Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ПЕРЕВИВНОЙ ПОВЕРХНОСТНОЙ СОЛИДНОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННОЙ САРКОМЫ М-1 КРЫС

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к фотодинамической терапии перевивной поверхностной солидной соединительнотканной опухоли саркома М-1 крыс.

Эффективность фотодинамического воздействия зависит от трех составляющих: ФС, света и кислорода. Избирательность разрушения опухоли связана с избирательностью накопления ФС в опухоли по отношению к здоровой ткани и с воздействием света определенной длины волны. Не пораженные опухолью ткани в меньшей степени поглощают ФС, но в результате лазерного облучения имеет место нежелательная частичная деструкция здоровых тканей.

При проведении ФДТ пациенту вводится фотосенсибилизатор (ФС), избирательно накапливающийся в злокачественных новообразованиях. Затем опухоль подвергается дистанционному облучению лазерным светом определенной длины волны, в соответствии со спектром возбуждения ФС. В результате облучения происходит фотохимическая реакция, где ФС фактически играет роль катализатора, и происходит образование активных форм кислорода (основным из которых является синглетный кислород) и различных радикалов, которые являются цитотоксическими агентами и вызывают разрушение клеток опухоли. Второй механизм ФДТ - деструкция эндотелия кровеносных сосудов в зоне лазерного облучения, в результате которой имеет место тромбоз сосудов и нарушение питания в опухоли.

Известен способ ФДТ злокачественных опухолей (RU 2119363), включающий системное введение ФС с последующим дистанционным лазерным облучением опухоли в световой дозе 124 Дж/см² и 98 Дж/см² на курс лечения.

Недостаток данного способа состоит в том, что при минимальных побочных реакциях в зоне облучения достичь полной регрессии возможно лишь при воздействии на небольшие поверхностные опухоли.

Известен также способ ФДТ злокачественных опухолей (RU 2146159), включающий системное введение ФС и лазерное дистанционное облучение зоны опухолевого роста световой дозой 300-500 Дж/см².

Однако данный способ применим, в основном, к поверхностным опухолям. Лазерное облучение с используемыми параметрами приводит к развитию геморрагического некроза в здоровых тканях во время и после ФДТ.

Известен также способ ФДТ злокачественных новообразований (RU 96107054 А), включающий, так же как и заявляемое изобретение, введение в организм пациента фотосенсибилизатора (далее - ФС) и лазерное облучение зоны опухолевого роста световой дозой 300-500 Дж/см2.

Однако, предлагаемый способ направлен в основном на повышение концентрации фотосенсибилизатора в опухоли, в то же время сами параметры лазерного облучения остаются стандартными, что приводит к развитию местных осложнений во время и после ФДТ.

Самым близким (прототипом) является способ ФДТ злокачественных опухолей (RU 2169015 С2), в котором ФДТ осуществляют путем введения ФС "Фотосенс" в дозе 0,3-0,8 мг/кг веса тела больного с последующим воздействием на зону опухолевого роста дистанционным лазерным излучением мощностью 100-500 мВт/см².

Однако, в этих условиях интенсивное лазерное воздействие, осуществляемое за короткий промежуток времени после введения ФС, приводит к полному терапевтическому эффекту при воздействии на поверхностные опухоли и сопровождается глубоким некрозом опухоли и части окружающих нормальных тканей.

Все известные способы не дают полного терапевтического эффекта без образования длительно незаживающих деструктивных повреждений здоровых тканей. Использование нового отечественного ФС при проведении ФДТ с установленными в наших исследованиях параметрами позволяют достичь полной эрадикации опухолей без серьезных повреждений здоровых тканей в области лазерного воздействия.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка оптимального лекарственно-светового интервала (ЛСВИ) - времени от момента введения ФС до облучения лазером, подбор доз введенного ФС и подбор плотности мощности лазерного излучения на опухоль.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что так же, как и в известном способе (RU 2169015), вводят фотосенсибилизатор в дозе 0,3-0,8 мг/кг веса тела больного с последующим воздействием на зону опухолевого роста дистанционным лазерным излучением мощностью 100-500 мВт/см².

Особенностью заявляемого изобретения является то, что вводят фотосенсибилизатор «Фоторан Е6» в дозе 5,0 мг/кг, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,85 мг/кг веса тела больного и через 2,5 часа после введения проводят облучения лазером с длиной волны 660-670 нм с плотностью мощности 250 мВт/см² и плотностью энергии 300 Дж/см² лазерного излучения, время облучения - 20 минут.

