Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии.

Противотуберкулезная химиотерапия токсична для организма человека и вызывает различные нежелательные побочные эффекты [1, 2, 3]. Основой мембран всех клеток организма, определяющей их структуру и функциональное состояние является липидный бислой. Любое изменение в составе мембран клеток отражается на липидном спектре плазмы крови и является чувствительным маркером патологических процессов происходящих в организме [RU 2184964, опубл. 10.07.2002].

Из уровня техники известен способ диагностики вирусной этиологии поражения печени [RU 2184964, опубл. 10.07.2002], который позволяет диагностировать вирусную этиологию поражения печени путем определения относительного содержания фракции лизофосфатидилхолина в сыворотке крови в пределах 5-7%.

Известен способ выявления токсического эффекта противотуберкулезной химиотерапии (Рясенский Д.С., Гришкина Н.А., Асеев А.В. Влияние туберкулезной инфекции и противотуберкулезной химиотерапии на липидный состав плазмы крови // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2018. – Т.3, №5. – С. 220-224), путем определения полного липидного и фосфолипидного спектра плазмы крови. Недостатком данного способа является высокая трудоемкость, связанная с необходимостью выделения и идентификации множества фракций как фосфолипидов, так и общих липидов. Кроме того, в данном способе не проводится выделение фракции токсичного лизофосфатидилхолина, а анализируется фракция суммарных лизофосфолипидов.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному решению является способ определения особенностей липидного спектра мембран моноцитов у больных туберкулезом легких до лечения и на фоне приема противотуберкулезных препаратов (Рясенский Д.С., Асеев А.В., Эльгали А.И. Особенности липидного спектра мембран моноцитов у больных туберкулезом легких до лечения и на фоне приема противотуберкулезных препаратов // Врач-аспирант. – 2017 – №6.4 (85) – С. 458-463), путем определения фосфолипидного спектра мононуклеаров периферической крови. Недостатками данного способа является то, что в данном способе не проводится выделение фракции лизофосфатидилхолина, а определяется суммарная фракция лизофосфолипидов. Так же в данном способе определяется липидный спектр мембран мононуклеаров, который не отражает состояние мембран других клеток организма.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение заключается в разработке способа, который позволил бы диагностировать мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии, отражающийся на изменении липидного состава мембран клеток и как следствие накопления лизофосфатидилхолина в плазме крови, на ранних сроках противотуберкулезной химиотерапии.

Технический результат заключается в повышении точности прогнозирования течения туберкулезного процесса, позволяющего назначить корригирующую терапию в конце интенсивной фазы противотуберкулезной химиотерапии при выявлении уровня относительного содержания лизофосфатидилхолина в плазме крови выше 12%.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии, включающем хроматографическое исследование липидного спектра плазмы крови, у больных туберкулезом легких, получающих противотуберкулезную химиотерапию, определяют относительное содержание фракции лизофосфатидилхолина плазмы крови и при значениях выше 12% диагностируют мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии. В случае выявления мембранодеструктивного эффекта больным назначают корригирующую терапию и тем самым повышают эффективность противотуберкулезного лечения.

Новыми ранее неизвестными признаками заявленного способа диагностики мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии являются:

1. Определение фракции лизофосфатидилхолина плазмы крови больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной химиотерапии.

2. Определение пределов значения фракции лизофосфатидилхолина плазмы крови у больных туберкулезом легких, получающих и не получающих противотуберкулезные препараты.

3. Разработан и предложен уровень содержания фракции лизофосфатидилхолина плазмы крови, выше которого диагностируют мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии.

Диагностику проводят путем хроматографического определения относительного содержания фракции лизофосфатидилхолина плазмы крови. Рассчитывают значение фракции лизофосфатидилхолина в процентах от суммы всех фракций фосфолипидов, выделенных из плазмы крови больного туберкулезом, получающего противотуберкулезную химиотерапию. При значениях фракции лизофосфатидилхолина более 12% диагностируют мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии.

Способ разработан на основе анализа данных фосфолипидного спектра плазмы крови 184 больных туберкулезом легких в конце интенсивной фазы химиотерапии (приём 60 доз комбинации противотуберкулезных химиопрепаратов).

Предлагаемый способ диагностики мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии осуществляют в следующей последовательности.

Кровь для исследования забирают в объеме 10мл, утром до завтрака из локтевой вены в вакуумную пробирку без наполнителя. В пробирки добавляют цитрат натрия 1 мл на 10 мл крови. Пробирки отстаивают при температуре 15°С в течении 120 мин, при этом цельная кровь разделяется на 2 слоя. Верхний слой отбирают и центрифугируют на скорости 7000 об/мин. Оставшиеся клеточные элементы оседают на дно центрифужной пробирки, а полученную плазму крови в объеме 3 мл используют для получения липидного экстракта. Экстракцию проводят в течение суток в 5 мл хлороформ-метаноловой смеси (1:2 по объему) при температуре 15°С. Для очистки от крупнодисперсных примесей экстракты центрифугируют на скорости 7000 об/мин в течении 15 мин. Далее к экстрактам приливают 0,02%-ный раствор хлорида кальция. Пробирки в течение 5 минут интенсивно встряхивают. После этого их центрифугируют в течение 5 мин на скорости 7000 об/мин. Содержимое пробирок разделяется на 2 фазы: хлороформенную и водно-метаноловую. Водно-метаноловую фазу удаляют. Для тонкослойной хроматографии фосфолипидов используют систему растворителей, состоящую из хлороформа, метанола и аммиака в соотношении 13,4:4,6:1. Составляющие смеси смешивают непосредственно перед хроматографией. Хроматографические пластинки используют с силикагелем размером частиц от 0,044 мм до 0,037 мм, что соответствует 350-400 меш. Длина пластинок не менее 20 см. Заполненной камере с хроматографической пластинкой дают насытиться в течение 10-15 мин. При хроматографическом разделении фосфолипидов используют непрерывное градиентное элюирование. Ток растворителей продолжают в течение 2,5 часов при температуре окружающей среды 30°С, добиваясь разделения минорных фракций лизофосфолипидов. После хроматографические пластинки извлекают и высушивают при температуре 30°С в течение 20 минут.

