Способ экспресс-диагностики пневмококковой инфекции при риносинуситах

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может найти применение в клинической практике врачей оториноларингологов для быстрого установления пневмококковой этиологии риносинуситов и назначения адекватной, ранней лекарственной терапии.

Термин «риносинусит» объединяет группу воспалительных заболеваний полости носа и околоносовых пазух (ОНП). Актуальность проблемы острого риносинусита (ОРС) обусловлена не только широкой распространенностью этого заболевания, но и склонностью его к рецидивирующему течению, а также развитию серьезных осложнений. ОРС - один из наиболее распространенных диагнозов в амбулаторной практике. По данным Бюро медицинской статистики Департамента здравоохранения г. Москвы, распространенность синуситов составляет 1420 случаев на 100000 взрослого населения (1). Согласно статистике, в России данное заболевание переносят около 10 млн. человек в год, а в структуре ЛОР - стационаров данная патология составляет от 15 до 36% (2).

Осложнения острого бактериального риносинусита (ОБРС) в целом встречаются относительно редко, однако, в большинстве своем, отличаются тяжелым течением. Патогенез данных осложнений напрямую связан с анатомией и физиологией синусов и прилегающих к ним структур. Осложнения могут быть следствием как прямой, так и гематогенной диссеминации инфекции и включают следующие позиции: инфекции глазницы и периорбитальной области, внутричерепные абсцессы, тромбоз кавернозного синуса, менингит, сепсис.

Этиопатогенез ОРС преимущественно обусловлен риногенным инфицированием ОНП через естественные соустья, посредством которых осуществляются аэрация и дренирование пазух (3). Пусковым моментом развития ОРС, как правило, является вирусная инфекция, при которой ОНП поражаются почти в 90% случаев. Исследования последних лет показали, что основными возбудителями ОРС являются респираторные вирусы (риновирусы, респираторно-синцитиальные, аденовирусы, коронавирусы). Под воздействием вируса эпителиальные клетки полости носа и ОНП теряют реснички, вследствие чего нарушается мукоцилиарный клиренс, способствующий очищению пазух, и серозный экссудат скапливается в просвете синусов. Развивается воспалительная реакция, приводящая к блоку соустья и нарушению аэрации. Все это приводит к продлению времени контакта патогенных бактерий со слизистой оболочкой синусов и способствует бактериальному инфицированию с развитием острого бактериального риносинусита.

По данным многочисленных исследований, основным возбудителем бактериального ОРС является Streptococcus pneumoniae и реже Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis (4, 5, 1).

В настоящее время серьезной проблемой клинической практики является разграничение вирусного и бактериального ОРС. Это разграничение необходимо для выбора правильной тактики лечения, снижения частоты необоснованного применения антимикробных препаратов и связанного с этим риска хронизации процесса, а также развития и распространения антибиотикорезистентности возбудителя. По современным данным, ОБРС встречается в 2-10% случаев, и это особенно важно учитывать при выборе адекватного этиотропного лечения с назначением противовирусной или системной антибактериальной терапии (3).

Известен классический бактериологический способ диагностики ОБРС - «Золотой стандарт» - включающий выделение бактерий в высокой концентрации (более 10⁴ КОЕ/мл) из материала, полученного при пункции синуса пациента с подозрением на ОБРС. Однако пункция ОНП - достаточно травматичная манипуляция, которая должна проводиться по строгим показаниям (5). Существенным отрицательным моментом классического бактериологического метода является инвазивный способ забора образца, трудоемкость и продолжительность микробиологического исследования - 48-72 часа с момента получения исследуемого материала. При этом широкое распространение практики применения антибактериальных препаратов заболевшими до обращения за медицинской помощью значительно снижает результативность бактериологического метода (6).