Изобретение поясняется подробным описанием, сериями опытов, таблицами и иллюстрацией на которой изображена диаграмма динамики накопления Фоторана Е6 в опухолях и здоровых тканях бедра крыс при дозах: А - 1,25 мг/кг, Б - 2,5 мг/кг, В - 5,0 мг/кг; по осям абсцисс - срок после внутрибрюшинного введения фотосенсибилизатора, ч; по осям ординат: слева - интенсивность флуоресценции, справа: - индексы контрастности.

Было проведено изучение противоопухолевой эффективности ФДТ с новым отечественным ФС Фоторан Е6, который содержит трисмеглуминовую соль хлорина Е6 в комплексе с поливинилпирролидоном (ПВП, марка К-17). Активной субстанцией Фоторана является хлорин Е6, который относится к природным порфиринам и выделяется из водоросли Spirullina platensis. Порфирины липофильны и связываются с мембранами клеток, однако они не способны селективно накапливаться в опухолевой ткани. С этой целью их соединяют с молекулами-переносчиками. Для Фоторана Е6 в качестве переносчика используют гидрофильный полимер ПВП. Образующиеся в растворе ПВП молекулярные комплексы «хлорин Е6 - ПВП» обладают более высокой фотосенсибилизирующей активностью и интенсивностью флуоресценции по сравнению с активностью свободного хлорина.

Способ осуществляют следующим образом.

В эксперименте in vivo нами использовались белые беспородные лабораторные крысы, в качестве экспериментальной модели опухоли использовали саркому М-1. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций по проведению исследований с использованием лабораторных животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987).

На 98 половозрелых самках крыс массой тела 135-190 г с имплантированной подкожно с внешней стороны бедра саркомой М-1. На 7-9 сутки после перевивки при достижении наибольшего диаметра опухолевых узлов 0,8-1,0 см животных методом рандомизации распределяли на 4 опытных и контрольную группы. Опухоли крыс контрольной группы не подвергались воздействиям. Фоторан Е6 вводили животным опытных групп интраперитонеально.

Фотодинамическая активность фотосенсибилизаторов и сохранность окружающих тканей реализуются за счет селективного накопления фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани. Поэтому их регистрация с целью определения концентрации и динамики содержания в тканях in vivo необходима для контроля параметров лазерного воздействия. В данной работе уровень содержания Фоторана Е6 оценивали по интенсивности флуоресценции в условных единицах (у. ед.) в опухолевой и здоровой тканях бедра с помощью спектрофлуоресцентного комплекса ЛЭСА-01-«Биоспек». Селективность накопления ФС вычисляли по индексу контрастности. Спектры измеряли до введения препарата (0 часа), а затем через каждые 30 минут в течение 4 часов (см. диаграмму). В течение 3 ч после внутрибрюшинного введения Фоторана Е6 в разных дозах отчетливо регистрировалось постепенное увеличение содержания препарата в опухоли с последующим снижением его концентрации при статистически значимом различии с исходными значениями собственной флуоресценцией биологических тканей при р<0,01-0,001. Относительно высокая интенсивность флуоресценции препарата отмечалась и в здоровых тканях (р<0,05-0,02 относительно исходных значений). При введенных дозах максимальный индекс контрастности был в диапазоне значений 1,7-1,8 через 2-3 часа после введения ФС. С учетом полученных данных опухоли животных из опытных групп облучали лазером через 2,5 ч после введения ФС.

Лазерное облучение проводили в период максимального индекса контрастности опухоль/здоровая ткань после введения ФС (оптимальный лекарственно световой интервал ЛСВИ - 2,5 часа). Для воздействия лазерным излучением на опухоли крыс, находившихся под тиопенталовым наркозом (0,2 мл/100 г массы тела 2,5% раствора, интраперитонеально) использовали полупроводниковый аппарат «Аткус-2» (ЗАО «Полупроводниковые приборы», Санкт-Петербург). Длина волны излучения 662 нм, плотность энергии лазерного излучения (Е) - 300 Дж/см², плотность мощности - (Ps) - 0.25 Вт/см², диаметр светового пятна - 1,5 см, время облучения - 20 минут.

