Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИНТРАОКУЛЯРНОЙ РЕТИНОБЛАСТОМЫ

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для создания модели интраокулярной ретинобластомы у лабораторных животных (мышей).

Ретинобластома (РБ) - наиболее часто встречающаяся злокачественная внутриглазная опухоль, поражающая преимущественно пациентов раннего детского возраста и составляющая от 2 до 4% всех злокачественных новообразований детского возраста [Kaliki S, Shields CL. Retinoblastoma: achieving new standards with methods of chemotherapy. Indian J Ophthalmol. 2015; 63(2): 103-9.]. В последние годы в связи с выраженной химиочувствительностью клеток РБ отмечена тенденция перехода от лучевых к химиотерапевтическим методам лечения опухоли. К настоящему времени химиотерапия РБ относится к «золотому стандарту» лечения детей с данным новообразованием, а методы доставки химиотерапевтических агентов включают внутривенный, интраартериальный, периокулярный и интравитреальный. Выбор метода доставки химиотерапевтического агента зависит от поражения одного или обоих глаз опухолью (моно- или билатеральное поражение) и ее стадийности [Kaliki S, Shields CL. Retinoblastoma: achieving new standards with methods of chemotherapy. Indian J Ophthalmol. 2015; 63(2): 103-9.].

Вместе с тем поиск новых химиотерапевтических препаратов, путей их введения и возможных побочных эффектов диктует необходимость создания адекватной модели ретинобластомы in vitro и in vivo [Fazili N, Balagholi S, Amizadeh Y, Hosseini SB, Kanavi MR. Cultivation of Retinoblastoma Cells: Correlation Between In Vitro Growth Pattern and Histopathology. J Ophthalmic Vis Res. 2016; 11(4): 379-384.].

Известен способ моделирования ретинобластомы у лабораторных мышей, при котором иммунодефицитным животным в стекловидное тело вводят взвесь клеток известной культуры Y79, после чего отмечают рост опухоли в течение 3, 6, 9 и 12 недель (Tschulakow AV, Schraermeyer U, RodemannHP, Julien-Schraermeyer S. Establishment of a novel retinoblastoma (Rb) nude mouse model by intravitreal injection of human Rb Y79 cells. Biol Open. 2016 Nov 15; 5(11): 1625-1630.).

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ моделирования ретинобластомы, при котором лабораторным иммунодефицитным мышам породы BALB/c nude подкожно вводили ткань ретинобластомы, полученную непосредственно после выполнения энуклеации у пациента, с последующей морфологической верификацией полученной ткани опухоли (Aerts I, Leuraud Р, Blais J, Pouliquen AL, Maillard P, Houdayer C, Couturier J, Sastre-Garau X, Grierson D, Doz F, Poupon MF. In vivo efficacy of photodynamic therapy in three new xenograft models of human retinoblastoma. Photodiagnosis PhotodynTher. 2010 Dec; 7(4): 275-83). Недостатком ближайшего аналога является подкожное расположение опухолевого узла, что отличается от ее интраокулярной локализации у человека. Другим недостатком является использование ткани опухоли, полученной непосредственно после энуклеации. Применение получаемой после вскрытия глазного яблока опухоли связано с невозможностью дифференцировки опухолевых клеток и межклеточного окружения. Затруднен подсчет количества вводимых лабораторному животному опухолевых клеток и стандартизация предлагаемого способа моделирования ретинобластомы.

Задачей предлагаемого изобретения является создание адекватной экспериментальной модели интраокулярной ретинобластомы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение модели интраокулярной ретинобластомы у иммунодефицитных мышей, по клиническим и морфологическим характеристикам наиболее полно соответствующей ретинобластоме у человека.

Технический результат достигается за счет введения взвеси клеток первичной культуры ретинобластомы человека субретинально в глаза иммунодефицитных мышей, полученной из ткани ретинобластомы энуклеированного глаза и введенной после 12 пассажей.

