Способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды

Изобретение относится в целом к области биологии, преимущественно к области экологического мониторинга, более точно к способам оценки экологического состояния окружающей среды посредством использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов, выделяемых из пробы.

Далее в тексте заявителем использованы термины, которые необходимы для облегчения однозначного понимания сущности заявленных материалов и исключения противоречий и/или спорных трактовок при выполнении экспертизы.

Антиген — любое вещество, которое, поступая в организм парентеральным путем, вызывает ответную специфическую иммунологическую реакцию, проявляющуюся в образовании специфических антител [1].

Биоиндикация — оценка качества природной среды по состоянию её биоты. Биоиндикация основана на наблюдении за составом и численностью видов-индикаторов индикаторных организмов — биоиндикаторов.

Индикаторные организмы (биоиндикаторы) — виды, группы видов или сообщества, по наличию, степени развития, изменению морфологических, структурно-функциональных, генетических характеристик которых судят о качестве воды и состоянии экосистем [2].

Сапробность — комплекс физиолого-биохимических свойств организма, обусловливающий его способность обитать в воде с тем или иным содержанием органических веществ, то есть с той или иной степенью загрязнения [3].

Для оценки степени загрязнения водоемов органическими веществами установлены пять зон загрязнения: поли-, a-мезо, b-мезо, олигосапробную и ксеносапробную [4].

Сапробионты разделены на три группы:

- Организмы собственно сточных вод — полисапробионты (p-сапробы);

- Организмы сильно загрязненных вод — мезосапробионты (две подгруппы — α-мезосапробы и β-мезосапробы);

- Организмы слабозагрязненных вод — олигосапробы (o-сапробы)

- Организмы чистых вод – ксеносапробы (х-сапробы).

Биота — исторически сложившаяся совокупность видов живых организмов, объединённых общей областью распространения в настоящее время или в прошедшие геологические эпохи [5].

Гидробионты – организмы, постоянно обитающие в водной среде. [6].

Организм - это живое тело, обладающее совокупностью свойств, отличающих его от неживой материи, в том числе обменом веществ, самоподдерживанием своего строения и организации, способностью воспроизводить их при размножении, сохраняя наследственные признаки [7].

Зоопланктон - водные животные, которые не могут противостоять течениям и пассивно переносятся вместе с водными массами [8].

Зообентос — включает в себя организмы, относящиеся к разным систематическим группам — членистоногим, моллюскам, червям [9].

Фитопланктон – совокупность свободно дрейфующих в толще воды морских и континентальных водоёмов организмов, которые могут осуществлять процесс фотосинтеза; фитопланктон является первичным продуцентом органического вещества в водоёме и служит пищей для зоопланктона и зообентоса [10].

По мнению заявителя, следует обратить внимание на следующие описанные выше понятия, имеющие существенное значение для заявленного технического решения - индикаторные организмы и сапробность. Указанные понятия имеют различный смысл и различное назначение: сапробность - это способность организма обитать в воде с тем или иным содержанием органических веществ, то есть с той или иной степенью загрязнения, а индикаторные организмы характеризуют качество воды и экосистем и могут существовать только в одной (или переходной) зоне сапробности.

Результативность природоохранных мер зависит от своевременного получения достоверных данных экологического мониторинга, используемых для оценки и диагностики экологического состояния окружающей среды.

Как известно, оценку экологического состояния окружающей среды выполняют различными способами с использованием различных методов, например физических, химических, биологических с использованием различных репрезентативных показателей среды. Одним из высокоинформативных способов оценки экологической обстановки является способ биоиндикации, то есть выявление реакции живых организмов на изменение условий среды их обитания, например – загрязнение или очищение среды обитания [11].

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Sladechek V. System of water quality from the biological point of view (Система оценки качества воды...) Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol, 1973. – Р.179-191] [12]. Краткой сущностью известного технического решения является сопоставление видов в пробе со списком индикаторных видов и присвоение видам в пробе индикаторной значимости. Способ предполагает идентификацию гидробионтов в пробе по морфологическим (внешним) признакам, например, конфигурации организма, окрасу и т.д., визуально с использованием микроскопа путем выполняемых вручную манипуляций, как то - извлечение организма из пробы в целом состоянии и его визуальная идентификация. Оценку экологического состояния окружающей среды выполняют на основе изучения обитающих в исследуемой среде гидробионтов (видов-индикаторов).

