Результат интеллектуальной деятельности: КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДЕРМАТАНСУЛЬФАТ И ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КОСМЕТОЛОГИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЯХ

Настоящее изобретение относится к композиции гликозаминогликанов (ГАГ), содержащую дерматансульфат и хондроитинсульфат, в которой количество дерматансульфата составляет по меньшей мере 1% и не более чем 99% по массе, и количество хондроитинсульфата составляет по меньшей мере 1% и не более чем 99% по массе, от общего количества ГАГ.

В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей от 0,1 до 15,0% по массе, предпочтительно от 0,2 до 10,0% по массе, смеси ГАГ, при этом указанная смесь содержит дерматансульфат и хондроитинсульфат, при этом количество дерматансульфата составляет по меньшей мере 1% по массе от общего количества ГАГ, и количество хондроитинсульфата составляет по меньшей мере 1% по массе от общего количества ГАГ. Композиции согласно настоящему изобретению особенно пригодны для применения в области косметологии.

Применение ГАГ в области фармацевтики хорошо известно в данной области техники. Помимо хорошо известного применения низкомолекулярного гепарина для предотвращения тромбообразования, были предложены другие способы фармацевтического применения ГАГ. Например, в документе US 2014/0343012 описано применение комбинации гиалуроновой кислоты и другого ГАГ, например хондроитинсульфата, при лечении остеоартрита.

В документе WO 2006/015171 описано применение различных ГАГ, таких как дерматансульфат, хондроитинсульфат и низкомолекулярный гепарин, при лечении сепсиса.

Неожиданно было обнаружено, что продукт для кожи, содержащий смесь, включающую дерматансульфат и хондроитинсульфат, очень эффективен в качестве композиции против старения кожи, для разглаживания морщин и поддержки гидратации кожи.

В частности, настоящее изобретение описывает косметологическую композицию, содержащую смесь ГАГ, включающую дерматансульфат и хондроитинсульфат. Количество дерматансульфата составляет по меньшей мере 1% по массе, или по меньшей мере 2% по массе, или по меньшей мере 5% по массе, или по меньшей мере 10% по массе, или по меньшей мере 20% по массе, или по меньшей мере 40% по массе, или по меньшей мере 50% по массе, или по меньшей мере 60% по массе, от общего количества ГАГ.

Количество хондроитинсульфата составляет по меньшей мере 1% по массе, или по меньшей мере 2% по массе, или по меньшей мере 5% по массе, или по меньшей мере 10% по массе, или по меньшей мере 20% по массе, от общего количества ГАГ.

Массовое соотношение дерматансульфата и хондроитинсульфата составляет от 5/95, или 10/90, или 20/80, или 25/75, или 40/60, или 50/50, до 95/5, или 90/10, или 85/15, или 80/20, или 75/25. Любой диапазон, являющийся производным от комбинации указанных выше предельных соотношений, является включенным в настоящее описание. Например, диапазон может быть от 5/95 до 95/5, или от 25/75 до 90/10, или от 50/50 до 85/15.

Несмотря на то, что присутствие и дерматансульфата, и хондроитинсульфата является существенным, не исключено также присутствие других ГАГ.

ГАГ (или мукополисахариды) являются длинными неразветвленными полисахаридами, состоящими из повторяющихся дисахаридных звеньев. Повторяющиеся звенья (за исключением кератана) состоят из аминосахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина) наряду с уроновым сахаром (глюкуроновой кислотой или идуроновой кислотой) или галактозой.

Неограничивающими примерами ГАГ являются: дерматансульфат, хондроитинсульфат, гепарансульфат, гепарин, деполимеризованный гепарин, например, низкомолекулярный гепарин и очень низкомолекулярный гепарин, химически модифицированный гепарин, например, суперсульфатированный гепарин, гиалуроновая кислота, кератансульфат.

