III), IV - результат аппроксимации.

Пример №2. В качестве субстрата использовали листья Murraya paniculata, собранные в Мьянме. После измельчения 1 г навески обрезков листьев Murraya paniculata помещали при комнатной температуре в дистиллированную воду. Синтез Ag-НЧ проводили посредством добавления 50 мл водного раствора AgNO₃ с концентрацией 1⋅10^-3 моль/л к 3 мл водного экстракта Murraya paniculata, и последующего хранения полученного восстановительного раствора при комнатной температуре, на воздухе при воздействии естественного света в течение 2 дней.

Обнаружено изменение окраски восстановительного раствора от светло-зеленой до желто-коричневой. В спектрах оптического поглощения наблюдали появление новой полосы в видимой области спектра 350-650 нм с максимумом при ~470 нм (фиг. 1, спектр 4). Сенсибилизация реакции восстановления ионов серебра достигается за счет поглощения естественного света органическими соединениями класса кумаринов и других биологически-активных веществ, выделившимися в раствор из листьев растения Murraya Paniculata [Aziz S.S.S.A., Sukari M.A., Rahmani M., Kitajima M., Aimi N., Ahpandi N.J. // The Malaysian Journal of Analytical Sciences. - 2010. - V. 14, No. 1. - pp. 1-5]. После фильтрации восстановительного раствора сквозь поры ядерного фильтра в виде дисков диаметром 59 мм из материала полиэтилентерефталат, толщиной 9 мкм, средним размером пор 0,22÷0,30 мкм, поверхностной плотностью пор 1⋅10⁶÷1⋅10⁷ см^-2, методом растровой электронной микроскопии был обнаружен осадок в виде слоя Ag-НЧ, распределенных по поверхности фильтра (Фиг. 2).

Фиг. 2 Изображения осадка из наночастиц серебра, синтезированных в объеме восстановительного раствора, полученного в результате смешения 50 мл водного раствора 10^-3 моль/литр AgNO₃ с 3 мл растительного водного экстракта Murraya paniculata, после хранения в условиях естественного освещения на воздухе при комнатной температуре в течение 2 дней, на поверхности ядерного фильтра на основе полиэтилентерефталатной пленки после фильтрации восстановительного раствора сквозь микропоры

Следовательно, природа полосы поглощения с максимумом ~470 нм может быть связана с плазмонным резонансом наночастиц серебра, образующихся в результате фотосенсибилизированного восстановления ионов серебра восстанавливающими агентами (предположительно - кумаринами и их производными) [Aziz S.S.S.A., Sukari М.А., Rahmani М., Kitajima М., Aimi N, Ahpandi N.J. // The Malaysian Journal of Analytical Sciences. - 2010. - V. 14, No. 1. - pp. 1-5]), выделившимися в дистиллированную воду из листьев растения Murraya paniculata.

Методами просвечивающей электронной микроскопии и лазерного светорассеяния было зарегистрировано образование многочисленных Ag-НЧ (Фиг. 3-5) преимущественно сферической и овальной формы размером от 5 нм до нескольких микрон (Фиг. 3). Максимум функции распределения Ag-НЧ по размерам соответствовал 25-30 нм (Фиг. 4, 5).

Фиг. 3 Изображение наночастиц серебра, синтезированных в объеме восстановительного раствора, полученного в результате смешения 50 мл водного раствора 1⋅10^-3 моль/л AgNO₃ с 3 мл растительного экстракта Murraya paniculata, после хранения в условиях естественного освещения на воздухе при комнатной температуре в течение 2 дней, зарегистрированных методом просвечивающей электронной микроскопии. Условия измерения указаны на рисунке

Фиг. 4 Изображения вновь синтезированных наночастиц серебра в объеме восстановительного раствора, полученного в результате смешения 50 мл водного раствора 1⋅10^-3 моль/л AgNO₃ с 3 мл растительного экстракта Murraya paniculata, после хранения в условиях естественного освещения на воздухе при комнатной температуре в течение 2 дней, зарегистрированные при проведении измерений методом лазерного светорассеяния.

Фиг. 5 Зарегистрированная методом лазерного светорассеяния функция распределения по размерам наночастиц серебра, полученных в объеме восстановительного раствора, полученного в результате смешения 50 мл водного раствора 1⋅10^-3 моль/л AgNO₃ с 3 мл растительного водного экстракта Murraya paniculata, после хранения в условиях естественного освещения на воздухе при комнатной температуре в течение 2 дней, до и после пропускания сквозь ядерный фильтр на основе полиэтилентерефталатной пленки со средним размером микропор 0,22 мкм.

Пример №3. В качестве субстрата для синтеза растительного экстракта использовали высушенные листья Murraya paniculata. После измельчения 2,5 г навески обрезков листьев Murraya paniculata помещали при комнатной температуре в дистиллированную воду, ставили на водяную баню для ускорения процесса извлечения. Полученный экстракт фильтровали через ядерные фильтры в виде дисков диаметром 60 мм из материала полиэтилентерефталат, толщиной 11 мкм, средним размером пор 0,5 мкм, поверхностной плотностью пор 1⋅10⁸ см^-2. Синтез Ag-НЧ проводили посредством добавления 50 мл водного раствора AgNO₃ (концентрации 1⋅10^-3 моль/л) к 3 мл водного экстракта Murraya paniculata, и последующего хранения полученного восстановительного раствора при комнатной температуре, на воздухе при воздействии естественного света в течение 2 дней. Зарегистрировано изменение окраски на темно-коричневую, методом оптической спектроскопии обнаружена новая полоса поглощения в видимой спектра с максимумом ~470 нм. После вторичной фильтрации восстановительного раствора сквозь поры ядерного фильтра с теми же характеристиками обнаружен осадок в виде слоя Ag-НЧ, распределенных по поверхности фильтра.

Таким образом, заявляемый способ получения коллоидных растворов Ag-НЧ относится к классу т.н. «зеленых» нанотехнологий, которые в настоящее время рассматриваются в качестве экологически безопасной и дешевой биохимической альтернативы традиционным физическим и химическим методам синтеза наночастиц серебра [Jackson Т.С., Patani В.О., Ekpa D.E. // Advances in Nanoparticles. - 2017. - V. 6. - pp. 93-102]. Проведение процесса на воздухе при комнатной температуре в условиях естественного освещения позволяет ускорить процессы восстановления катионов и образования Ag-НЧ по сравнению с реализацией рассматриваемой стадии в темноте.

Заявляемый способ позволяет решить поставленную задачу и достичь ожидаемого технического результата, а именно: упростить и удешевить процесс получения коллоидных растворов наночастиц серебра за счет замены дорогостоящих и не всегда доступных семян другими частями растений - листьями вечнозеленых тропических растений, произрастающих в естественных условиях, дешевых, не требующих особого ухода, доступных в любое время. Предлагаемый способ безотходен, основан на использовании естественного света, что позволяет уменьшить длительность всего процесса, а также значительно снизить затраты электроэнергии, исключив, например, СВЧ-обработку [Патент №2618270 С1 (РФ) МПК B22F 9/24 (2006.01), C01G 5/00 (2006.01), B01J 13/00 (2006.01), В82В 3/00 (2006.01), B82Y 30/00 (2011.01), B82Y 5/00 (2011.01), A61K 33/38 (2006.01), 07.10.2015].