Недостатком известного технического решения является высокая трудоемкость и сложность определения видов-индикаторов с одновременным использованием оптических приборов, справочников-определителей, необходимость привлечения специалистов высокой квалификации, что не позволяет с высокой эффективностью использовать его (известный способ) по назначению.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий/ под ред. С.Я. Цалолихина. – СПб.: Изд. «Наука», 1994. – 394 с.] [13]. Сущностью известного технического решения является способ идентификации вида-индикатора на основе выявления и анализа морфологических признаков индикаторного организма, идея способа идентична аналогу [12], приведенному выше.

Недостатками известного способа являются существенная времязатратность осуществления идентификации вида-индикатора и зависимость результатов оценки по морфологическим признакам от квалификации и субъективности эксперта. Кроме того, известный способ обладает недостаточной разрешающей способностью и достоверностью результатов из-за существования видов-двойников, имеющих схожее внешнее строение и существующего в природе гетероморфного жизненного цикла некоторых живых организмов, то есть происходящего в течение жизни изменения внешнего вида определяемого организма.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс. http://www.polismed.com/articles-immunofermentnyjj-analiz-ifa-elisa-sut-princip-metoda-i-ehtapy-issledovanija.html] [14]. Сущностью известного технического решения является метод иммуноферментного анализа (ИФА), который используют для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций в растениях, животных, человеке и других материалах путем выявления свойственных этим возбудителям уникальных антигенов к маркерным белкам.

Известное техническое решение использовано заявителем для получения количества белка сапробных групп индикаторных организмов.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен патент на изобретение WO9946401 «Use of 14-3-3 proteins as sensitive biological markers for detecting pollution caused, inter alia, by polychlorinated biphenyl (PCB) and (xeno)oestrogen and method for quick determination of 14-3-3 proteins» [15] («Использование белков 14-3-3 в качестве чувствительных биологических маркеров для обнаружения загрязнения, вызванного, среди прочего, полихлорированным бифенилом (ПХБ) и (ксено) эстрогеном и методом быстрого определения белков 14-3-3»). Сущностью известного технического решения является способ обнаружения природных и антропогенных экологических химических веществ, в частности полихлорированных бифенилов и / или (ксено) эстрогенов в водоемах или в почве, характеризующийся тем, что 14-3-3 белков в качестве биомаркеров в биоиндикаторных организмах (позвоночных и беспозвоночных), соответствующая той, которая должна быть исследована, подвергаться воздействию воды или почвы. Способ определения и определения концентрации белка(ов) 14-3-3 (= ELISA), отличающийся тем, что микротитрационные планшеты используются для специфического связывания (и концентрации) белков 14-3-3 с пептид, имеющий связывающий мотив покрытого белком 14-3-3. Например, можно использовать активированные малеимидом микротитрационные планшеты, к которым химически синтезированный пептид CAALPKINRSApSEPSLHR (pS фосфосерин), который связывается с высоким сродством с белками 14-3-3, связан реакцией сульфгидрильной группы N- концевой цистеин. После добавления экстрактов или биологических жидкостей, подлежащих исследованию, в лунки планшета для микротитрования обнаружение и количественное определение образовавшихся белковых комплексов пептида-14-3-3 происходит, например, с помощью меченых антител, таких как конъюгат с щелочной фосфатазой антитела. В качестве альтернативы можно использовать покрывающие стрептавидином микротитрационные планшеты, к которым биотинилированный пептид связывается с моментом связывания белка 14-3-3; инкубация биотинилированного пептида с образцом (образование белковых комплексов пептида 14-3-3) проводится до или после его связывания с пластиной. Предел обнаружения ELISA составляет не менее 10 нг 14-3 3 белка / мл и может быть увеличен до менее 1 нг / мл, например, путем последующего прекращения цветовой реакции. Использование метода ELISA по п.2 формулы изобретения для определения и количественного определения белка 14-3-3 у позвоночных и беспозвоночных, подвергнутых воздействию природных и антропогенных экологических химических веществ, полихлорированных бифенилов и / или (ксено) эстрогенов. Использование метода ELISA по п.2 формулы изобретения для обнаружения и количественного определения белка 14-3-3 в биологических жидкостях (например, спинномозговой жидкости и сыворотке) людей и животных, инфицированных возбудителем прионных заболеваний.

Таким образом, изобретение относится к использованию нового биологического маркера, а именно - одного или нескольких белков 14-3-3, для обнаружения антропогенной нагрузки в пресной воде, морской воде, питьевой воде или образцах почвы природных и антропогенных химических продуктов, полученных из окружающей среды, в частности, полихлорированного бифенила (ПХБ) и / или эстрогена / ксеноэстрогена [(ксено) эстрогена] и (2) нового метода (метод ELISA) для количественного и количественного измерения белков 14-3-3. Указанный метод ELISA также может быть использован для обнаружения появления белка 14-3-3 в физиологических жидкостях человека и животных, инфицированных патогенным агентом, ответственным за прионные заболевания.