Предпочтительным образом, дерматансульфат и хондроитинсульфат вместе присутствуют в количестве по меньшей мере 40% по массе от общего количества ГАГ, предпочтительно по меньшей мере 50% по массе, более предпочтительно по меньшей мере 60% по массе, еще более предпочтительно по меньшей мере 70% по массе, и предпочтительнее всего по меньшей мере 80% по массе.

ГАГ композиция предпочтительно содержит гиалуроновую кислоту в количестве менее 20% по массе, или менее 10% по массе, или менее 5% по массе. Более предпочтительно, ГАГ композиция в сущности не содержит гиалуроновую кислоту. Количество гепарина также предпочтительно менее 20% по массе, или менее 10% по массе, или менее 5% по массе. Особенно предпочтительно, такая композиция в сущности не содержит гепарина. Количество кератансульфата предпочтительно также ограничено, и предпочтительно составляет менее 20% по массе, или менее 10% по массе, или менее 5% по массе. Более предпочтительно, ГАГ композиция в сущности не содержит кератансульфата.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть любой подходящей композицией для применения при лечении стареющей кожи или кожных патологий (например, атопической кожи, сухой/очень сухой кожи, кожного зуда, и т.д.). Например, такая композиция может быть в форме водного раствора или крема.

Так, в одном варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу лечения кожи, включающий нанесение на кожу крема или геля, содержащего вышеуказанную ГАГ композицию, предпочтительно в количестве от 1 до 15% по массе.

В другом варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу уменьшения глубины кожных морщин, включающий применение к коже косметологической композиции, содержащей дерматансульфат и хондроитинсульфат, при этом общее количество дерматансульфата и хондроитинсульфата в этой косметологической композиции предпочтительно составляет от 0,1% по массе до 10% по массе, более предпочтительно от 0,2% по массе до 5% по массе, еще более предпочтительно от 0,4% по массе до 3% по массе.

ГАГ композицию согласно настоящему изобретению можно также принимать перорально. Композиция, пригодная к пероральному приему, предпочтительно содержит по меньшей мере 70% по массе дерматансульфата и хондроитинсульфата, более предпочтительно по меньшей мере 80% по массе этих компонентов, от общего количества ГАГ композиции. Такая композиция для перорального приема может также содержать другие наполнители, обычно применяемые при изготовлении пилюль, таблеток и др. для перорального приема. В другом аспекте, композиция для перорального приема в сущности не содержит коллагена. В другом аспекте, композиция для перорального приема в сущности не содержит эластина. В настоящем описании термин «в сущность не содержит» относится к количеству менее 1,0% по массе, предпочтительно 0,5% по массе, более предпочтительно менее 0,1% по массе, или даже ниже предела обнаружения.

Обычно, косметологическую композицию изготавливают в форме раствора или крема. Раствор является водной монофазной системой, предпочтительно содержащей от 30 до 98% по массе воды, более предпочтительно от 85 до 97% по массе; водные растворы также могут иметь форму геля, структура которого создается путем стабилизации с применением специфических реологических ингредиентов, т.е. гелеобразующих веществ, предпочтительно содержащихся в количестве от 0,1 до 10% по массе, более предпочтительно от 0,2 до 5% по массе. Такая композиция может также содержать другие добавки, такие как увлажнители, антиоксиданты, консерванты, стабилизаторы и другие соединения, обычно применяемые в составе косметических гелей.

Если композиция имеет форму крема, эмульсии типа «масло и/или силикон в воде» или «вода в масле и/или в силиконе», то вода обычно присутствует в меньшем количестве, предпочтительно от 0 до 75% по массе, более предпочтительно от 30 до 70% по массе, более предпочтительно от 60 до 70% по массе; в этом случае такая композиция также включает по меньшей мере одно масло и/или силикон или жир, который выбирают из природных и синтетических масел/жиров или их смесей, в количестве предпочтительно от 5 до 50% по массе, более предпочтительно от 8 до 30% по массе, более предпочтительно от 10 до 20% по массе; и один или несколько эмульгаторов, которые выбирают из ионных или не-ионных эмульгаторов, в количестве предпочтительно от 1 до 20% по массе, более предпочтительно от 2 до 15% по массе, наиболее предпочтительно от 4 до 14% по массе. Так, предпочтительная композиция согласно настоящему изобретению в форме крема будет содержать по меньшей мере одно синтетическое или природное масло или жир, и возможно воду, эмульгаторы, консерванты, антиоксиданты, увлажнители, и другие соединения, обычно применяемые в составе косметических кремов.

