Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROVAR TYPHI B-8453 С УСТОЙЧИВОСТЬЮ НИЗКОГО УРОВНЯ К ФТОРХИНОЛОНАМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ШТАММА ДЛЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРЮШНОГО ТИФА

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике брюшного тифа: на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости низкого уровня к фторхинолонам) и молекулярных исследований (определение механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA).

По литературным данным, в различных странах мира выделяют штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, устойчивые к фторхинолонам за счет мутаций в хромосомном гене gyrA. Большинство зарубежных штаммов имеют устойчивость низкого уровня к фторхинолонам, обусловленную одной мутацией вида Ser83Phe. Штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенные в других странах, не могут быть ввезены и использованы в качестве контрольных штаммов при диагностике брюшного тифа в РФ. На территории РФ штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующиеся устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам, обусловленной мутацией в хромосомном гене gyrA вида Ser83Tyr, ранее не обнаружены, не изучены и не депонированы.

При диагностике брюшного тифа необходимо проводить постоянный контроль качества различных этапов исследования, в том числе при определении чувствительности штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к существующим антимикробным препаратам, использующимся для лечения брюшного тифа в качестве препаратов первого выбора (фторхинолонов). Для разработки новых фторхинолонов для лечения брюшного тифа необходимо точно установить механизмы устойчивости к антибиотикам молекулярными методами. Для контроля качества этих этапов исследования требуются контрольные штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi с известным уровнем устойчивости к фторхинолонам и известным механизмом устойчивости (мутациями в хромосомных генах).

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенный в Африке, который, как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения, характеризуется устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам (Al-Emran НМ, Eibach D, Krumkamp R, et al., A Multicountry Molecular Analysis of Salmonella enterica Serovar Typhi With Reduced Susceptibility to Ciprofloxacin in Sub-Saharan Africa. Clin Infect Dis. 2016; 62 Suppl l (Suppl l):S42-6). Однако штамм-аналог имеет мутацию в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и не может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов именно с такой мутацией. Но у штаммов S.Typhi, выделяемых в РФ, такая мутация практически не встречается.

Предлагаемый в качестве изобретения штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 помогает преодолеть эти ограничения, поскольку характеризуется двумя свойствами, позволяющими использовать его как контрольный штамм (устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам и мутацией в хромосомном гене gyrA вида Ser83Tyr) и может быть использован в качестве контрольного штамма при диагностике брюшного тифа в РФ.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, необходимого для обеспечения достоверной диагностики и лечения брюшного тифа.

Авторами получен контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi для контроля качества различных этапов лабораторной диагностики брюшного тифа, с устойчивостью низкого уровня к фторхинолонам и мутацией Ser83Tyr в гене gyrA.

Заявляемый штамм выделен от больного брюшным тифом, идентифицирован до вида Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi бактериологическими и серологическими методами. Устойчивость низкого уровня к фторхинолонам установлена стандартизованными методами диско-диффузионным и градиентных концентраций; наличие и вид мутации в гене gyrA определено при анализе данных полногеномного секвенирования штамма на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8453.

Характеристика штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 3 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, растет на питательных средах (агар Эндо, висмут-сульфит-агар, гектоен-агар, XLD-arap, агар Плоскирева) при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя характерные для бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi колонии.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм относится к группе O9 (D), серовару S.Typhi и имеет антигенную формулу 9,12,Vi:d:.

Основные свойства штамма:

1. Устойчивость низкого уровня к фторхинолонам:

- минимальная подавляющая концентрация налидиксовой кислоты более 256,0 мг/л, диаметр зоны задержки роста - 6 мм;

- минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина - 0,19 мг/л;

- диаметр зоны задержки роста вокруг диска с пефлоксацином - 18 мм. Стабильность свойств штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 (диаметров зон задержки роста и значений минимальных подавляющих концентраций) подтверждена путем повторения в течение 7 дней процедуры определения чувствительности к фторхинолонам диско-диффузионным методом и методом градиентных концентраций с агаром Мюллера-Хинтон, дисков и полосок с антибиотиками различных производителей: Oxoid (Великобритания), BioRad (США), HiMedia (Индия) и НИЦФ (Россия). Штамм давал стабильные результаты на агарах, дисках и полосках всех производителей при тестировании в течение 7 дней.

