Способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в сложных биологических матрицах организма человека

Изобретение относится к хроматографическому анализу различных химических соединений и может быть использовано в медицине, биологии, экологии и допинговом контроле для идентификации наркотических и психоактивных веществ в биосубстрате, в качестве которого используют, преимущественно, волосы и ногтевые срезы пациента, подэкспертного лица или трупа. Методы анализа: газовая и жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием. Масс-спектрометрические детекторы:

Известен способ выявления и определения происхождения неизвестных веществ в спиртных напитках [RU 2392616, C1, G01N 30/02, 20.06.2010], при котором готовят пробу исследуемого напитка, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание компонентов сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик объекта, при этом, дополнительно готовят смесь стандартных веществ, и на ее основе готовят ряд модельных образцов путем введения стандартной смеси в интактный образец в разных концентрациях и анализируют образцы с известным введенным содержанием компонентов при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, и при обнаружении в модельном образце неизвестное вещество квалифицируют как артефакт, образующийся при анализе, а при отсутствии его в модельных образцах готовят контрольный образец путем объединения всего ряда модельных образцов, анализируют его также при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и при отсутствии в контрольном образце найденного неизвестного вещества его квалифицируют как маркер идентификации.

Недостатком способа является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в суррогатных спиртсодержащих жидкостях или биологических объектах, содержащих летучие яды.

Известен также способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психотропные вещества [RU 241788, С2, G01N 30/02, 27.09.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры образца, и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание вещества сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик веществ, при этом, готовят три пробы исследуемого образца биологической жидкости - первую путем экстракции с перерастворением, вторую путем кислотного гидролиза и третью путем ферментативного гидролиза, причем, первую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 15°С/мин и данные анализируют путем сравнения с базой данных, по которой выявляют признаки неизвестного вещества (НВ), а именно - спектры с m/z, совпадающими с базовыми ионами наркотического или психотропного вещества или метаболитов, и содержание (НВ) в пробе, вторую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 25°С/мин и третью пробу подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин и при увеличении содержания НВ в последних двух пробах по сравнению с первой, подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин базовое наркотическое или психотропное вещество на присутствие в нем НВ, и при его отсутствии в базовом веществе, проверяют присутствие НВ в интактной биологической жидкости, для чего пробу ее готовят путем кислотного гидролиза и подвергают ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин и в случае обнаружения НВ в интактной биологической жидкости его квалифицируют как эндогенное, а при отсутствии признаков аликвоту первой пробы смешивают с пробой интактной биологической жидкости, готовят пробу путем кислотного гидролиза смеси, подвергают пробу ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин, определяют содержание НВ по результатам обоих режимов анализа и сравнивают его с содержанием НВ в первой пробе и при совпадающих значениях содержания НВ в указанных трех пробах квалифицируют НВ как новый, ранее неизвестный продукт метаболизма базового наркотического или психотропного вещества.

Недостатком этого способа также является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов.

Кроме того, известен способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических жидкостях [RU 2390771, С12, G01N 30/86, 27.05.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, пропускают ее через хроматографическую колонку с неподвижной жидкой фазой и регистрируют сигналы детектора в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, при этом готовят две аликвоты пробы исследуемого образца - нативную и дериватизированную и каждую из них пропускают через колонку, по меньшей мере, в двух режимах кондиционирования параметров изменением градиента температуры, и, дополнительно, каждую из указанных аликвот пропускают через колонку с разделением потока при тех же режимах кондиционирования, далее регистрируют сигналы детектора на хроматограммах, выбирают на них пики со значениями асимметрии на 0,1, 0,5 и 0,6 высоты пика от основания ≤1,05, как наиболее соответствующие биномиальному распределению плотности вероятности и недеформированные влиянием фоновых компонентов, и идентифицируют определяемые вещества по отобранным пикам сопоставлением с эталонными аналитическими характеристиками определяемых веществ.

