Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis

Предлагаемое изобретении относится к области микробиологии и биотехнологии, микроскопическим грибам - продуцентам антимикробных соединений.

Борьба с возбудителем сибирской язвы в природных очагах ее распространения является важнейшей задачей по профилактике заражения бактериальной инфекцией человека и животных.

Основными средствами деконтаминации зараженной возбудителем почвы являются химические дезинфицирующие средства, которые имеют ряд недостатков санитарно-гигиенического и экологического характера (Федорова Л.С. Дезинфицирующие свойства хлорактивиых соединений и средств на их основе (обзор литературы) / Л.С. Федорова, И.М. Цвирова, А.С. Белова, Н.С. Левчук // Ж. Дезинфекционное Дело. - 2011. - №4. - С. 11-19) [1].

Известно, что в отношении бактерии В. anthracis наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладают культуры S. roseus, В. subtilis, Е. coli (Семенова С.А., Галиуллин А.К. Микробные антагонисты для биологической санации скотомогильников // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2010. - Т. 204. - С. 246-251) [2]. Недостатком применения данных микроорганизмов в качестве деконтаминационного средства является то, что эти условно-патогенные бактерии сами могут являться источниками оппортунистического загрязнения почвы.

Известны штаммы микроскопических грибов Trichoderma spp., обладающие антибактериальной активностью в отношении вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 (Шариков A.M. Выраженная антибиотическая активность грибов рода Trichoderma в отношении штамма В. anthracis СТИ-1 // Научная перспектива. - 2010. - №10. - С. 92-93) [3].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Т. hamatum F-11 (Патент РФ №2558293) [4], полученный в результате культивирования на жидкой питательной среде, фугат культуральной жидкости которого оказывает антимикробное воздействие на В. anthracis СТИ-1 (вакцинный штамм для иммунизации людей). Однако отсутствуют сведения о том, что этот штамм обладает антибактериальной активностью в отношении промышленного вакцинного штамма для иммунизации сельскохозяйственных животных В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ.

Микромицеты Т. atrobrunneum (телеморфа Т. harzianum Rifai) (J. Bissett. Accepted Trichoderma names in the year 2015 // Bissett J., Gams W., Jaklitsch W., Samuels G.J. IMA FUNGUS - 6 (2): 263-295 (2015)) [5] как антагонисты возбудителя сибирской язвы в литературных источниках в мире не известны.

Задачей изобретения является получение нового продуцента из рода Trichoderma spp.с выраженной антибактериальной активностью в отношении В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ.

Техническим результатом изобретения является новый штамм микромицета Trichoderma spp.с выраженной антибактериальной активностью в отношении В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ и культивированный в оптимизированной питательной среде, позволяющей обеспечить максимальный выход антимикробных соединений.

Поставленная задача и указанный технический результат достигается за счет того, что предложен штамм, Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis и депонированный в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером ВКПМ F-1434.

Штамм гриба Т. harzianum 14/1 получен как моноспоровый клон путем селекции на антимикробную активность из штамма Т. harzianum 14, выделенного из почвы Московской области (Россия).

Штамм Т. harzianum 14/1 идентифицирован как Т. atrobrunneum F.B. Rocha, P. Chaverri & W. Jaklitsch (2015) на основе секвенирования ITS1 и ITS2 участков генома и культурально-морфологическим признакам и депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером ВКПМ F-1434.

Штамм Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 относится к митоспоровым грибам - телеморфам Т. harzianum Rifai. аскомицетного аффинитета: рода Hypocrea, семейства Hypocreaceae, порядка Hypocreales, класса Sordariomycetes, отдела Ascomycota (www.indexfungorum.org).

Культурально-морфологические свойства

- культуральные свойства:

а) на диагностической среде Чапека при +25°С рост быстрый, край колонии неровный, мицелий паутинистый;

б) размер колонии 70-80 мм на 7-10 сутки;

в) воздушный мицелий скудный, паутинистый, до 2 мм в высоту, рыхлый, белого цвета на 7-10 сутки культивирования. Спороношение зеленое обильное, формирующееся концентрическими зонами на воздушном мицелии и в плотных подушечках;

г) цвет обратной стороны колонии - бесцветный;

д) пигмент и экссудат отсутствуют;

е) по мере старения гриб зарастает поверхность чашки Петри и обильно спороносит;

ж) на сусло-агаре колонии растут медленнее, но образуют обильный густой воздушный мицелий и обильно спороносят. На синтетическом обедненном агаре (SNA) колония растет быстрее (80 мм за 7 дней), воздушный мицелий практически отсутствует, спороношение формируется в неправильных подушечках.

- морфология:

а) мицелий септированный, тонкий, неокрашенный;

б) конидиеносцы древовидно разветвленные, формируются в плотных группах и на воздушном мицелии. Фиалиды собраны в группы по 2-5, с расширенной базальной часть и короткой узкой шейкой 5-6*3-5 мкм, терминальные фиалиды более вытянутые (до 10-12 мкм в длину);

в) конидии формируются в слизистых головках, почти шаровидные, яйцевидные 2,5-3,5*2,5-3,0 мкм, гладкие, зеленые;

г) - хламидоспоры не наблюдались. Молекулярно-генетические признаки.