Наиболее близким к заявленному решению аналогом является способ выявления возбудителя пневмококковой инфекции у здоровых носителей, а также больных острым средним отитом в носоглоточном секрете, с применением иммунохроматографической коммерческой тест-системы Binax Now производства Alere Scarborough, Inc., США (11). Данный метод предполагает выявление пневмококкового антигена в носоглотке у детей, колонизированных S. pneumoniae. Материал от пациента забирается тампоном из носоглотки и тестируется в тест-системе Binax Now в соответствии с инструкцией. Отличием заявленного решения от данного метода является то, что заявленный способ экспресс-диагностики применяется при риносинусите и предполагает использование строго определенного образца для исследования, полученного из глубоких отделов носоглотки. Также следует учесть, что мазки из среднего носового хода всегда контаминированы микрофлорой полости носа, которая зачастую не соответствует микрофлоре пораженной пазухи носа (особенно при наличии блока соустья), поэтому мазки из носоглотки, взятые тампоном, не пригодны для этиологической диагностики риносинусита (2, 13). Такое же мнение высказано в современных зарубежных публикациях: для установления бактериологической причины инфицированного синуса, необходимо получить образец секрета, не загрязненный оральной флорой или флорой слизистых дыхательных путей (14). Частота носительства S. pneumoniae в детской популяции достигает 15-30% (12). Однако обнаружение пневмококка в носоглотке не означает этиологическую обусловленность риносинусита.

Техническим результатом заявленного решения является повышение достоверности выявления пневмококковой инфекции у больных риносинуситом при незначительных затратах времени и возможности диагностирования на первичном приеме врачом оториноларингологом.

Технический результат достигается тем, что в способе экспресс - диагностики пневмококковой инфекции при риносинуситах выявление возбудителя пневмококковой инфекции выполняется с применением иммунохроматографической коммерческой тест-системы Binax NOW производства Alere Scarborough, Inc., США определяющей наличие антигена Streptococcus pneumoniae в исследуемом секрете. Взятие материала для исследования производится из глубоких отделов носоглотки, вплотную прилегающих к области верхнечелюстного синуса, с помощью зонда, вводимого на глубину 10-15 см и электроотсоса. Затем стерильный вискозный тампон погружают в секрет, полученный из глубоких отделов носоглотки пациента и устанавливают в нижнее отверстие (ячейка для тампона) внутренней правой панели тест-карты Alere Binax NOW. После закапывания буферного, запускающего реакцию раствора (реагента А) тест-карту герметично закрывают. Через 15 минут результат реакции «антиген-антитело» регистрируют в окошке для чтения результатов. В случае присутствия антигенов пневмококка в секрете (положительная реакция) в окошке тест-системы считываются две окрашенные линии -линия контроля и линия пробы.

Выявление возбудителя пневмококковой инфекции с применением иммунохроматографической коммерческой тест-системы Binax NOW производства Alere Scarborough, Inc., США, показывающей наличие антигена Streptococcus pneumoniae в исследуемом секрете в виде двух окрашенных полос в окошке для чтения тест-системы, позволяет ускорить процесс, сократить его до 10-15 минут с получением достоверного результата, позволяющего своевременно и целенаправленно проводить специфическую антибактериальную терапию и избегать многочисленных осложнений.

Способ экспресс-диагностики пневмококковой инфекции при риносинуситах осуществляют следующим образом.

Материалом для исследования служит носоглоточное содержимое, полученное во время эндоскопического обследования пациентов или полученное без эндоскопии. Методика забора материала из глубоких отделов носоглотки была разработана врачом отоларингологом Смышляевым Д.Е. [7, 8]. Методика заключается в следующем: эндоскоп вводят в полость носа на 7-15 см после предварительной анестезии носовых ходов 10% раствором лидокаина. После эндоскопического осмотра проводят забор материала - для этого одновременно с эндоскопом или отдельно от него в полость носа на ту же глубину вводят одноразовый стерильный подключичный катетер. С наружной стороны к катетеру присоединяют электроотсос и отсасывают слизь из носоглотки. Затем катетер, заполненный слизью, удаляют из полости носа и к наружному концу катетера подсоединяют стерильный одноразовый шприц, содержащий 2 мл стерильного физиологического раствора. Нажимая на поршень шприца, промывают катетер физиологическим раствором, одновременно выдавливая субстрат в стерильную пробирку. Полученные пробы готовы для исследования.