Недостатком известного технического решения, в отличие от заявленного технического решения, по мнению заявителя, является то, что известный метод не нашел использования для оценки экологического состояния окружающей среды.

Наиболее близким к заявленному техническому решению, выбранным заявителем в качестве прототипа, является изобретение по патенту RU 2661739 [16] «Способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды». Сущностью известного технического решения способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды, включающий отбор из оцениваемой среды проб организмов с последующим анализом этих проб, отличающийся тем, что при анализе идентификацию видового состава организмов из пробы осуществляют с применением маркерных белков живых организмов, обитающих в водной среде, а оценку экологического состояния окружающей среды производят в соответствии с идентифицированным видовым составом индикаторных организмов и их соотношением в пробе, то есть иммуноферментным анализом определяют количество маркерных белков каждого из индикаторных организмов в пробе, к которым получены антитела, суммируют количество маркерных белков, содержащихся в пробе индикаторных организмов, рассчитывают частоту встречаемости индикаторных организмов в пробе путем деления количества маркерного белка каждого организма на суммарное количество маркерных белков всех организмов в пробе, последующего суммирования произведений частоты встречаемости каждого индикаторного организма на его индикаторный вес и получают суммарный индикаторный вес (СИВ) организмов в пробе, по которому оценивают экологическое состояние окружающей среды; при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают слабозагрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают умеренно загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий.

Недостатком прототипа, по сравнению с заявленным техническим решением, является наличие признака - идентификация видового состава организмов из пробы, которую (идентификацию) осуществляют с применением маркерных белков живых организмов, обитающих в водной среде.

Указанный признак, по мнению заявителя, по сравнению с заявленным техническим решением, приводит к снижению технологичности при использовании по назначению, что, как следствие, приводит к увеличению материальных затрат, трудовых затрат, временных затрат. То есть, низкая технологичность приводит к увеличению затрат, например, на индивидуальное выделение и идентификацию каждого вида индикаторного организма в пробе. При этом в заявленном техническом решении указанное действие отсутствует, заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов, что приводит к более высокой технологичности, обеспечивая повышение эффективности при его использовании по назначению. При этом формальное снижение количества признаков приводит фактически к более высокому техническому результату, что, по мнению заявителя, соответствует критерию «изобретательский уровень».

Доказательством указанного выше является детальный сопоставительный анализ прототипа с заявленным техническим решением, который приведен на Фиг. 5. Анализ Таблицы сопоставительного анализа показывает, что заявленное техническое решение совпадает с прототипом по 2 признакам – по названию и отбору проб и не совпадает по 7 признакам из 9. При этом 1 признак - идентификации видового состава организмов - имеющийся у прототипа, отсутствует в заявленном техническом решении.

В целом у заявленного технического решения по сравнению с прототипом при наличии меньшего количества признаков (8 против 9 у прототипа) достигается более высокий технический результат, так как исключена необходимость выполнения весьма трудоемкого и затратного процесса идентификации видового состава организмов.

При этом из исследованного уровне техники не выявлена технология, позволяющая достигнуть такого высокого уровня результатов – определение сапробных групп индикаторных организмов.

Заявленное техническое решение позволяет разрешить, казалось бы, неразрешимое на дату подачи заявки противоречие – определение сапробных групп индикаторных организмов, затрачивая при этом такое же количество материальных средств, сколько требуется на идентификацию одного вида организма по прототипу. При этом повышается доступность заявленного технического решения при использовании по назначению, так как обеспечивается возможность снижения (на порядок) затрат при одновременном упрощении технологичности. Так, стоимость получения одного антитела к одному белку одного индикаторного организма на рынке составляет не менее 100 тыс. руб., при этом при оценке экологического состояния водоема анализу подвергается от 10 до 100 и более организмов (в зависимости от состояния водоема). То есть, можно сделать доказательный вывод, что при применении способа по прототипу затраты составляют от 1 млн. руб. (в случае идентификации 10 видов организмов) по сравнению со 100 тыс. руб. по заявленному техническому решению (при определении 1 сапробной группы из 10 видов организмов). При этом указанный эффект достигается за счет отсутствия одного признака - идентификации видового состава организмов.

Таким образом представляется возможным сделать вывод о том, что в заявленном техническом решении достигнуто разрешение противоречия в том, что при необходимости повысить качество результатов в случаях обычного проектирования прибегают к повышению либо количества действий, либо затрат, что усложняет технологию. В заявленном же техническом решении заявителю удалось повысить качество результатов при одновременном снижении количества действий и вытекающих из этого затрат. Это подтверждает изобретательский уровень заявленного технического решения, так как не является очевидным для специалиста в данной области техники.