Недостатком этого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения неизвестных веществ в организме человека на основе исследований его биологических жидкостей. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека или в условиях отсутствия его биологических жидкостей.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в волосах и срезах краев ногтевых пластин [Савчук С.А. и др. Дифференциация поверхностных загрязнений в объемных содержаний психоактивных веществ в волосах и срезах краев ногтевых пластин. Наркология. 2015, №3, с. 72-80], согласно которому готовят образец биологического объекта человека и осуществляют его масс-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала детектора масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества.

Наиболее близкое техническое решение обладает относительно малой достоверностью в условиях, когда возможны случайные попадания психоактивных веществ на биосубстрат, а также в случае загрязнения лабораторной посуды, присутствия фона прибора от предыдущих исследований и т.п.

Особенностью таких биосубстратов, как волосы и ногтевые пластины, является то, что они имеют сходное строение. Поверхностные слои обоих видов структур (кутикула) таких биосубстратов - чешуйчатые, рыхлые. Это отмирающие кератиновые слои, которые постоянно обновляются за счет роста внутреннего кератинового слоя (кортекса). Необходимые элементы для обновления приходят с кровотоком. Мелкие капиллярные кровеносные сосуды питают луковицу волоса и соответствующие структуры ногтевых пластин. Интересующие нас ксенобиотики, включая стимуляторы, наркотические и лекарственные вещества (преимущественно психоактивные) приходят также с кровотоком, "встраиваются" в кератиновые матрицы и фиксируются в ней. В рыхлых приповерхностных слоях эта фиксация слабеет и целевые вещества покидают поверхность волос и ногтевых пластин легко, тогда как из глубины их извлечь трудно, вследствие хорошей фиксации.

Психоактивные вещества могли попасть на поверхность волос или ногтевых пластин извне случайно. Например, если кто-то рядом курил каннабис или спайсы и целевые вещества в виде аэрозолей могли попасть на поверхность волос или ногтевых пластин человека, который не употреблял подобные вещества. При плохой фиксации веществ в кутикуле они смываются вместе с поверхностными загрязнениями. Поэтому целесообразно делать несколько последовательных смывов и проводить последовательный предварительный масс-спектрометрический анализ. С каждым смывом интенсивность целевого вещества должна уменьшаться и окончательно быть незначительной. После чего можно применять методы активного извлечения и при их положительном результате, существенно превышающим предварительные надежно судить о наличии в организме таких веществ.

Задачей, которая решается в изобретении, является разработка способа идентификации наркотических и психоактивных веществ с использованием таких биообъектов человека, как волосы и ногти, с целью расширения арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ, с одновременным повышением достоверности результатов идентификации.

Требуемый технический результат заключается в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека, с одновременным повышением достоверности результатов идентификации.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе, согласно которому готовят образец биосубстрата человека и осуществляют его первое предварительное масс-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала детектора масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, согласно изобретению, после проведения первого предварительного масс-спектрометрического исследования последовательно проводят еще N последующих предварительных масс-спектрометрических исследований, перед каждым из которых образец биосубстрата промывают метанолом, при этом, после проведения предварительных масс-спектрометрических исследований измельчают образец биосубстрата человека до состояния до долей миллиметров и проводят заключительное масс-спектрометрическое исследование, причем, если при последовательном проведении предварительных масс-спектрометрических исследований наблюдается последовательное уменьшение массы анализируемых веществ и существенное увеличение их массы при заключительном масс-спектрометрическом исследовании, то принимают решение об идентификации этих веществ в биосубстрате человека.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, число (N+1) предварительных масс-спектрометрических исследований равно 6.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, при масс-спектрометрическом анализе используют один пластиковый флакон емкостью 50 мл, а при промывке образца биосубстрата внесение и отбор метанола из пластикового флакона используют разовые дозаторы.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, при предварительном масс-спектрометрическом анализе принимают во внимание принадлежность каждого пика анализируемого вещества при сравнении с эталонной аналитической характеристикой этого вещества при уменьшения его массы при последующем предварительном анализе относительно предыдущего предварительного анализа не менее 10%.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, о существенном увеличении массы анализируемого вещества при заключительном масс-спектрометрическом анализе судят относительно того вещества, масса которого при заключительном масс-спектрометрическом анализе превышает массу при последнем предварительном анализе не менее, чем на 100%.