Для проведения экспресс-диагностики стерильный тампон на палочке из набора тест-системы Alere Binax NOW погружают в подготовленный секрет, находящийся в пластиковой пробирке. Затем вынимают тампон и помещают в тест-кассету и добавляют 3 капли реагента А (цитратно-фосфатного буфера с лаурил-сульфатом, Твином-20 и азидом натрия) из прилагающейся пластиковой капельницы. Устройство закрывают для создания капиллярного потока, чтобы привести исследуемый образец в контакт с тест-полоской. При наличии в образце антигена S. pneumoniae происходит его связывание с находящимися на подложке специфическими антителами окрашенного конъюгата, и этот окрашенный комплекс антиген-конъюгат связывается за счет наличия антигена с иммобилизованными на мембране кроличьими антителами к антигену S. pneumoniae, формируя окрашенную линию в зоне чтения результата. Иммобилизованные на полоске в виде линии козьи антитела против IgG кролика (контрольная линия) также связывают окрашенный конъюгат подложки, формируя вторую окрашенную линию. Положительный результат регистрируют через 10-15 минут по наличию двух окрашенных линий (опыт и контроль) от розового до пурпурного цвета в зоне чтения теста. На отрицательный результат указывает одна окрашенная контрольная линия, свидетельствуя о том, что тест выполнен надлежащим образом, но антиген S. pneumoniae в тестируемом образце не обнаружен.

Для обоснования использования иммунохроматографической коммерческой тест-системы Binax NOW производства Alere Scarborough, Inc., США для экспресс-диагностики пневмококковой инфекции при риносинуситах проведена оценка скринингового теста системы Alere Binax NOW для верификации возбудителя в носоглоточном секрете пациентов. При этом результаты исследования сравнивали с результатами другого лабораторного метода, принятого в качестве «Золотого стандарта». Методом сравнения выбран классический бактериологический метод.

Для определения диагностической способности теста Alere Binax NOW параллельно двумя методами было проведено исследование 100 проб носоглоточного секрета в целях обнаружения антигена S. pneumoniae.

Результаты сравнительного исследования носоглоточного секрета больных риносинуситом классическим бактериологическим методом и иммунохроматографическим методом (ИХМ) представлены в таблице 1.

Пневмококк бактериологическим методом был выявлен у 16 больных (16%), в том числе в монокультуре, а также в ассоциации с Moraxella catarrhalis и Haemophilus influenzae.

Пневмококк не выделен в 84 пробах, в том числе в 50 случаях выявлены другие бактериальные возбудители (М. catarrhalis, Н. influenzae, S. aureus, Streptococcus spp.), в 34 случаях вообще не были выявлены бактериальные агенты.

Пневмококк иммунохроматографическим методом выявлен в 20 случаях (20%), в том числе из 16 проб, подтвержденных классическим методом, S. pneumoniae выявлен у 14 пациентов, в 4 случаях выявлен в группе проб «другие бактериальные возбудители» и в 2 случаях в группе «бактериальные возбудители не выявлены».

Для расчета достоверности скринингового теста мы использовали два основных критерия информативности (чувствительность и специфичность) и три вспомогательных критерия информативности (точность, прогностичность положительного результата и прогностичность отрицательного результата (9).

1. Чувствительность - способность диагностического метода давать правильный результат, который определяется как доля истинных положительных результатов среди всех проведенных тестов, т.е. вероятность положительного результата (выявления S. pneumoniae) у лиц с пневмококковым риносинуситом;

2. Специфичность - способность диагностического метода не давать при отсутствии патологии ложноположительных результатов, т.е. вероятность отрицательного результата (отсутствие выявления S. pneumoniae) у лиц без пневмококковой инфекции;

3. Прогностичность положительного результата - частота его совпадения с заболеванием и, таким образом, показывает вероятность наличия S. pneumoniae при риносинусите при положительном результате теста;

4. Прогностичность отрицательного результата - частота его совпадения с отсутствием пневмококковой инфекции, вероятность отсутствия S. pneumoniae при отрицательном результате теста. Данный критерий, таким образом, показывает насколько велика вероятность того, что пациент не имеет пневмококковой инфекции, если результата исследования отрицательный.

5. Точность - показывает, сколько всего правильных результатов получено в ходе применения данного метода.

Оценку перечисленных показателей осуществляли с использованием четырехпольной таблицы по методу и формулам, изложенным в учебном пособии В.И. Покровского и Н.И. Брико (9) (таблица 2).