Основываясь на изложенном, по мнению заявителя, можно сделать вывод, что заявленное техническое решение не подпадает под действие п. 77 Правил составления, подачи и рассмотрения заявок на изобретения, то есть соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», так как вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробной группы индикаторных организмов, что дает превышающий суммарный технический эффект.

Таким образом, принимая во внимание выполненный выше анализ исследованного уровня техники, можно сделать доказательный вывод о том, что заявленное техническое решение не имеет аналогов по совпадающим признакам, т.к. из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, используемые заявленную совокупность признаков, представленных в независимом пункте формулы предполагаемого изобретения в силу чего заявителем была составлена формула без ограничительной части, т.к. в заявленном техническом решении частично совпадает название и признак по отбору проб из водоёма, который является формальным, т.к. отбор проб предполагается в любом способе.

Целью заявленного технического решения является разработка нового способа использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды посредством использования заявленной совокупности признаков, обеспечивающих снижение трудоёмкости работ, сокращение сроков оценки экологического состояния окружающей среды, повышение точности и достоверности результатов экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер посредством того, что вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов.

Техническим результатом заявленного технического решения является способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды, в котором (способе) вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1 – Фиг.5.

На Фиг.1 приведена Таблица 1, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов по белку цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее - СО1);

На Фиг.2 приведена Таблица 2, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зообентосных организмов по белку СО1;

На Фиг.3 приведена Таблица 3, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных фитопланктонных организмов по белку хлоропластного продукта гена ribulose 1-5 bifosfaat carboxylase Large subunit (далее – rbcL).

На Фиг.4 приведена Таблица 4, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) по белку СО1 сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов, отобранных из озера Малое Глубокое Республики Татарстан;

На Фиг.5 приведена Таблица сопоставительного анализа прототипа с заявленным техническим решением.

Сущностью заявленного технического решения является способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды, заключающийся в том, что отбирают пробу организмов из оцениваемой среды, проводят анализ аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных организмов на определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных организмов, получают антитела, специфически распознающие эти участки аминокислотных последовательностей маркерных белков, иммунно-ферментным анализом определяют количество маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, к которой - сапробной группе - получены антитела, определяют суммарное количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных организмов, рассчитывают частоту встречаемости каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, для чего количество маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных организмов делят на суммарное количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных организмов в пробе, рассчитывают суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема, для чего частоту встречаемости каждой сапробной группы индикаторных организмов умножают на её – сапробной группы - индикаторный вес, равный 0,1 для ксеносапробной группы, 1,0 для олигосапробной группы, 2,0 для b-мезосапробной группы, 3,0 для а-мезосапробной группы, 4,0 для полисапробной группы, полученные результаты суммируют, оценивают экологическое состояние окружающей среды - при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают удовлетворительной чистоты, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий. Далее заявителем приведены предварительные пояснения к Примерам 1-5 конкретного осуществления заявленного технического решения.

Заявители ограничились Примерами с преимущественным использованием обитателей водной среды – зоопланктона, зообентоса и фитопланктона потому, что экологическое состояние находящегося на местности водоема безоговорочно, достоверно, в необходимом для восстановления нарушенного состояния окружающей среды объеме, наиболее объективно характеризует и отражает экологическое состояние окружающей водоем неводной среды – прибрежной и примыкающей к ней почвы, растительности и обитателей почвы, окружающего воздуха и обитателей воздушной и наземно-воздушной среды. Характеризует экологическое состояние окружающей водоем неводной среды потому, что водоем на местности является местом сбора атмосферных осадков (например – несущих информацию о воздушной среде дождей, снега, пыли, частиц воды в тумане), стоков талых и иных стекающих в водоем вод, опадающей листвы растений, смытых или сбитых насекомых – всех поступлений в водоем, несущих с собой (в водоем) влияющие на окружающую среду вещества. Все эти поступления (дождь, пыль, стоки, оседающий на водоем туман, талые воды и т.д.) из окружающей водоем среды сначала впитывают характеризующую отдельные составляющие окружающей среды информацию, например – в виде наличия (или отсутствия) неблагополучия среды. Затем, стекая, опадая, оседая в водоем, влияют на содержание водной среды и естественно – влияют на обитателей этой водной среды. По этой причине водоём является местом сбора и наиболее полной концентрации всей информации об окружающей водоём среде. А обитатели водоёма, например – планктонные организмы, являются наиболее удобными модельными объектами исследования, оптимальным образом и полно характеризующими экологическое состояние окружающей среды. Руководствуясь этим бесспорным фактором, заявители ограничились количеством примеров и привели в качестве Примеров использование планктонных организмов – вездесущих обитателей водоёмов.