На графических материалах представлены:

на фиг. 1 - хроматограмма по полному ионному току (А) и по выбранному иону m/z 126 (Б), соответствующему PVP и масс-спектр PVP (В), детектированный в волосах пациента Т;

на фиг. 2 - хроматограмма по полному ионному току (А) и по выбранному иону m/z 126 (Б), соответствующему PVP и масс-спектр PVP (В), детектированный в ногтевых срезах с пальцев рук пациента Т;

на фиг. 3 - хроматограмма по полному ионному току (А) и по выбранному иону m/z 126 (Б), соответствующему α-PVP и масс-спектр α-PVP (В), детектированный в ногтевых срезах с пальцев ног пациента Т.

Способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в сложных биологических матрицах организма человека реализуется следующим образом.

Предварительно готовят образец биосубстрата человека и осуществляют его первое предварительное масс-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала детектора масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества.

После проведения первого предварительного масс-спектрометрического исследования последовательно проводят еще N последующих предварительных масс-спектрометрических исследований, перед каждым из которых образец биосубстрата промывают метанолом, при этом, после проведения предварительных масс-спектрометрических исследований измельчают образец биосубстрата человека до состояния до долей миллиметров и проводят заключительное масс-спектрометрическое исследование, причем, если при последовательном проведении предварительных масс-спектрометрических исследований наблюдается последовательное уменьшение массы анализируемых веществ и существенное увеличение их массы при заключительном масс-спектрометрическом исследовании, то принимают решение об идентификации этих веществ в биосубстрате человека.

Экспериментально подтверждено, что достаточным объемом смывов является N=5, что соответствует 6 предварительных масс-спектрометрических исследований. При масс-спектрометрическом анализе используют один пластиковый флакон емкостью 50 мл, а при промывке образца биосубстрата внесение и отбор метанола из пластикового флакона используют разовые дозаторы для исключения мешающего фона при исследованиях. Кроме того, при сравнении с эталонной аналитической характеристикой этого вещества при уменьшения его массы при последующем предварительном анализе относительно предыдущего предварительного анализа не менее 10%, а о существенном увеличении массы анализируемого вещества при заключительном масс-спектрометрическом анализе судят относительно того вещества, масса которого при заключительном масс-спектрометрическом анализе превышает массу при последнем предварительном анализе не менее, чем на 100%.

Примеры реализации способа.

Хромато-масс-спектрометрическое исследование биообъектов на наличие токсичных и сильнодействующих веществ органического происхождения.

Задача исследования: провести исследование волос и ногтевых пластин пациента Т. на наличие наркотических средств, психотропных веществ, сильнодействующих или ядовитых веществ, а также лекарственных средств методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) и методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Для исследования были использованы волосы и ногти пациента Т.

Пробоподготовка образцов волос. Из пяти пакетов отбирали по 3-5 г волос. Анализировали объединенную пробу. Для этого от каждого образца отбирали по 100 мг волос и помещали в пластиковый флакон.

Пробоподготовка образцов срезов краев ногтевых пластин. Ногтевые пластины объединяли и измельчали. Анализировали 100 мг объединенной пробы, которую помещали в пластиковый флакон.

Исследования выполнялись на хроматографе с масс-селективным детектором мод. «Маэстро» Agilent Technologies 7820/5975N с колонками НР-5MS.

Условия анализа: газ-носитель гелий, скорость потока через колонку 2 мл/мин. Программа: 50°С (0.5 мин) 99°С /мин 100°С (1 мин) 15°С/мин 280°С (30 мин). Режим ввода пробы: splitless (без деления потока).

Условия масс-спектрометрического детектирования:

Анализ в режиме сканирования по полному ионному току (SCAN)

Температура источника ионов 230°С

Температура анализатора 150°С

Диапазон масс m/z 29-650 а. е. м.