2. Молекулярный механизм устойчивости к фторхинолонам: одна мутация Ser83Tyr в QRDR-регионе хромосомного гена gyrA. Стабильность наличия мутации Ser83Tyr в геноме контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности, а также повторным исследованием штамма методом ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления флуоресцентного зонда после хранения штамма в течение 6 мес при -70°С в криосреде.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S. Typhi к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам диско-диффузионным методом проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течение 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали диски, пропитанные антибиотиками - налидиксовая кислота, 30 мкг и пефлоксацин 5 мкг. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали результат путем измерения зоны задержки роста культуры вокруг дисков с антибиотиками, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: диаметр зоны задержки роста вокруг диска с налидиксовой кислотой - 6 мм, вокруг диска с пефлоксацином -18 мм и относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам.

Пример 2. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S. Typhi к антимикробным препаратам методом градиентной диффузии.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам методом градиентной диффузии проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течение 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали градуированные полоски, пропитанные антибиотиками в градиенте концентраций: налидиксовая кислота - от 0,016 мг/л до 256,0 мг/л и ципрофлоксацин - от 0,002 мг/л до 32,0 мг/л. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали значение концентрации в месте пересечения эллипсовидной зоны задержки роста штамма с полоской, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: значение минимальной подавляющей концентрации налидиксовой кислотой составляло более 256,0 мг/л (полное отсутствие зоны задержки роста вокруг полоски), ципрофлоксацина - 0,19 мг/л. Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам, уровень устойчивости расценивался как низкий.

Пример 3. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA по данным полногеномного секвенирования.

Детекцию мутаций в QRDR-регионе хромосомного гена gyrA проводили путем анализа данных полногеномного секвенирования. Выделение ДНК из исследуемых штаммов контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit для выделения ДНК из тканей, мазков, крови и биологических жидкостей (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество и количество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5хТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле, а также используя спектрофотометр QIAxpert при длине волны 260 нм. Подготовку библиотек проводили с использованием набора для подготовки библиотек Nextera DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera Index Kit и сменных крышек, магнитных частиц AMPure ХР Beads согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США). Поиск мутаций в хромосомных генах, отвечающих за устойчивость к фторхинолонам, у исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили с помощью веб-сервера ResFinder Датского Технического Университета, куда загружали данные в формате fasta. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проявлял заявленные свойства: в хромосомном гене gyrA стабильно обнаруживалась одна мутация вида Ser83Tyr.

Пример 4. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA методом ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления флуоресцентного зонда.

Выделение ДНК из исследуемых штаммов и контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 проводили с использованием набора InstaGene Matrix (BioRad, США) согласно инструкции производителя. Регион гена gyrA амплифицировали с помощью специфических праймеров STGYRA1 и STGYRA12-GT (содержал внутренний гаситель флуоресценции) и флуоресцентно-меченного зонда. В состав 25 мкл ПЦР-смеси входили 2,5 ед. TaqF ДНК-полимеразы с буфером (Интерлабсервис, Россия), 2 мМ MgS0₄ и 3 мкл бактериальной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (BioRad, США) согласно протоколу: начальная денатурация 95°С -15 мин; затем 35 циклов: 95°С -15 сек, 55°С -20 сек; финальная инкубация - 37°С - 3 мин. Анализ кривых и температуры плавления зонда проводили после завершения амплификации путем регистрации его флуоресценции при увеличении температуры на 1°С каждые 10 сек в диапазоне от 37°С до 75°С. О наличии мутаций в гене gyrA судили по снижению Тm зонда по сравнению с референтным штаммом, чувствительным к фторхинолонам, а также при сравнении значений Тm референтных штаммов с известными мутациями (Ser83Phe, Ser83Tyr, Asp87Asn). Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 имел значение Tm ниже, чем чувствительный референтный штамм. Значение Тm контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 соответствовало Tm референтных штаммов, имеющих мутации в 83 кодоне гена gyrA. Стабильность наличия мутации в геноме контрольного тест-штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 подтверждалась повторным проведением исследования на приборе другого производителя RotorGene 200 (Corbett Research, Австралия) с использованием для амплификации реагентов производства АлкорБио (Россия).

Для обеспечения достоверной диагностики брюшного тифа необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8453 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать два этапа диагностики: этап определение чувствительности и устойчивости низкого уровня возбудителя к фторхинолонам двумя фенотипическими методами, а также этапа определения механизма устойчивости (мутации в гене gyrA вида Ser83Tyr) молекулярными методами.