Содержание ГАГ композиции в косметологической композиции согласно настоящему изобретению составляет по меньшей мере 0,1% по массе, или по меньшей мере 0,2% по массе, или по меньшей мере 0,3% по массе, или по меньшей мере 0,5% по массе, или по меньшей мере 0,8% по массе. Также, гликозаминогликановая композиция присутствует предпочтительно в количестве не более чем 15,0% по массе, или не более чем 10,0% по массе, или не более чем 5,0% по массе, или не более чем 3,0% по массе, или не более чем 2,0% по массе, или не более чем 1,5% по массе, или не более чем 1,3% по массе. В наиболее предпочтительном варианте реализации, такая композиция присутствует в количестве приблизительно 1% по массе, например от 0,9% по массе до 1,1% по массе. Независимо от других ГАГ или не-ГАГ компонентов, присутствующих в косметологической композиции согласно настоящему изобретению, количество дерматансульфата и хондроитинсульфата вместе предпочтительно составляет по меньшей мере 0,1% по массе, предпочтительно по меньшей мере 0,2% по массе, более предпочтительно по меньшей мере 0,4% по массе, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,5% по массе от всей косметологической композиции.

С другой стороны, количество дерматансульфата и хондроитинсульфата вместе предпочтительно составляет менее 10% по массе, более предпочтительно менее 5% по массе, еще более предпочтительно менее 3% по массе от общего веса косметологической композиции.

Примеры композиции в форме геля и в форме крема:

Гель:

Крем:

Водная фаза:

Масляная фаза:

Было обнаружено, что применение ГАГ композиции согласно настоящему изобретению в составе продукта для ухода за кожей приводит к улучшению матрикса кожи, оказывая предотвращающее старение кожи, увлажняющее и препятствующее появлению морщин действие.

Матрикс кожи отвечает за структурную целостность, механическую эластичность, стабильность и многие другие свойства кожи. Деградация матрикса кожи играет важную роль в развитии морщин и других признаков старения кожи. Наиболее известными компонентами матрикса кожи являются структурные белки (коллаген и эластин), которые жизненно важны для здоровья и молодости кожи. Структурные белки необходимы, но недостаточны для здорового матрикса кожи. Гиалуроновая кислота, главный наполнитель матрикса кожи, обеспечивает механическую амортизацию, задерживает влагу, и несет ответственность за длительные увлажняющие свойства.

Декорин является главным протеогликаном, присутствующим в коже; это небольшой протеогликан с центральным белком, имеющим форму подковы, выемка в котором вмещает и может служить центром связывания коллагена I типа. Количество декорина в каркасе кожи оказывает значительное влияние на эластичность кожи. Фактически, для оптимального волокнообразования необходимо определенное соотношение между декорином и коллагеном.

Композиция согласно настоящему изобретению эффективно повышает долговременную гидратацию кожи и уменьшает глубину морщин.

Без привязки к какой-либо теории, предотвращающее старение кожи, увлажняющее и препятствующее появлению морщин действие композиции согласно данному изобретению возможно связано с ее влиянием на повышение уровня декорина, коллагена I типа и экспрессии гена синтазы гиалуроновой кислоты.

Экспериментальная часть

Концентрацию дерматансульфата и хондроитинсульфата в ГАГ композиции измеряли с помощью электрофореза следующим способом.

Приготовили раствор ГАГ композиции в очищенной воде с концентрацией приблизительно 0,7%. Включили криостат и охладили резервуар для электрофореза. Боковые емкости резервуара заполнили буферным 1 М раствором ацетата бария, центральную - н-деканом. Эти две жидкости не смешиваются: декан, будучи легче, оставался на поверхности и использовался для поддержания постоянной температуры буферного раствора.