Напряжение на умножителе: результат, полученный при автоматической настройке по перфторбутиламину в режиме ATUNE + 100 кВ.

В режиме скринингового анализа выполняли определение 2444 наркотических и сильнодействующих веществ.

Условия хроматографирования: хроматограф газовый Agilent 7890А с масс-селективным детектором Agilent 5975С, капиллярная кварцевая колонка HP-5MS 30 m, 0.25 mm, 0.25 um, газ-носитель - гелий марки А, постоянный поток 1,2 мл/мин. Объем вводимого образца 1 мкл, без разделения потока. Температура инжектора 270°С, интерфейса 280°С.Программа термостата колонок: 1 минута при 100°С, подъем температуры до 300°С со скоростью 35 град/мин, выдержка 10 минут при 300°С.Задержка на пик растворителя 3 мин. Регистрация масс-спектров в режиме сканирования полного сканирования (TIC).

Идентификацию проводили с помощью программы AMDIS, библиотека масс-спектров SUDMED_2444_AMDISLIB_2444.

Аппаратура ВЭЖХ-МС/МС Shimadzu 8050. Детектирование в режиме полного сканирования продукт-ионов прекурсор-ионов m/z 232 (PVP) и 234 (PVP M-dihydro).

Параметры источника ионизации (Source Parameters): температура осушающего газа (DL Temp) 250°С, температура нагреваемого газа (Heating Gas Flow) 300°С, поток осушающего газа (Drying Gas Flow) 10.0 1/min, поток нагреваемого газа (Heating Gas Flow) 10.0 1/min, поток через распылитель (Nebulizing gas flow): 3.0 1/min, напряжение на капилляре (Capillary) 3000 V.

Элюент А: Деионизованная вода (HPLC grade), 0.1% муравьиной кислоты, 2 mM формиата аммония, 1% ацетонитрил.

Элюент В: Ацетонитрил (HPLC grade), 0.1% муравьиной кислоты, 2 mM формиата аммония, 1% деионизованной воды.

Условия градиентного режима подачи элюента представлены в таблице.

Результаты анализа волос, срезов краев ногтевых пластин с пальцев рук и пальцев ног пациента Т., полученные методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием представлены на фиг. 1 - фиг. 3.

Сравнение интенсивностей пика пиррролидинвалерофенона (α-PVP) в исследуемом объекте

По результатам анализа волос методом ГХ-МС, PVP обнаружен в пяти последовательных метанольных смывах (SM 1-5) и метанольном экстракте волос пациента Т. (UZ - при обработке образца в ультразвуковой ванне).

Сравнение интенсивностей пика пиррролидинвалерофенона (α-PVP) в исследуемом объекте

α-PVP обнаружен в пяти последовательных метанольных смывах (SM 1-5) и метанольном экстракте срезов ногтевых пластин с пальцев рук пациента Т. (UZ - при обработке образца в ультразвуковой ванне).

Сравнение интенсивностей пика пиррролидинвалерофенона (α-PVP) в исследуемом объекте

α-PVP обнаружен в пяти последовательных метанольных смывах (SM 1-5) и метанольном экстракте срезов ногтевых пластин с пальцев рук пациента Т. (UZ - при обработке образца в ультразвуковой ванне)

Стимулятор α-PVP обнаружен в пяти последовательных метанольных смывах (SM 1-5) и метанольном экстракте срезов ногтевых пластин с пальцев ног пациента Т. (UZ - при обработке образца в ультразвуковой ванне)

ВЫВОДЫ

Во всех исследованных объектах обнаружен стимулятор пирролидинвалерофенон (PVP) пациента Т. является системным потребителем психоактивного вещества PVP.

Проводимые параллельно эксперименты с использованием волос и ногтей пациентов, которые заведомо не употребляли психоактивные вещества, даже если выявлялся фон малого уровня, то этот фон повторялся независимо от числа промывок и никогда не проявлялось увеличение его уровня после измельчения субстрата.

Таким образом, в предложенном техническом решении достигается требуемый технический результат, заключающийся в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека, с одновременным повышением достоверности результатов идентификации.