Для окрашивания хроматографических зон хроматографическую пластинку выдерживают в парах концентрированной серной кислоты, под действием которой при дальнейшем нагревании происходит обугливание липидов, содержащихся в хроматографических зонах. Для этого используют термостойкую стеклянную камеру размером 22х14х5 см. На дно камеры наливают 2 мл концентрированной серной кислоты и устанавливают параллельно друг другу стеклянные трубочки диаметром 8 мм. Камеру разогревают до 180°С, при этом она насыщается парами кислоты. Перед помещением в нее хроматографической пластинки последнюю также нагревают до 100°С. Через 20 минут хроматографические пластинки извлекают и сканируют в отраженном свете. Денситометрирование проводят с учетом интенсивности окраски фона по участку между хроматографическими зонами. Получают денситометрическую кривую описывающую распределение оптической плотности на участках хроматограммы соответствующих фракциям фосфолипидного спектра мононуклеаров периферической крови. Для расчета площади пиков с частичным наложением их друг на друга используют аппроксимацию. Рассчитанные площади пиков денситометрической кривой пропорциональны содержанию липидов в соответствующих фракциях. Для определения процентного содержания лизофосфатидилхолина сумма площади всех пиков денситометрической кривой делят на площадь пика соответствующего фракции суммарных лизофосфолипидов.

Исследование мононуклеаров периферической крови описанным способом позволило определить, что у 36 здоровых добровольцев (без диагностированной инфекционной или соматической патологии) уровень лизофосфатидилхолина находился в пределах от 8% до 9%. У больных туберкулезом легких (184 пациента) до назначения противотуберкулезной химиотерапии данный показатель находился в пределах от 6% до 7%. Назначение противотуберкулезной химиотерапии сопровождалось повышением относительного содержания лизофосфатидилхолина и его значения находились в пределах от 12% до 17%. Статистическая обработка полученных результатов у здоровых лиц и больных туберкулезом легких до лечения и после назначения противотуберкулезной химиотерапии и сравнение средних показывает достоверное увеличение относительного содержания лизофосфатидилхолина плазмы крови у пациентов получавших противотуберкулезную химиотерапию (p<0,05).

Предлагаемый способ позволяет диагностировать мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии при накоплении лизофосфатидилхолина в плазме крови свыше 12%.

Пример 1. Больной Григорьев Г.К. Диагноз: Инфильтративный туберкулез легких в фазе диссеминации, S1-S2. Диагноз подтвержден культуральным и рентгенологическим методами. Бациловыделение методом посева +, выявлена чувствительность МБТ к препаратам первого ряда. Проводимое лечение: основной курс химиотерапии по первому стандартному режиму. Химиотерапевтические препараты: изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол. До начала химиотерапии уровень лизофосфатидилхолина плазмы крови 6%. После проведения интенсивной фазы химиотерапии (60 доз комбинации препаратов) уровень лизофосфатидилхолина составил 12%, что позволяет диагностировать мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии и назначить корригирующую терапию.

Пример 2. Больная Косаткина Л.М. Диагноз: Очаговый туберкулез легких в фазе инфильтрации, S1-S2/S1. Диагноз подтвержден молекулярно-генетическим и рентгенологическим методами. Бациловыделение методом посева -, ПЦР мокроты +, выявлена чувствительность МБТ к изониазиду и рифампицину. Проводимое лечение: основной курс химиотерапии по первому стандартному режиму. Химиотерапевтические препараты: изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол. До начала химиотерапии уровень лизофосфатидилхолина плазмы крови 7%. После проведения интенсивной фазы химиотерапии (60 доз комбинации препаратов) уровень лизофосфатидилхолина составил 16%, что позволяет диагностировать мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии и назначить корригирующую терапию.

Пример 3. Больной Лобачев К.К. Диагноз: Очаговый туберкулез легких в фазе инфильтрации, S1-S2. Диагноз подтвержден молекулярно-генетическим и рентгенологическим методами. Бациловыделение методом посева +, ПЦР мокроты +, выявлена чувствительность МБТ к изониазиду и рифампицину. Проводимое лечение: основной курс химиотерапии по первому стандартному режиму. Химиотерапевтические препараты: изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол. До начала химиотерапии уровень лизофосфатидилхолина плазмы крови 6%. После проведения интенсивной фазы химиотерапии (60 доз комбинации препаратов) уровень лизофосфатидилхолина составил 7%, что позволяет диагностировать мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии. Специфическая корригирующая терапия не требуется.

Таким образом, у всех больных со значением фракции лизофосфатидилхолина в плазме крови свыше 12% была начата корригирующая терапия.

Изобретение может быть использовано в диагностических целях для раннего выявления мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии и определения показания к проведению корригирующей терапии.

Литература

1. Перельман М.И. Молекулярная медицина и лечение туберкулеза / М.И. Перельман, Ю.Н. Хомяков, В. И. Киселев и др. // Проблемы туберкулеза. – 2001. - № 5. – С. 5-7.

2. Маслаускене Т.П., Николаева С.В., Побочное действие противотуберкулезных препаратов // Сибирский медицинский журнал. -2005. - №3. – С. 13 – 19.

3. Есимова И.Е. Структурные особенности мембран и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в мононуклеарах крови при диссеминированном туберкулезе легких / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис и др // Фундаментальные исследования. – 2006. - №2. – С. 75 – 76.