Способ хранения ДНК-содержащего растительного материала в широком диапазоне температур

Область техники. Настоящее изобретение направлено на хранение образцов ДНК-содержащего растительного материала в виде гомогенатов на бумажном носителе в широком диапазоне температур длительный период времени.

Уровень техники. Коллекции ДНК стали важными ресурсами в рамках глобальных усилий по преодолению кризиса в области биоразнообразия, управления генетическими ресурсами в мире. Очевидно, что защитники растений все чаще обращаются к ДНК-технологиям, чтобы ответить на основные ботанические вопросы, которые могут помочь сформулировать соответствующие стратегии сохранения [1, 2, 3]. Анализ последовательности ДНК полезен в идентификации и разграничения видов и высших таксонов, а также приобретает все большее значение в ДНК-таксономии и ДНК-штрихкодирования [4, 5, 6, 7]. Это мощный ресурс для молекулярной филогенетики, помогающий при воссоздании "Дерева жизни" [8, 9].

Среди методов хранения образцов наиболее распространен гербарный метод, ультразаморозка и хранение ДНК на так называемых FTA-картах. Стоит отметить, что при хранении в виде гербария, ДНК подвержена деградации, то есть сильно фрагментируется, и это накладывает ряд ограничений на определенный тип исследований, например, полногеномное секвенирование. Что касается ультразаморозки, то данный способ хранения и ДНК и растительной ткани является наиболее надежным, так как деградации молекул ДНК практически не происходит [10]. Однако, хранение в условиях столь низких температур имеет и свои недостатки: дорогостоящее оборудование, требуются помещения с большими площадями, не транспортабельность такого биоматериала, высокие затраты на поддержание стабильно низкой температуры, неизбежное ухудшение качества образцов вследствие цикла разморозки-заморозки при проведении исследований, риск потери образов из-за перебоев электроснабжения (размораживание образцов). В качестве альтернативного метода ультразаморозки стоит рассматривать хранение ДНК на FTA-картах. Такой тип хранения позволяет сэкономить на энергопотреблении и занимает меньшие площади нежели морозильные установки.

Известны FTA-карты (патент US 7498133 В2), которые предназначены для хранения образцов крови в судебно-медицинской практике. Производители данных карт используют специальный FTA-буфер, стабилизирующий ДНК и оказывающий антимикробный эффект. FTA-буфер представляет собой смесь растворов (2% SDS (додецилсульфат натрия), 10 мМ ЭДТА, 60 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан): 1 мл 20% SDS, 200 мкл 0,5 М ЭДТА, 600 мкл 1 М Трис довести до 10 мл стерильной деионизованной воды. SDS, входящий в состав FTA-буфера, оказывает сильный ингибирующий эффект на ПЦР.

В патенте RU 2228617 предлагается способ длительного хранения биологического материала, включающий помещение обезвоженного образца в емкость, не содержащую кислород, с последующим выдерживанием образца, причем перед капсулированием проводят изоляцию образца от внешней среды, отличающийся тем, что предварительно проводят сублимацию образца, помещенного в открытую емкость, до остаточного содержания влаги не свыше 6 мас. % и остаточного содержания кислорода не свыше 4 мас. %, а выдерживание образца проводят при температуре, не превышающей +4°С. Основной недостаток данного способа заключается в необходимости сублимировать образец.

В патентной заявке RU 2014104967 описан способ консервирования растений, включающий сбор растительного сырья и помещение растений или их частей в раствор химического препарата, отличающийся тем, что растения или их части помещают в 5-10%-ный водный раствор сульфата меди, а в качестве сырья используют иван-чай. Данный способ в отличие от предложенного рассчитан только на один вид сырья и предполагает значительно меньший срок хранения образцов.

В патенте RU 2619898 описан способ консервации образцов, в основе которого лежит консервирующий раствор, содержащий 0,7 М сахарозу, 1.5 М Трис HCl с рН 7,4 в конечной концентрации и с добавлением 2 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты. Основной недостаток данного способа заключается в том, что образцы вместе с осушителем (гидрогелем) упаковали в зип-пакет и хранили в бытовом холодильнике с температурой 2-5°С. Это накладывает дополнительные затраты засчет энергопотребления при использовании холодильного оборудования.

Целью изобретения является устранение недостатков у существующих аналогов, таких как ингибирующий эффект при проведении ПЦР, необходимость сублимации образца, непродолжительный срок хранения образца, зависимость при хранении образцов от источников электросети. Таким образом, изобретение позволяет сохранять ДНК длительное время, не требуя особых условий для хранения и может быть использовано для создания ДНК-банков растений.

Поставленная цель достигается способом хранения ДНК-содержащего растительного материала, характеризующийся тем, что готовят гомогенат растительного сырья с использованием буферного раствора из расчета 75 мкл буферного раствора на 10 мг ткани, наносят гомогенат на бумажный носитель, пропитанный тем же буферным раствором, и высушивают при комнатной температуре, при этом буферный раствор состоит из 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и вода - остальное.

