Результат интеллектуальной деятельности: Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Canicola серовара canicola для детекции антител к L. canicola

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя лептоспироза, обладающий выраженной антигенной и иммуногенной активностью и используемый как тест-штамм для детекции антител к L. canocola.

В Российской Федерации лептоспироз регистрируется повсеместно. Ежегодно в России выявляется от 1,5 до 2,5 тысяч заболеваний людей этой инфекцией. Она имеет большую социально-экономическую значимость для страны из-за тяжести течения и наличия отдаленных клинических последствий (Топорков В.П., Величко Л.Н. Динамика заболеваемости лептоспирозами в федеральных округах Российской Федерации // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - Вып. 96. - С. 22-25; Баталова В.В., Каршин С.П., Веревкина М.Н. Суспензионный антигенный лептоспирозный диагностикум // Ветеринарная патология. - 2016. - №1. - С. 35-42.). Лептоспироз, вызванный возбудителями серогруппы Canicola наряду с иктерогеморрагическим, относится к категории тяжело протекающих зооантропонозных инфекций с высокой частотой летальных исходов (Стоянова Н.А., Бадра Б., Токаревич Н.К. и др. Эпизоотическая ситуация по лептоспирозу и ее эпидемические проявления в условиях Санкт-Петербурга / Диагностика, профилактика и лечение лептоспироза людей и животных. -М., 2007. С. 63-64; Ананьина Ю.В. Лептоспирозы людей и животных: тенденции распространения и проблемы профилактики // Эпидемиология и Вакцинопрофилактики. - 2010. - №2. - С. 13-16.)

Для лептоспироза характерен полиморфизм клинических проявлений в связи, с чем клиническая диагностика затруднена, особенно на ранних днях болезни, поэтому лабораторные методы исследования имеют решающее значение (Киселева Е.Ю., Бренева Н.В., Носков М.Б., Балахонов С.В., Гефан Н.Г. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов: особенности постановки, преимущества и недостатки // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2015, №3 (103), С. 85-93).

В серологической диагностике реакция микроагглютинации (РМА) остается «золотым стандартом». Для выявления антител в РМА рекомендован диагностический набор лептоспир (Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами: методические указания МУ 3.1.1128-02. / Москва; Минздрав России, 2002.), в котором для определения антител к L. canocola рекомендован эталонный штамм Hond Utrecht IY, выделенный в Голландии от собаки в 1931 году. Этот штамм был выбран за прототип. К недостаткам данного штамма можно отнести: во-первых, потерю ряда антигенных свойств в результате длительного (более 80 лет) культивтрования на искусственной питательной среде (Самохвалов А.П. Антигенные и иммуногенные свойства лептоспир в зависимости от сроков выделения // Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных: материалы Всесоюз. конф. - Львов, 1988. - С. 211.). Во-вторых, возможная гетерогенность антигенных свойств штаммов лептоспир выделенных на отдаленных друг от друга географических территориях.

Изобретение направлено на получение тест-штамма для выявления антител к L. canicola.

Разработанный штамм позволит осуществлять выявление антител к L. canicola в крови людей и животных, диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией лептоспир серогруппы Canicola на территории России.

Технический результат: обеспечение наиболее эффективного выявления антител к L canicola, циркулирующих на территории России за счет выделения предлагаемого штамма на данной территории, выраженных антигенных свойств предлагаемого штамма «Хавизов» и использования его для серологической диагностики лептоспироза.

Полученный штамм Leptospira interrogans серогруппы Canicola серовара canicola №344 «Хавизов» выделен из крови человека больного тяжелой клинической формой лептоспироза в Санкт-Петербурге в 2014 году. Штамм депонирован в Международной коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика НФ. Гамалеи под номером 519.

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные спирохеты с характерной морфологией и подвижностью, спор и капсул не образуют. Относятся к хемоорганотрофам и гидрофилам, культивируются на жидкой питательной среде. Лаг-фаза длится двое суток, экспотенциальная фаза характеризуется продолжительностью в 7 суток, время генерации 20 ч. В стационарной фазе наибольшая концентрация составляет (5,3±0,3)×10⁷ лептоспир в 1 мл. Культивируются на жидкой фосфатно-сывороточной среде Терских, состоящей из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 10% сыворотки кролика. Оптимальная температура культивирования - 28°С.

Генетические характеристики. На основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16sRNA заявленного штамма, полученной в ходе секвенирования по Сенгеру, путем сравнения с известными нуклеотидными последовательностями, доступными в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). выявлено сходство с идентичностью 99% с нуклеотидной последовательностью гена 16SrRNA геномовида Leptospira interrogans, что позволяет отнести штамм к данному геномовиду.

Антигенные свойства: реакция микроагглютинации с сывороткой к L. Canicola положительная в разведении 1:51200.

По сравнению со штаммом аналогом в настоящем изобретении предлагается свежевыделенный штамм L. Canicola, выделенный на территории России. Известно, что «свежевыделенные штаммы лептоспир обладают наиболее выраженной антигенной активностью нежели штаммы, выделенные 10-30 лет тому назад»

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Способ получения штамма

Штамм получен путем посева крови больного лептоспирозом человека на жидкую питательную фосфатно-сывороточную среду Терских, состоящую из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 5% сыворотки кролика. Культивирование штамма осуществлялось при температуре - 28°С в течение 10 суток, с последующим определением серологической принадлежности и генотипированием штамма, изучением его биологических свойств.

Пример 2. Способ применения штамма

Для постановки РМА используют живую культуру L. canicola, выращенную на среде Терских с добавлением сыворотки кролика, со сроком культивировавния 7-14 суток. Культура должна иметь хорошую подвижность, накопление 5×10⁷ клеток на 1 мл, что соответствует 50-100 лептоспирам в поле зрения микроскопа при увеличении ×400.

Исследуемую сыворотку разводят и титруют в физиологическом растворе, начиная с 1:50 с последующим двукратным разведением. Разведенную сыворотку и живую культуру L. canicola смешивают в равных объемах по 50 мкл в лунках полистироловых планшет. После экспозиции в течение 30 минут при комнатной температуре производят учет реакции.

Пример использования штаммов Hond Utrecht IY и «Хавизов» для выявления антител к L. canicola в крови больных лептоспирозом людей в Санкт-Петербурге представлен в таблице.

Таблица 1. Сравнение эффективности предлагаемого штамма и прототипа для выявления антител к L. Canicola.

Предлагаемый штамм, по сравнению с прототипом, позволяет выявлять антитела к L. canicola в более высоком разведении сывороток (более высокие титры антител).

Таким образом, заявленный штамм пригоден для детекции антител к L. canicola, что позволит диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией лептоспир серогруппы Canicola на территории России.