Один плексигласовый резервуар наполнили очищенной водой, а второй - 0,1 М раствором ацетата бария. Одну сторону пластины погрузили в очищенную воду на глубину приблизительно 1 см, высушили бумажным полотенцем, и оставшуюся часть смочили 0,1 М раствором ацетата бария, оставив между водой и ацетатом бария несколько миллиметров сухой пластины. Пластину высушили бумажным полотенцем и на часть пластины, намоченную водой, при помощи аппликатора нанесли образцы и стандарт.

Пластину поместили в электрофорезную ячейку на мостик, пористой частью вниз и той стороной, на которую были нанесены образцы, в сторону катода (отрицательного полюса). Первую часть электрофоретического анализа проводили в течение 2 минут при напряжении 200 вольт. Образцы переместились на линию между двумя растворами (воды и ацетата бария); пластину вынули, высушили, и погрузили ровно на 2 минуты в 3% раствор этанола. Таким образом остановили перемещение медленно двигающихся полос. Пластину высушили, поместили обратно в ячейку, и провели вторую часть электрофоретического анализа в течении 15 минут при напряжении 200 вольт. По окончании этой части пластину вынули, высушили и поместили в 20% раствор этанола ровно на 2 минуты. Таким образом остановили перемещение быстро двигающихся (дерматансульфатных) полос.

Пластину высушили и поместили в ячейку для третьей части электрофоретического анализа, на 25 минут при напряжении 200 вольт, при этом перемещались хондроитинсульфатные полосы. Наконец, пластину высушили и перенесли на 10 минут в окрашивающий раствор, после чего в обесцвечивающий раствор до полного обесцвечивания, периодически меняя раствор.

Считывание пластины с помощью денситометра проводили в следующих условиях:

- длина волны: 600 мм

- фоторежим: отражение

В аппаратном отчете о результатах анализа полосы миграции были изображены в виде хроматограммы. Для каждого пика были показаны значения электрофоретической мобильности (Rf), площадь и относительная площадь (площадь каждого пика, умноженная на 100, поделенная на сумму площадей всех пиков).

Обнаружение гиалуроновой кислоты можно провести с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) по стандартной методике. Гепарин и гепаринсульфат также можно обнаружить с помощью электрофореза.

Эксперименты in vitro

Для экспериментов in vitro использовали раствор, содержащий 1% ГАГ композиции согласно настоящему изобретению. ГАГ композиция состояла из дерматансульфата в количестве 75% по массе и хондроитинсульфата в количестве 25% по массе. Эксперименты проводили на 3D тканях.

Среди альтернативных материалов для in vitro экспериментов, 3D ткани обладают значительным преимуществом, представляя собой ближайшую к человеческому материалу биологическую модель: они обладают многослойной структурой и тканевой функциональностью, схожей с in vivo тканями; более того, тестируемые продукты можно наносить на поверхность ткани в той же концентрации и тем же способом, как in vivo.

Обработка человеческой кожи продуктами местного применения вызывает геномный ответ, характеризующийся динамическим сигнальным путем, и представляющий собой первый клеточный сигнал транскрипционного уровня, ответственный за каскад событий. 3D живая человеческая ткань является подходящей проверочной системой для оценки эффективности с учетом как прямого геномного ответа, так и результата клеточной коммуникации и перекрестных взаимодействий посредством экспрессии растворимых медиаторов и специфических биомаркеров.

При подготовке экспериментальных моделей для оценки эффективности ингредиентов и готовых продуктов использовали концепцию «косметогеномики». Для тестирования косметических продуктов на «полнослойной кожной модели» (ПС-коже) специально разработали гомеостатическую модель, воспроизводящую дермальную и эпидермальную секции: эта модель обладала той особенностью, что позволяла проводить исследование модификации дермальной внеклеточной матрицы через короткий (24 ч/48 ч) или длинный (до 2 недель) промежуток времени после нанесения продукта. Относительную эффективность продукта количественно оценивали в сравнении с контрольной необработанной тканью.