Время облучения лазером рассчитывали по формуле:

Т = Е / Ps / 60 секунд

где:

Т - время в минутах;

Е - плотность энергии лазерного излучения Дж/см²;

Ps - плотность мощности лазерного излучения Вт/см².

Объемы опухолевых узлов определяли в день экспериментального воздействия (V₀), на 3, 7, 10, 14 и 21 сутки (V_t) после ФДТ.

Для оценки противоопухолевой эффективности использовали следующие показатели:

- коэффициент абсолютного прироста опухоли (К):

Для этого сначала вычисляли объемы опухолей по формуле:

где: d_1; d₂, d₃, - три взаимно перпендикулярные диаметры опухоли,

V - объем опухоли в см³.

Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) рассчитываем по формуле:

где V₀ - объем опухоли до воздействия,

V_t - объем опухоли на определенный срок наблюдения;

- индекс торможения роста опухоли (ТРО, %):

ТРО вычисляли по формуле:

где: V_k - средний объем опухоли в контрольной группе

V₀ - средний объем опухоли в опытной группе;

- процент животных в группе с полной регрессией (ПР) опухоли (К = -1), за полную регрессию опухоли мы принимали отсутствие видимой и пальпируемой опухоли.

- увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %) животных, подвергнутых ФДТ, относительно контрольных особей:

По средней продолжительности жизни (СПЖ) животных и увеличение продолжительности жизни (УПЖ%) по сравнению с контролем. Значимым считается УПЖ ≥ 50%.

- критерий излечения животных при отсутствии признаков рецидивирования опухоли в течение 90 суток после терапии.

Статистическую обработку результатов исследований проводили в компьютерной программе «Statistica» непараметрическими методами для независимых групп (описательная статистика, значимость различий признаков). Статистическую значимость различий сравниваемых признаков в группах проводилась с помощью непараметрического метод U теста Манна-Уитни (Mann-Whitney U test). Различия считались статистически значимыми при уровне р<0,05, что соответствует 95% вероятности безошибочного прогноза.

Экспериментальные исследования выполнялись:

Вводили ФС в дозах - 1,25; 2,5; 5,0 и 10,0 мг/кг; Е=300 Дж/см², Ps=0,25 Вт/см², время облучения 20 минут.

Через 3 суток после ФДТ на облученной коже над опухолями появлялись эрозии, покрытые тонкими струпами. На 7-10 сутки формировались плотные струпы с демаркационной линией между окружающей кожей и некротизированной тканью новообразований.

В опыте с плотностью мощности лазерного излучения 0,25 Вт/см² и с плотностью энергии 300 Дж/см², время облучения 20 минут при дозах ФС 1,25 и 2,5 мг/кг полная регрессия саркомы М-1 отмечалась у 100% животных до 21 суток после ФДТ. Полный терапевтический эффект с дозой ФС 2,5 мг/кг на 90 сутки после ФДТ составлял 60%. При дозах 5,0 и 10 мг/кг после полной регрессии опухолевых узлов до 21 суток визуальных признаков рецидивирования неоплазий на протяжении 3 месяцев наблюдений не отмечалось (табл. 1). Примечательно, что при данных параметрах фотодинамического воздействия не отмечалось серьезных длительно незаживающих деструктивных повреждений в области лазерного воздействия, но и сокращалась продолжительность времени заживления поврежденных нормальных тканей.

Результаты количественного анализа исследованных показателей эффективности действия ФДТ с Фотораном Е6 на саркому М-1 приведены в таблице 1.

Показатели увеличения продолжительности жизни и излеченности животных на 90 сутки после ФДТ представлены в таблице 2.

Высокий терапевтический эффект при данных параметрах лазерного воздействия (Е=300 Дж/см², Ps=0,25 Вт/см²) был обусловлен снижением повреждения нормальных тканей и последующей миграцией клеток воспалительного инфильтрата в зону фотодинамической деструкции для элиминации погибших опухолевых клеток.

Предложенный способ позволяет повысить эффективность проведения ФДТ как за счет фотосенсибилизатора «Фоторан Е6», который обладает свойствами накапливаться в опухоли и при локальном воздействии лазерного излучения с длиной волны в диапазоне 660-670 нм обеспечивает высокий фотосенсибилизирующий эффект, так и за счет подбора параметров проведения ФДТ. После чего удается получить увеличение срока жизни и 100% полного излечения животных.