Нами обследована и прооперирована группа иммунодефицитных мышей породы BALB/C nude. Взвесь первичной культуры ретинобластомы вводили в каждый из глаз исследуемых животных. Клеточная культура Rb10, полученная от больного ретинобластомой, на момент опытов прошла 12 пассажей. Культура Rb10 является адгезионной культурой.

Клетки первичной культуры ретинобластомы культивировали на среде RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HyClone, США). Для получения суспензии клеток из флаконов отбирали культуральную среду, отмывали остатки среды 5 мл раствора Версена (ПанЭко, Россия), добавляли 1 мл раствора трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия), инкубировали при комнатной температуре в течение 5-7 минут. Далее к клеткам добавляли 5 мл культуральной среды для инактивации трипсина, полученную взвесь центрифугировали при 1500 тыс оборотов/мин в течение 5 минут. Осадок клеток ресуспензировали в 1 мл физиологического раствора. Клетки 20 мкл окрашивали раствором трипанового синего для оценки количества живых клеток и подсчитывали в камере Горяева (Alekseeva ЕМ, Volkova IV, Losev IR, Lemenkov VA, Perevozchikov SM. [A unit for automatic blood cell counting]. MedTekh. 1996 Mar-Apr; (2): 32-3).

Использовали половозрелых иммунодефицитных мышей линии BALB/c Nude обоих полов. Данные мыши лишены волосяного покрова и имеют генетическую мутацию, проявляющуюся в недоразвитии или отсутствии тимуса, что приводит к подавлению иммунных функций и низкому числу Т-лимфоцитов. Указанная порода мышей применяется для научных исследований в связи с тем, что они переносят трансплантацию различных видов тканей и опухолевых ксенографтов, поскольку обладают сниженной реакцией отторжения трансплантата.

После введения суспензии животных наблюдали в течение 9 недель, после чего проводили клиническое (офтальмоскопия) и инструментальное (эхография) исследование с визуализацией опухолевых масс на глазном дне. После этого проводили эвтаназию с помощью внутримышечного введения препарата Золетил 50 в дозе, превышающей максимальную. Павшим животным проводили энуклеацию, после чего глаз заливали раствором формалина. Далее проводили вскрытие глазного яблока и морфологический анализ тканей глаза по стандартной методике. Модель ретинобластомы формировалась после 8 недель наблюдения у всех мышей.

Способ осуществляют следующим образом.

Осуществляют введение иммунодефицитным мышам линии BALB/c nude суспензии клеток первичной культуры ретинобластомы, полученной при энуклеации у больного с ретинобластомой. При этом используют культуру ретинобластомы после 12 пассажей. Суспензию вводят транссклерально в субретинальное пространство в объеме 0.3 мл из расчета 10000 клеток в 25 мкл физиологического раствора.

Пример. Половозрелой самке линии BALB/cnude (условный номер мыши 4) под наркозом (Золетил 50) субретинально введена взвесь первичной культуры ретинобластомы в объеме 0.3 мл из расчета 10000 клеток в 25 мкл физиологического раствора, полученная от пациента и прошедшая 12 пассажей. Через 9 недель по данным офтальмоскопии отмечено наличие белесоватых очагов на глазном дне, что подтверждено наличием опухолевой ткани по данным эхографии. После проведения эвтаназии, энуклеации и выполнения морфологического исследования выявлены опухолевые комплексы, аналогичные таковым у больных ретинобластомой. Опухолевые комплексы состояли из клеток округлой формы с округлым, слегка овальным ядром и гомогенно расположенным хроматином, узким ободком цитоплазмы с небольшими выростами. Данный опухолевой комплекс располагался над сетчаткой. На периферии данного комплекса определяли полнокровный сосуд.

Таким образом, способ позволяет получить адекватную модель интраокулярной ретинобластомы, которую можно использовать для различных исследований.