Раскрытие изобретения. Техническим результатом настоящего изобретения является способ хранения ДНК-содержащего растительного материала, характеризующийся тем, что готовят гомогенат растительного сырья с использованием буферного раствора из расчета 75 мкл буферного раствора на 10 мг ткани, наносят гомогенат на бумажный носитель, пропитанный тем же буферным раствором, и высушивают при комнатной температуре, при этом буферный раствор состоит из 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и вода - остальное.

Технический результат достигается путем получения гомогената растительного материала с применением буфера состоящего из из 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и вода - остальное и нанесением полученного гомогената на бумажную основу, пропитанной буферным раствором (RU 2567145). На бумажную основу наносится гомогенат, приготовленный из растительной ткани. В данном изобретении была использована хроматографическая бумага FT-2-527-200200N (FN100), основная масса 195 г/м², толщина 0,35 мм, капиллярный подъем 115 мм/30 мин, материал хлопковый линтер с содержанием альфа-целлюлозы более 98% и содержанием золы менее 0,04%. Буферный раствор состоит из 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и вода - остальное. Растительный гомогенат готовится на основе описанного буферного раствора. Навеску ткани 20-100 мг растирать в фарфоровой ступке в течение 5-7 минут с добавлением буфера из расчета 75 мкл на 10 мг ткани. После нанесения гомогената на бумажный носитель следует сушить в условиях комнатной температуры (около +22°С) в течение не менее 2-х часов. Композиция может храниться в условиях комнатной температуры более 10 лет. После хранения композиции следует взять ее фрагмент и использовать один из стандартных методов выделения ДНК.

Описанный способ позволяет сохранять ДНК длительное время, не требуя особых условий для хранения. Может быть использован для создания ДНК-банков растений.

Осуществление способа изобретения поясняются следующими примерами.

Пример 1.

Навеску ткани 20-100 мг растирали в фарфоровой ступке в течение 5-7 минут с добавлением буфера из расчета 75 мкл на 10 мг ткани. Образцы гомогенизировали в фарфоровых ступках использовали и буферный раствор (0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и вода - остальное, ТЕ-буфер. Гомогенаты переносили в пробирки и затем помещали в термостат на 28 дней при температуре +45°С. В качестве контроля использовали свежеприготовленный гомогенат из растительной ткани. После этого содержимое пробирок тчательно перемешивали и отбирали по 100 мкл гомогената. К нему добавляли по 300 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 8.0; 5.5 М гуанидинатиоционата, 10 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100. Дополнительно гомогенат инкубировали в течение 15 минут в твердотельном термостате ТТ-1 (ДНК-Технология, Москва) при 65°С, периодически перемешивая на вортексе FV-2400 (BioSan, Латвия). После этого пробирки центрифугировали 12 тыс. об/мин в течение 5 минут в настольной центрифуге MiniSpin (Eppendorf AG, Германия) при комнатной температуре. Надосадочную жидкость отбирали в новые пробирки, добавляли по 25 мкл сорбента SiO₂(Хеликон) в 32% HCl, рН 2.0, перемешивали смесь на вортексе и оставляли в штативе на 3 минуты, снова встряхивали и оставляли в штативе на 5 минут. Затем сорбент осаждали центрифугированием 5 тыс. об/мин в течение 30 сек., супернатант удаляли, а сорбент дважды промывали раствором, содержащим 50% этанол, 50 мМ NaCl. После второй отмывки пробирки центрифугировали 10 тыс.об/мин 30 сек., максимально удаляли жидкость и с открытыми крышками помещали в термостат (65°С, 8-10 минут) для подсушивания сорбента. ДНК элюировали в 85 мкл ТЕ буфера (0.01 мМ трис-HCl, рН 8.0; 0.001 мМ ЭДТА) при 65°С в течение 5-8 минут периодически перемешивая на вортексе. Сорбент осаждали центрифугированием 12 тыс. об/мин в течение 3 минут. Далее проводилась ПЦР, продукты амплификации разделяли в 1%-м агарозном геле. Результаты можно увидеть на электрофореграмме продуктов амплификации геномной ДНК хранящейся 28 дней при температуре +45°С. К - контроль, 1 - буферный раствор (0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и вода - остальное, 2 - ТЕ-буфер, представленной на фиг. 1.

Пример 2.