Использование в качестве индикаторных организмов обитателей водной среды имеет информативное преимущество по сравнению с использованием обитателей других сред, которые отражают состояние только воздушной или только почвенной составляющей окружающей среды. Таким образом, использование индикаторных организмов – обитателей неводной среды менее информативно, а результаты оценки менее достоверны по сравнению с оценкой экологического состояния окружающей среды с использованием обитателей водоема. Например, использование муравьев позволяет оценить экологическое состояние преимущественно суши, использование пчёл – преимущественно экологическое состояние суши и воздушной среды. Но использованием муравьёв и пчёл невозможно оценить экологическое состояние водной составляющей окружающей природной среды. Обитатели водной среды несут наиболее полную и достоверную информацию об экологическом состоянии окружающей среды. Поэтому заявитель ограничился Примерами с использованием индикаторных организмов из приоритетной водной среды. При использовании обитателей неводных сред, например – почв, водно-воздушной и наземно-воздушной, порядок действий аналогичен действиям, описанным в Примерах 1, 2, 3, 4, 5.

При этом использование иных, кроме обитателей водоема, видов индикаторных организмов – обитателей окружающей среды, например – почвенной, воздушно-водной, воздушно – наземной сред, как в отдельности, так и в любом их сочетании также позволяет оценивать экологическое состояние окружающей среды по заявленному техническому решению, но с меньшей точностью и, как следствие, с меньшей достоверностью.

Далее заявителем приведен общий алгоритм действий, обеспечивающий возможность реализации заявленного технического решения.

Действие 1. Отбирают пробы организмов из оцениваемой водной среды известными методами.

Действие 2. Проводят анализ организмов на определение участков аминокислотных последовательностей любых маркерных белков, уникальных для сапробных групп индикаторных организмов, в результате чего получают антитела, специфически распознающие эти участки аминокислотных последовательностей маркерных белков.

Действие 3. Определяют количество (в нанограммах – нг) маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, к которым были получены антитела известным методом иммунно-ферментного анализа (ИФА).

Действие 4. Определяют суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных организмов.

Действие 5. Оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса сапробных групп индикаторных организмов в пробе. В соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [17], при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают удовлетворительной чистоты, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий.

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения в соответствии с описанными выше Действиями.

Всего заявителем рассмотрены 5 Примеров использования маркерных белков индикаторных организмов, а именно:

- в Примере 1 рассмотрен случай оценки экологического состояния окружающей среды с использованием маркерного белка СО1 зоопланктонных индикаторных организмов.

- в Примере 2 рассмотрен случай оценки экологического состояния окружающей среды с использованием маркерного белка СО1 других (отличных от зоопланктонных организмов) индикаторных организмов – зообентосных организмов (зообентоса).

- в Примере 3 рассмотрен случай оценки экологического состояния окружающей среды с использованием другого (отличного от СО1) маркерного белка – rbcL других (отличных от зоопланктона и зообентоса) индикаторных организмов – фитопланктона.

- в Примере 4 рассмотрен случай, показывающий возможность экспериментального получения отсутствующих в базах данных аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных видов организмов с целью дальнейшего пополнения международных баз данных аминокислотных последовательностей, используемых для оценки экологического состояния окружающей среды.

- в Примере 5 рассмотрен случай проведения сопоставления результатов заявленного технического решения с результатами экспертной оценки экологического состояния водоема – озера Малое Глубокое Республики Татарстан и окружающей озеро природной среды.

Пример 1. Оценка экологического состояния окружающей среды с использованием маркерного белка СО1 зоопланктонных индикаторных организмов.

Действие 1. Отбирают пробу зоопланктонных организмов из расположенного в исследуемом регионе водоема известным способом [Винберг Г.Г. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева // Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1982. – 33 с.] [18], например – с использованием марлевого сачка.