Эффективность активного 1% (по массе) раствора оценивали in vitro на ПС-кожной модели в условиях кожного гомеостаза после обработки в течение 24 ч и 48 ч.

Полнослойная кожная модель Phenion® производится компанией Henkel (Дюссельдорф, Германия, диметр 1,3 мм). В этой модели эпидермальные кератиноциты и дермальные фибробласты (происходящие от биопсического материала от здоровых доноров) образуют многослойный кожный эквивалент, ведущий себя в условиях культивирования подобно человеческой коже. Фибробласты выращивают в специальной стабилизированной матрице, не сжимающейся под действием тягового усилия фибробластов. После создания этого дермального эквивалента наносят кератиноциты, которые в течение нескольких дней формируют эпидермис с четко распознаваемыми слоями. Эпидермис и дерма образуют физиологически функциональный блок, и подобно человеческой коже, эпидермис производит различные дифференцирующие маркеры (цитокератин 10, филагрин, трансглютаминазу и инволюкрин). Эпидермально-дермальное соединение характеризуется базальными мембранными белками (ламинином и коллагеном IV). В дермальной секции был продемонстрирован синтез эластина и фибронектина de novo. Пролиферативные клетки базального уровня идентифицировали с помощью Ki-67 окрашивания. Модель полностью формируется после культивационного периода продолжительностью 5 недель.

Обработка: 100 мкл 1% раствора и солевого раствора в качестве негативного контроля нанесли на дублирующиеся культуры в гомеостатических условиях (без применения воздействия) на поверхность эпидермиса на 24 ч и 48 ч. Продукт повторно нанесли через 24 ч. С помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени (qRT-PCR, ПЦР в реальном времени) анализировали следующие биомаркеры: декорин, коллаген I и гилуронат ситетазу 1. Уровень белка анализировали с помощью иммунофлуоресцентного количественного анализа. Экспрессию декорина и коллагена I измеряли с помощью вестерн-блоттинга.

Экстракция РНК, ретротранскрипция кДНК и ПЦР в реальном времени

Для трех стадий использовали реагенты, готовые к применению. RNAqueous® метод основан на быстродействующей, свободной от фенола, фильтрующей системе для выделения РНК, применяемой для полного выделения РНК из клеточных образцов. Набор «High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit» использовали для синтеза кДНК из РНК. Для исследования генной экспрессии важных биомаркеров использовали аппарат Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR с флуоресцентной ПЦР и TaqMan анализ. Генная экспрессия является процессом, при котором наследуемая информация из гена, такая как последовательность ДНК, передается в функциональный генный продукт, такой как белок или РНК. С помощью относительного количественного анализа определяют изменение экспрессии последовательности нуклеиновых кислот в проверяемом образце в сравнении с такой же последовательностью в контрольном образце. Для нормализации начальных количеств в качестве эндогенного контрольного гена использовали ГАФДГ (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу). Каждый репликат анализировали трижды. К 2Х TaqMan Fast Universal PCR Master Mix добавили Taqman gene expression assay и кДНК (25 нг) до общего объема 25 мкл. Температурные условия в ABI PRISM 7500 Fast составили: 95°С 20 с, 40 циклов (95°С 3 с +60°С 30 с).

ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГ

Принцип метода

Вестерн-блоттинг является надежно отработанным и широко применяемым методом определения и анализа белков. Этот метод основан на создании комплекса антитело-белковый комплекс путем специфического связывания антител с белками, иммобилизованными на мембране, и определении связанного антитела одним из нескольких способов. Образец белка подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле. Затем гель помещают на лист нитроцеллюлозы и электрофоретически переносят белок из геля на нитроцеллюлозу. После этого нитроцеллюлозу смачивают блокирующим буферным раствором для «блокировки» неспецифического связывания белков. Затем нитроцеллюлозу инкубируют с антителом, специфическим к интересующему белку. Затем нитроцеллюлозу инкубируют со вторым антителом, специфическим к первому антителу.