Штамм имеет следующую последовательность, зарегистрированную в GenBank под шифром KJ665383.1:

Степень сходства нового штамма Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 с коллекционными штаммами составляет 98%, что указывает наряду с культурально-морфологическими свойствами его принадлежность к Т. atrobrunneum F.B. Rocha, P. Chaverri & W. Jaklitsch (2015)/

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, оптимальные температуры роста +24-28°С, рН 7,3. Штамм хорошо усваивает сахарозу, лактозу, глюкозу, фруктозу; минеральные и органические источники азота. Хорошо растет на средах, содержащих сахарозу. Длительность культивирования до массовой споруляции - 7 суток.

Антагонистические свойства.

Штамм гриба Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 обладает антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий: В. coagulans 33,4 мм, В. subtilis 23,5 мм, Е. coli АТСС 25922 22 мм, S. aureus АТСС 25923 12,2 мм по МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратом. Методические указания».

Штамм хранят на агаре Чапека в пробирках при температуре 5-6°С с периодическим пересевом (1 раз в 6-12 недель). Для длительного хранения используют методы лиофилизации и криоконсервирования.

Штамм является не патогенным и нетоксичным микроорганизмом.

Пример 1. Культивирование штамма на жидкой питательной среде.

Новый штамм Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 выращивали 5 суток при температуре +24-28°С в жидкой питательной среде следующего состава: сахароза 15 г/л, NaNO₃ 2 г/л, K₂HPO₄ 1 г/л, MgSO₄×7H₂O 0,5 г/л, KCI 0,5 г/л, FeSO₄ 0,01 г/л, рН7,3±0,2.

Из недельной агаровой культуры Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 готовили на физиологическом растворе суспензию с мутностью 1,5 по стандарту Мак-Фарленда. Засевали стандарт 1:10 в 100 мл жидкой среды Чапека в колбах Эрленмейера на 250 мл с ватно-марлевыми пробками, инкурибовали 5 суток на качалке при темперауре 28°С.

Засев культурой Т. atrobrunneum F-1434 производили из расчета 0,5% инокулята (v/v) к объему среды в реакторе. Выращивали культуру 5 суток при температуре 28,0±0,5°С, перемешивая с частотой 120 оборотов в минуту. В процессе работы ферментера осуществляли постоянный контроль и корректировку рН, температуры и скорости перемешивания, поддерживая значение на установленном уровне.

В качестве показателя продуктивности штамма гриба использовали значение сухого веса грибной биомассы. В результате культивирования штамма гриба получают культуральную жидкость со следующими значениями сухого веса грибной биомассы (г/л), в сравнении с получением культуральной жидкости продуцентом при культивировании на питательной среде, указанной в прототипе: соевая мука 30, дрожжевой экстракт 8, калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0 (г/л), рН 6,3 (табл. 1).

По показателю продуктивности (сухой вес биомассы гриба) предлагаемая питательная среда значительно превосходит среду прототипа на всех фазах роста продуцента Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434.

Полученную в результате культивирования штамма-продуцента культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получают фугат культуральной жидкости (ФКЖ), который используется для определения антибактериальной активности в отношении В. anthracis, 55 - ВНИИВВиМ.

Пример 2. Определение антибактериальной активности.

Вакцинный штамм В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ культивировали 1-2 суток при температуре +24°С. Суспензией суточной культуры с концентрацией 10⁶ КОЕ/мл инокулировали агар Мюллера-Хинтон по 0,2 мл, растирали шпателем и оставляли на 30 мин до полного впитывания в агар. Чашки с газоном инкубируют 1-2 суток при температуре 24±0,5°С.

Для определения антибактериальной активности испытывали две дозы ФКЖ (10 и 100 мкл), которые вносят в 4-х повторностях в лунки диаметром 5 мм на газон тест-культуры вакцинного штамма В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ. При этом применяли следующую шкалу активности: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм: низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

Для получения более информативных и достоверных данных в отношении активности штамма Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 использовали для сравнения действие ФКЖ штамма прототипа Т. hamatum F-11 против В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ (табл. 2).

* - ошибка измерения зоны подавления роста - 1-2 мм

Установлено, при дозах 10 мкл высокая активность ФКЖ отмечена для Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 и составляет 23-25 мм. Т. hamatum F-11 при дозе 10 мкл проявляет умеренную активность (17-19 мм).

При дозах 100 мкл высокая активность ФКЖ также отмечена для Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 и составляет 43-45 мм. Т. hamatum F-11 при дозе 10 мкл проявляет умеренную активность (31-34 мм).

Следовательно, ФКЖ штамма гриба Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 обладает высокой антибактериальной активностью при различных дозах его использования против В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ и может быть рекомендован в качестве продуцента биологического препарата.