Действие 2. Проводят анализ организмов на определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов, по маркерному белку - митохондриальному белку цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1), для чего выполняют следующие шаги:

- Создают выборку аминокислотных последовательностей митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1) из международной базы данных, например – TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов, например – из [12] по каждой сапробности – от чистой o-, загрязнённой b -, до грязной p-;

- Осуществляют множественное выравнивание, например – с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков, например – цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1);

- Идентифицируют участки аминокислотных последовательностей маркерного белка СО1, уникальные для каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов;

- Определяют индикаторный вес каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов по [12]:

• о-сапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков (далее по тексту – а.о.), например – а.о. в позиции 31-35 (FLGDE) для о-сапробной группы индикаторных организмов родов Macrotrachela – Macrotrachela multispinosa ACI46270, Macrotrachela papillosa ABV44838 и Synchaeta – Synchaeta grandis AFD23515, Synchaeta kitina AFD23607, Synchaeta tremula ACD12432 (индикаторный вес = 1.0);

• b-мезосапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 31-35 (YLGDE) для b-мезосапробной группы индикаторных организмов родов Brachionus – Brachionus bidentatus AFQ31179, Brachionus diversicornis AFO72004, Brachionus plicatilis AAM47413 и Mytilina – Mytilina mucronata ABC02135, Mytilina ventralis macracantha AFQ31437 (индикаторный вес = 2.0);

• p-сапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 154-158 (FVWSV) для p-сапробной группы индикаторных организмов рода Chironomus – Chironomus plumosus BAR73215, Chironomus thummi AAD44526 (индикаторный вес = 4);

- Получают антитела, специфически распознающие вариабельные участки маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов в пробе, например, для белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее – СО1), например:

• FLGDE для о-сапробной группы индикаторных организмов родов Macrotrachela и Synchaeta;

• YLGDE для b-мезосапробной группы индикаторных организмов родов Brachionus и Mytilina;

• FVWSV для p-сапробной группы индикаторных организмов рода Chironomus.

Антитела получают по методике производителя антител, например – фирмы ООО Биалекса (Россия) с использованием стандартных моделей исследования животных, например – кролика (http://www.bialexa.ru/).

Накапливают полученные антитела в хранилище, например – в холодильнике при температуре минус 30 °С, хранят и используют для оценки экологической ситуации, причем – без необходимости повторного выполнения работ по Действию 2.

Действие 3. Определяют количество (в нанограммах – нг) маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов в пробе, к которым были получены антитела известным методом иммунно-ферментного анализа (ИФА) [Van Weemen B.K., Schuurs A.H. (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 (3): 232–236. doi:10.1016/0014-5793(71)80319-8. PMID 11945853] [19], для чего:

- отделяют зоопланктонные организмы в пробе от воды путем центрифугирования, например, на центрифуге СМ-6МТ, например, в пробирке ёмкостью 50 мл;

- гомогенизируют зоопланктонные организмы в дистиллированной воде при соотношении вода : организмы по объему 1 : 1 (один к одному), например – путем растирания организмов в ступе с чистым толченым стеклом, и получают гомогенат;

- выполняют центрифугирование гомогената, например – в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, и получают супернатант (надосадок);

- помещают супернатант в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом);

- получают количество белков ИФА-методом [19], например:

• белок СО1 о-сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов – 0,40 нг;

• белок СО1 b-мезосапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов – 0,05 нг;

• белок СО1 p-сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов – 0,05 нг.

Действие выполняют раздельно для каждого антитела к маркерному белку каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов.

Действие 4. Определяют суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов, для чего:

- Определяют суммарное ∑ количество маркерных белков всех сапробных групп, содержащихся в пробе индикаторных зоопланктонных организмов, например, ∑ = (0,40+0,05+0,05) нг = 0,50 нг.

- Рассчитывают частоту f встречаемости каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов в пробе, для чего количество маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов делят на суммарное ∑ количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов в пробе.

Так, например:

• частота встречаемости о-сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов f = 0,40/(0,40+0,05+0,05) = 0,40/0,50 = 0,80 =0,8;

• частота встречаемости b-мезосапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов f = 0,05/(0,40+0,05+0,05) = 0,05/0,50 = 0,10;

• частота встречаемости p-сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов f = 0,05/0,50=0,10;

- Рассчитывают суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема, для чего частоту f встречаемости каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов умножают на её (группы) индикаторный вес [12], полученные результаты суммируют:

СИВ = 0,80 х 1,00 + 0,10 х 2,00 + 0,10 х 4,00 = 0,80 + 0,20 + 0,40 = 1,4.

Действие 5. Оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса сапробных групп индикаторных организмов в пробе. Оценку производят в соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [17], подробно описанной в приведенном выше алгоритме действий для осуществления заявленного технического решения (Действие 5).

Суммарный индикаторный вес сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов СИВ = 1,4 (Таблица 1 на Фиг. 1) (в диапазоне 0,5< СИВ< 1,5), что по эколого-санитарной классификации [11] соответствует o-сапробной зоне водоема, т.е. водоем находится в состоянии вполне чистом.

