Результат интеллектуальной деятельности: Штамм О N2344/Монголия/2017 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики и специфической профилактики ящура типа О, для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур - высоко контагиозная вирусная болезнь домашних и диких парнокопытных животных. Относится к категории трансграничных болезней, способных преодолевать границы между государствами, вызывать эпизоотии с тяжелыми экономическими и социальными последствиями. Ящур относится к особо опасным трансграничным заболеваниям животных и подлежит обязательной нотификации. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. [1, 6].

Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus. Различают семь серотипов вируса: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3. В пределах каждого типа существует множество генетических вариантов вируса. Опасность болезни обусловлена высокой изменчивостью и генетическим разнообразием вируса, множественностью путей передачи инфекции, узкой специфичностью иммунитета у животных в пределах одного серотипа.

Возбудитель ящура в пределах одного серотипа обладает значительной антигенной изменчивостью штаммов, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях, и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков. Изменения, которые сохраняются в последующем поколении, становятся постоянными и отражаются в модификации нуклеотидной последовательности генома вируса [6, 7, 8].

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого изолята, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Изменения антигенных свойств природного изолята вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. При этом затрудняется штаммоспецифическая диагностика полученных изолятов вируса ящура. Проблема отбора и подготовка новых производственных штаммов вируса ящура является одной из главных в системе мер профилактики ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны производственные штаммы вируса ящура типа О, ранее использовавшиеся для специфической профилактики ящура на территории России:

Известен штамм типа О №1734/Приморский/2000, выделенный 13.04.2000 г. от свиней в ОПХ «Степное» с. Элитное Уссурийского района Приморского края [2, 4].

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм О №1734/ Приморский/2000 принадлежит к Паназиатской генетической линии вируса ящура типа О. Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе во Вьетнаме, Японии, Корее, Монголии, а также Армении и Грузии [4]. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 г. также была вызвана паназиатским вирусом. Производственный штамм №1734 О/Приморский-2000-ДЕП ранее использовался в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.

В период с 2014 по 2018 гг. в Южной Корее, Китае, на территории Российской Федерации вспышки ящура типа О были вызваны вирусом топотипа Юго-Восточная Азия, относящимся к генетической линии Муа-98 [7].

Известен производственный штамм вируса ящура типа О №2212/Приморский/2014. Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2212/Приморский/2014, был выделен в мае 2014 года от больной свиньи в ООО «Мерси Трейд» с. Прохоры Спасского района Приморского края [5, 8].

В декабре 2017 г. в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был доставлен изолят вируса ящура типа О, отобранный на территории Монголии от крупного рогатого скота.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к генетической линии Ind-2001 вируса ящура типа О и значительно отличается от производственного штамма вируса ящура типа О генетической линии PanAsia-2, входящего в состав вакцины, применяемой для профилактики ящура на территории Российской Федерации.

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и Монголией, особенно в пограничных районах Забайкальского края, Еврейского автономного округа, Хабаровского края, вероятность риска заноса ящура на территорию России остается очень высокой. В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического изолята вируса ящура серотипа О для обеспечения безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств от возбудителя ящура, генетической линии О Ind-2001.

Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов.

Указанная проблема решена путем получения штамма вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Изолят вируса ящура, послуживший источником для получения штамма ВЯ типа О №2344/Монголия/2017, был выделен в ноябре 2017 года от больных ящуром КРС, находящихся на территории Монголии (экспертиза №2344). Производственный штамм ВЯ типа О №2344/Монголия/2017 получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017 депонирован в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): №116 - деп / 19-6 - КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма ВЯ типа О №2344/Монголия/2017 для изготовления средств диагностики и профилактики ящура типа О.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма ВЯ О №2344/Монголия/2017 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2344/Монголия/2017 вируса ящура типа О;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2344/Монголия/2017 вируса ящура типа О.

Штамм О №2344/Монголия/2017 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм ВЯ О №2344/Монголия/2017 типа О относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм ВЯ О №2344/Монголия/2017 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма ВЯ О №2344/Монголия/2017. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм ВЯ О №2344/Монголия/2017 принадлежит к генетической линии Ind-2001 топотипа Ближний Восток - Южная Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ О №2344/Монголия/2017 с производственными штаммами вируса ящура O₁ Manisa; О №1734/Приморский/2000; О PanAsia-2; О №2147/Приморский/2012 и О №2212/Приморский/2014 изучено в РМН.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) составило для O1 Manisa - 0,45; О№1734/Приморский/2000 - 0,46; О PanAsia2 - 0,47; О №2147/Приморский/2012 - 0,74 и О №2212/Приморский/2014 - 0,24.