Вторичное антитело обычно содержит ковалентно присоединенный фермент, который проявляет цветную реакцию под действием хромогенного субстрата.

Процедура

ПС-кожу поместили в буферный раствор BIO-PLEX CELL LYSIS (BIORAD) со свежедобавленной смесью ингибиторов протеазы, гомогенизировали и держали на льду 30 минут, после чего центрифугировали при 16000 g в течение 10 минут при 4°С. Определение белка проводили с помощью RC DC Protein Assay (BIORAD). После добавления к лизату эквивалентного количества буферного раствора 2Х Laemmli Sample Buffer, каждый образец кипятили в буферном растворе при 100°С в течение 5 минут и подготовили (50 мкг всех белков) к разделению на геле Tris Glycine Extended (TGX) Stain-free precast gels 7,5% (Bio-Rad) и перенесли на ПВДФ (поливинилиденфторидную) мембрану (BIORAD). Мембрану блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре при помощи 5% блокировочного раствора (BSA) в 0,05% ТБСТ (смесь ТБС (солевого раствора тригидроксиметиламинометана) с полисорбатом 20). Мембраны инкубировали с поликлональным антителом к кроличьему DCN (NBP-84970, NovusBio) и к COL1 (РА5-29569, Thermo Scientific) в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембрану трижды по 5 минут промывали в ТБСТ.

Связанные антитела определяли с применением рекомендованным образом разбавленного меченного вторичного антитела к кроличьему IgG (656120, Invitrogen) в ТБСТ при комнатной температуре в течение 1 часа. После трех промываний в ТБСТ, мембрана была готова к сигнальной обработке с использованием CLARITY WESTERN ECL SUBSTRATE (BIORAD). Полосы хемолюминесценции DCN и COL1 визуализировали с помощью системы Chemidoc XRS (BIORAD) и измеряли с помощью компьютерной программы ImageLab Software (при 100/50 кДа и 250 кДа соответственно).

Далее приведены результаты, полученные в этих экспериментах. После 48 часов от начала обработки, повышение экспрессии гена декорина составило 46%, повышение экспрессии гена коллагена I составило 61%, и повышение экспрессии гена синтазы гиалуроновой кислоты составило 559%.

Эксперименты in vivo

Эксперимент проводили на 25 добровольцах, длительность лечения составила 4 недели. Добровольцы получили продукт в виде крема на основе эмульсии масла в воде, согласно вышеприведенному описанию.

ГАГ композиция состояла из 75% (по массе) дерматансульфата и 25% (по массе) хондроитинсульфата. В качестве контроля использовали идентичный крем без ГАГ (эмульсионную основу).

На 25 добровольцах провели два измерения: глубины морщин и уровня гидратации. Глубину морщин измеряли с помощью Dermatop Blue™. Уровень гидратации измеряли методом корнеометрии через 3 часа после первого нанесения и через 8 дней применения при нанесении дважды в день.

Эффект против морщин

У добровольцев, применявших крем согласно настоящему изобретению, наблюдалось уменьшение глубины морщин через 4 недели в среднем на 23,1%, при этом у добровольцев, применявших эмульсионную основу, уменьшение составило 16,4%.

Увлажняющий эффект

По результатам измерений через 3 ч после первого применения эмульсионная основа оказалась эффективнее крема согласно настоящему изобретению (увеличение на 39,9% в случае эмульсионной основы в сравнении с увеличением на 28,7% в случае крема); однако через 8 дней картина полностью изменилась (увеличение на 33,5% в случае эмульсионной основы в сравнении с увеличением на 52,3% в случае крема согласно настоящему изобретению).

Эти данные показывают, что результаты тестов in vitro подтвердились результатами тестов in vivo. Применение ГАГ композиции, содержащей дерматансульфат и хондроитинсульфат, оказывает увлажняющее действие и ведет к статистически достоверному уменьшению глубины морщин.