По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют (оценивают) чистой и благополучной, в настоящее время не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий.

Таким образом, из Примера 1 видно, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат – разработан способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов, по которому на примере зоопланктонных организмов проведена оценка экологического состояния среды, окружающей водоем.

Из данных, приведенных в Примере 1, видно, что три сапробные (o-, b-, p-) группы состоят суммарно из 12 видов индикаторных зоопланктонных организмов, а именно:

- o-сапробная группа состоит из 5-ти видов индикаторных зоопланктонных организмов,

- b-мезосапробная группа состоит из 5-ти организмов,

- p-сапробная группа – из 2-х организмов.

К каждой из трех сапробных групп зоопланктонных организмов получают антитела, т.е. по заявленному техническому решению получают 3 антитела.

При сравнении с прототипом, в котором к 12 видам индикаторных зоопланктонных организмов необходимо получение 12 антител, можно сделать доказательный вывод о том, что в результате использования заявленного технического решения для оценки экологического состояния окружающей среды представляется возможным сэкономить материальные, трудовые и временные затраты не менее, чем в 4 раза (12 антител получают по прототипу против 3 у заявленного). При этом в заявленном техническом решении отсутствует весьма значимый у прототипа признак - идентификация видового состава организмов. То есть сокращение количества признаков в заявленном техническом решении привело к реализации всех поставленных задач и заявленных технических результатов, что привело к существенному снижению совокупных затрат при использовании по назначению – не менее, чем в 4 раза.

Пример 2. Оценка экологического состояния окружающей среды с использованием маркерного белка СО1 других (отличных от зоопланктонных организмов) индикаторных организмов – зообентосных организмов (зообентоса).

Зообентос – совокупность донных животных, обитающих на грунте и в грунте морских и континентальных водоёмов.

Действие 1. Отбирают пробу зоопланктонных организмов из расположенного в исследуемом регионе водоема известным способом [Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зообентос и его продукция. / Ред. Г.Г.Винберг, Г.М.Лаврентьева. – Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР. – 51 с.] [20], например – с использованием дночерпателя – отбирают пробу зообентосных организмов.

Действие 2. Проводят анализ организмов на определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов, по маркерному белку митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1), для чего выполняют следующие шаги:

- Создают выборку аминокислотных последовательностей вариабельного митохондриального белка СО1 из международной базы данных, например – TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов, например – [12] по каждой сапробности - от предельно чистой x-, чистой o-, до загрязненной b-;

- Осуществляют множественное выравнивание, например – с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков СО1;

- Идентифицируют участки аминокислотных последовательностей маркерного белка, уникальные для каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов, например – для белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1).

- Определяют индикаторный вес каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов по [12]:

• x-сапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков (далее по тексту – а.о.), например – а.о. в позиции позиции 95-99 (PLSAG), для x-сапробной группы организмов родов Protonemura – Protonemura meyeri AGZ03513 и Dinocras – Dinocras cephalotes AGU13981 (индикаторный вес = 0.1);

• о-сапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 95-99 (PLSSN) для о-сапробной группы организмов рода Silo – Silo pallipes ANZ02284, Silo piceus ANY51527 и Wormandia subnigra ANY50378, Philopotamus montarus AII16166 (индикаторный вес = 1.0);

• b-мезосапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 95-99 (PLAGA) для b-мезосапробной группы организмов родов Coenagrion – Coenagrion puella AMO65757 и Pyrrhosoma – Pyrrhosoma nymphula AMB62102 (индикаторный вес = 2.0).

- Получают антитела, специфически распознающие участки аминокислотных последовательностей маркерного белка, уникальные для каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов в пробе, например – для белка СО1, например:

• PLSAG для x-сапробной группы индикаторных организмов родов Protonemura и Dinocras;

• PLSSN для о-сапробной группы индикаторных организмов родов Silo и Wormaldia;

• PLAGA для b-мезосапробной группы индикаторных организмов организмов родов Coenagrion и Pyrrhosoma.

Антитела получают по методике производителя антител, например – фирмы ООО Биалекса (Россия) с использованием стандартных моделей исследования животных, например – кролика (http://www.bialexa.ru/).

Накапливают полученные антитела в хранилище, например – в холодильнике при температуре минус 30 °С, хранят и используют для оценки экологического состояния окружающей среды, причем – без необходимости повторного выполнения работ по Действию 2.