При значении r₁>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются антигеннородственными. При значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма.

Биотехнологические характеристики

Штамм вируса ящура тип О №2344/Монголия/2017 репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21/2-17). В течение 19-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 5,48 до 6,25 lg ТЦД₅₀/см³. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено и хемотаксономическая характеристики

Штамм О №2344/Монголия/2017 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм вируса ящура О №2344/Монголия/2017 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма ВЯ О №2344/Монголия/2017 в перевиваемой культуре клеток IBRS-2, ПСГК-30, ВНК-21/2-17. Для определения биологической активности проводили титрование вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток IBRS-2.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в декабре 2017 года от подозреваемого в заболевании ящуром КРС.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [3].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение и адаптацию вируса ящура.

Выделение вируса проводили на перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК - 21/2-17 с последующей адаптацией (5 пассажей). Перевиваемые культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию предварительно обрабатывали 10% раствором хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД культур клеток. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 19-24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята О №2344/Монголия/2017 к различным клеточным линиям наступала на уровне 5 пассажей. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017.

Инактивированный материал исследовали в РСК и ИФА на наличие антигена вируса ящура, при этом использовали типоспецифические сыворотки для серологических реакций и «Набор для выявления антигена вируса ящура в ИФА», производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2344 выявлен в РСК антиген вируса ящура типа О в разведении 1:2.

Проведена проверка штамма на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Пример 2.

Оценка биологических свойств штамма вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017 при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17.

Штамм вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017 репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17. В качестве поддерживающей среды использовали раствор Эрла без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,007-0,05 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование вируса осуществляли при температуре 35-37°С. Цитопатическое действие вируса, соответствующее 90-95%, достигалось через 19-21 ч. После этого репродукцию вируса ящура прекращали, полученную суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Концентрация 146S компонента вируса ящура в суспензии составляла 1,96-2,42 мкг/см³ в зависимости от пассажа. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма вируса ящура О №2344/Монголия/2017 отражены в таблице 4, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток BHK-21/2-17, равной 2,98±0,15 млн клеток/см³, дозе заражения 0,007-0,05 ТЦД₅₀/клетка и продолжительности репродукции вируса 20,10±0,28 ч титр инфекционной активности возбудителя ящура находился в диапазоне 6,00-6,50 lgТЦД₅₀/см³ (среднее значение - 6,25±0,05 lgТЦД₅₀/см³), концентрация 146S компонента 86,24±1,08%.

Пример 3.

Исследование влияния инактивации и очистки антигенного материала штамма О №2344/Монголия/2017 с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и общий вирусный белок) компоненты вируса ящура.

По окончании цикла репродукции вируса, не прекращая процесса термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии составляла 0,025-0,050%. Инактивацию вируса ящура проводили в течение 16-24 часов при температуре 36-37°С и рН 7,2-7,6. Остаток аминоэтилэтиленимина нейтрализовали добавлением тиосульфата натрия. Для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов в суспензию вносили 10%-ный раствор полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ) до концентрации 0,005-0,007%. Флокулированные балластные примеси подвергали седиментации с последующей декантацией.

Результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и общий вирусный белок) компоненты штамма вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017 отражены в таблице 5.

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что концентрация 146S компонента штамма вируса ящура типа О №2344/Монголия/2017 снижается с 2,07±0,10 мкг/см³ (после окончания культивирования вируса) до 1,69±0,10 мкг/см³ (после окончания процесса инактивирования).

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм О №2344/Монголия/2017 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О»:

1. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

2. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1734 «Приморский-2000» / В.К. Спирин, А.И. Егорова, С.Р. Кременчугская [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 52-57.

3. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

4. Пат. РФ №2204599, C12N 7/00, A61K 39/135, 20.05.2003 г.

5. Пат. РФ №265068, C12N 7/00, A61K 39/125, G01N 33/569, 17.04.2018 г.

6. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИИТИБП, 1998, С. 532-548.

7. Филогенетический анализ изолятов вируса ящура, выявленных на постсоветском пространстве и в Монголии в 2016 году/ A.M. Тимина, Н.Г. Зиняков, А.В. Щербаков, Д.А. Лозовой // Ветеринария сегодня. - 2017. - №4. - С. 3-8.

8. Филогенетическая характеристика изолятов вируса ящура типа О, выделенных в Российской Федерации / Д.А. Лозовой, А.В. Щербаков, В.М. Захаров, С.Н. Фомина // Ветеринария. - 2018. - №5. - С. 3-8.