Хроматографическую бумагу FT-2-527-200200N (FN100) пропитывали буферным раствором (0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и вода - остальное) и высушивали. После этого на нее наносили гомогенат растительной ткани, приготовленный из расчета 75 мкл того же буферного раствора на 10 мг ткани растертой в фарфоровой ступке в течение 5 минут. Высушивали гомогенат на бумаге втечение двух часов. Отбирали фрагмент композиции, используемый в дальнейшем в качестве контроля, и интенсивно гомогенизировали в 300 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 8.0; 5.5 М гуанидинатиоционата, 10 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100. Дополнительно гомогенат инкубировали в течение 15 минут в твердотельном термостате ТТ-1 (ДНК-Технология, Москва) при 65°С, периодически перемешивая на вортексе FV-2400 (BioSan, Латвия). После этого пробирки центрифугировали 12 тыс. об/мин в течение 5 минут в настольной центрифуге MiniSpin (Eppendorf AG, Германия) при комнатной температуре. Надосадочную жидкость отбирали в новые пробирки, добавляли по 25 мкл сорбента SiO₂(Хеликон) в 32% HCl, рН 2.0, перемешивали смесь на вортексе и оставляли в штативе на 3 минуты, снова встряхивали и оставляли в штативе на 5 минут. Затем сорбент осаждали центрифугированием 5 тыс. об/мин в течение 30 сек., супернатант удаляли, а сорбент дважды промывали раствором, содержащим 50% этанол, 50 мМ NaCl. После второй отмывки пробирки центрифугировали 10 тыс. об/мин 30 сек., максимально удаляли жидкость и с открытыми крышками помещали в термостат (65°С, 8-10 минут) для подсушивания сорбента. ДНК элюировали в 85 мкл ТЕ буфера (0.01 мМ трис-HCl, рН 8.0; 0.001 мМ ЭДТА) при 65°С в течение 5-8 минут периодически перемешивая на вортексе. ДНК замораживали и хранили 2 года при -80°С. Бумагу с нанесенным гомогенатом помещали в термостат и хранили 2 года при +45°С, после этого выделяли ДНК из данной композиции описанным выше методом. Проводили оценку стабильности ДНК с помощью разделения продуктов ПЦР в агарозном геле. Результаты описываются электрофореграммой продуктов амплификации геномной ДНК 1,2,3 - Н. annuus хранящейся 24 мес. при +45°С, К - контроль с маркерами ядерной, митохондриальной и хлоропластной ДНК, представленной на фиг. 2.

Электрофореграмма наглядно демонстрирует сохранность образцов и соответственно самой ДНК.

Пример 3.

Для получения более детальной картины сохранности ДНК проводили оценку ДНК с помощью ПЦР в реальном времени. Использовали праймеры фланкирующие длинные (~ 5000 bp) и короткие (~ 200 bp) участки ДНК в ядерном, хлоропластном, и митохондриальном геномах соответственно. В таблице 1 можно увидеть последовательность нуклеотидов в использованных праймерах.

Стабильность ДНК при оценке по длинным фрагментам, при хранении в гомогенатах на бумажных носителях в условиях повышенной температуры в течение 24 месяцев, относительно контроля составила: ядДНК 76,9%, мтДНК 87,5%, хлДНК 98,3%. В таблице 2 представлено количество ДНК в гомогенатах на картах через 24 месяца хранения при температуре +45°С при оценке стабильности по длинным фрагментам.

Наибольшая сохранность ДНК в образцах наблюдается в хлоропластной ДНК - 98,3%, наибольшая деградация отмечена в ядерной ДНК - 76,9%.

Стабильность ДНК при оценке по коротким фрагментам, при хранении в гомогенатах на бумажных носителях в условиях повышенной температуры в течение 24 месяцев, относительно контроля составила: ядДНК 89,5%, мтДНК 96,0%, хлДНК 97,7%. В таблице 3 можно увидеть количество ДНК в гомогенатах на картах через 24 месяца хранения при +45°С при оценке стабильности по коротким фрагментам.

Как и в случае с длинными фрагментами, наибольшая сохранность ДНК в образцах показана в хлоропластной ДНК - 97,7%, наибольшая деградация отмечена в ядерной ДНК - 89,5%.

Список используемых источников.

1. Karp A., Seberg О. L. Е., Buiatti М. Molecular techniques in the assessment of botanical diversity // Annals of Botany. - 1996. - T. 78. - №. 2. - C. 143-149.

2. Kelleher С.Т. et al. Species distinction in Irish populations of Quercus petraea and Q. robur: morphological versus molecular analyses // Annals of Botany. - 2005. - T. 96. - №. 7. - C. 1237-1246.

3. Lowe A., Harris S., Ashton P. Ecological genetics: design, analysis, and application. - John Wiley & Sons, 2009.

4. Tautz D. et al. A plea for DNA taxonomy // Trends in Ecology & Evolution. - 2003. - T. 18. - №. 2. - C. 70-74.

5. Lipscomb D., Platnick N., Wheeler Q. The intellectual content of taxonomy: a comment on DNA taxonomy //Trends in Ecology & Evolution. - 2003. - Т. 18. - №. 2. - C. 65-66.

6. Kristiansen K.A. et al. DNA taxonomy-the riddle of Oxychloe (Juncaceae) // Systematic Botany. - 2005. - T. 30. - №. 2. - C. 284-289.

7. Chase M.W. et al. Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals // Philosophical Transactions of the Royal Society В: Biological Sciences. - 2005. - T. 360. - №. 1462. - C. 1889-1895.

8. Palmer J.D., Soltis D.E., Chase M.W. The plant tree of life: an overview and some points of view // American Journal of Botany. - 2004. - T. 91. - №. 10. - C. 1437-1445.

9. http://www.tolweb.org.tree

10. Макаренко M.C., Хачумов B.A., Усатов A.B., Корниенко И.В. Стабильность молекул ДНК при длительном хранении листьев подсолнечника в условиях гербария // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». - Ростов н/Д. - 2015. - С. 98-99.