Показатель чувствительности теста составил 87,5%, специфичности - 92,9%, что совпадает с данными, полученными другими исследователями при верификации пневмококковых пневмоний ИХМ Binax NOW при исследовании проб мочи (79,3% - чувствительность, 93,3% - специфичность (6, 10). Прогностическая ценность положительного результата ИХМ, указывающая на вероятность того, что пациент на данный момент действительно болен пневмококковой инфекцией и врач может с большей уверенностью считать, что положительный результат теста подтверждает предполагаемый диагноз - 70%). Прогностическая ценность отрицательного результата, то есть вероятность того, что при негативном результате теста у пациента отсутствует пневмококковая инфекция - 97,5%. Точность теста (доля правильных результатов) определена в пределах 92%.

В медицинской диагностике оптимальным методом исследования признается тот, который был бы априорно как высоко специфичен, так и высоко чувствителен. Методики диагностики с высокой чувствительностью редко «пропускают» пациентов, у которых имеется болезнь, а методики с высокой специфичностью не относят здоровых к категории больных.

Таким образом, разработанный нами способ экспресс-диагностики пневмококковой инфекции при риносинуситах, характеризуется высокими критериями информативности и может быть рекомендован для широкого использования в практике здравоохранения.

Высокий процент прогностической ценности отрицательного результата дает врачу уверенность в том, что отрицательный результат исследования отвергает наличие пневмококковой инфекции у пациента с ОБРС.

Литература:

1. Кривопалов А.А. Риносинусит: классификация, эпидемиология, этиология и лечение // Медицинский совет, 2016., №6., с. 22-25.

2. Свистушкин В.М., Шевчик Е.А. Острый риносинусит - современный взгляд на проблему // РМЖ, 2014., №9, с. 643-647.

3. Лопатин А.С. Антибиотикотерапия острых воспалительных заболеваний околоносовых пазух // Consilium medicum, 2003., Т. 5.,№4., с. 1-8.

4. Лучихин Л.А., Полякова Т.С. Диагностика и лечение острого синусита // РМЖ, 2018., №8(1)., https://www.rmj.ru.ixi/articles/antibiotiki/Diagnostika_i_lehenie_ostogo_sinusita/#ixzz5P4Uniuhl

5. Каманин Е.И., Козлов Р.С., Веселов А.В. Острый бактериальный риносинусит // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2008., Т. 10., №1., с. 43-54.

6. Николенко В.В., Фельдблюм И.В., Воробьева Н.Н., Голоднова C.O., Семериков В.В., Подушкина А.В., Павроз К.А. Опыт использования иммунохроматографического теста для диагностики пневмококковой пневмонии // Журнал микробиология, 2015., №3., с. 18-24.

7. Бондаренко А.П., Смышляев Д.Е. Риносинуситы. Этиология, опыт бактериологических исследований // Дальневосточный журнал инфекционной патологии, 2007., №10, с. 100-104.

8. Бондаренко А.П., Смышляев Д.Е. Методические приемы бактериологического исследования при риносинуситах // Дальневосточный журнал инфекционной патологии, 2008., №12, с. 232-233.

9. Покровский В.И., Брико Н.И. Общая эпидемиология с основами доказательной медицины: руководство к практическим занятиям // ГЭОТАР - Медиа. - 2012. - 496 с.

10. Athlin S, et al. The Binax NOW Streptococcus pneumoniae test applied on nasopharyngeal aspitates to support pneumococcal aetiology in community- acquired pneumoniae // Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 2013, Jun: 45(6): 425-431.

11. Faden H., et al. New Technique (the NOW Test) for Rapid Detection of Streptococcus pneumoniae in the Nasopharynx // Jornal of Clinical Microbiology, 2002, Vol. 40(12), 4748-4749. DOI: 10.1128/JCM.40.12.4748-4749.2002.

12. Баранов А.А., Брико Н.И., Намазова-Баранова Л.С., Ряпис Л.А. Стрептококки и пневмококки. Руководство для врачей. Ростов-на-Дону: Феникс.2013. 302 с.

13. Ivanchenko OA, Karpishchenko SA, Kozlov RS et al. The microbiome of the maxillary sinus and middle nasal meatus in chronic rhinosinusitis // Rhinology, 2016, Vol. 54(1): 68-74. doi:10.4193/Rhinl5.018.

14. Lorenzo Drago, Lorenzo Pignataro, Sara Torretta Microbiological Aspects of Acute and Chronic Pediatric Rhinosinusitis // J Clin Med., 2019, Vol 8(2): 149. doi: 10.3390/jcm8020149