Действие 3. Определяют количество (в нанограммах – нг) маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов в пробе, к которым были получены антитела известным методом иммунно-ферментного анализа (ИФА) [Van Weemen B.K., Schuurs A.H. (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 (3): 232–236. doi:10.1016/0014-5793(71)80319-8. PMID 11945853] [19]:

- отделяют зообентосные организмы в пробе от воды путем центрифугирования, например, на центрифуге СМ-6МТ, например, в пробирке ёмкостью 50 мл;

- гомогенизируют зообентосные организмы в дистиллированной воде при соотношении вода : организмы по объему 1 : 1 (один к одному), например – путем растирания (организмов) в ступе с чистым толченым стеклом, и получают гомогенат;

- выполняют центрифугирование гомогената, например – в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, и получают супернатант (надосадок);

- помещают супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом);

- получают количество белков ИФА-методом [19], например:

• белок СО1 х-сапробной группы индикаторных зообентосных организмов – 0,10 нг;

• белок СО1 о-сапробной группы индикаторных зообентосных организмов – 0,20 нг;

• белок СО1 b-мезосапробной группы индикаторных зообентосных организмов – 0,40 нг.

Действие 3 выполняют раздельно для каждого антитела к маркерному белку каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов.

Действие 4. Определяют суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зообентосных организмов, для чего:

- Определяют суммарное ∑ количество маркерных белков всех сапробных групп, содержащихся в пробе индикаторных зообентосных организмов, например: ∑ = (0,10+0,20+0,40) нг = 0,70 нг.

- Рассчитывают частоту f встречаемости каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов в пробе, для чего количество маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов делят на суммарное ∑ количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных зообентосных организмов в пробе.

Так, например:

– частота встречаемости x-сапробной группы индикаторных зообентосных организмов f = 0,10/0,70 = 0,14;

- частота встречаемости о-сапробной группы индикаторных зообентосных организмов f = 0,20/0,70 =0,29;

- частота встречаемости b-мезосапробной группы индикаторных зообентосных организмов f = 0,40/0,70 = 0,57.

- Рассчитывают суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зообентосных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема, для чего частоту f встречаемости каждой сапробной группы индикаторных зообентосных организмов умножают на её (группы) индикаторный вес [12], полученные результаты суммируют:

СИВ = 0,14 х 0,1 + 0,29 х 1,0 + 0,57 х 2,0 = 0,014+0,29+1,14= 1,44

Действие 5. Оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса сапробных групп индикаторных организмов в пробе.

Суммарный индикаторный вес сапробных групп индикаторных зообентосных организмов в пробе СИВ = 1,44 (Табл. 2 на Фиг. 2) (в диапазоне 0,5< СИВ< 1,5), что соответствует o-сапробной зоне водоема. В соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [11], по индексу загрязненности 1,44 водоем соответствует o-сапробной зоне, т.е. водоем находится в состоянии вполне чистом.

По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют (оценивают) чистой и благополучной, в настоящее время не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий.

Таким образом, Пример 2 также является подтверждением достижения поставленных целей и заявленного технического результата – разработан способ, по которому проведена оценка экологического состояния среды, окружающей водоем с использованием зообентосных организмов по маркерному белку СО1.

Из данных, приведенных в Примере 2 видно, что три сапробные группы (x-, o-, b-) зообентосных индикаторных организмов состоят суммарно из 8 видов:

- х-сапробная группа состоит из 2-х видов индикаторных зообентосных организмов,

- о-сапробная группа состоит из 4-х видов организмов,

- b-мезосапробная группа – из 2-х видов.

К каждой из трех сапробных групп получают антитела, т.е. по заявленному техническому решению получают 3 антитела.

При сравнении с прототипом, в котором к 8 видам индикаторных зообентосных организмов необходимо получение 8 антител, можно сделать доказательный вывод о том, что в результате использования заявленного технического решения для оценки экологического состояния окружающей среды представляется возможным сэкономить материальные, трудовые и временные затраты не менее, чем в 2,7 раза (8 антител получают по прототипу против 3 у заявленного). При этом в заявленном техническом решении отсутствует весьма значимый у прототипа признак - идентификация видового состава организмов. То есть сокращение количества признаков в заявленном техническом решении привело к реализации всех поставленных задач и заявленных технических результатов, что привело к существенному снижению совокупных затрат при использовании по назначению – не менее, чем в 2,7 раза.

Пример 3. Оценка экологического состояния окружающей среды с использованием другого (отличного от СО1) маркерного белка – rbcL других (отличных от зоопланктона и зообентоса) индикаторных организмов – фитопланктона.

Фитопланктон – совокупность свободно дрейфующих в толще воды морских и континентальных водоёмов организмов, которые могут осуществлять процесс фотосинтеза; фитопланктон является первичным продуцентом органического вещества в водоёме и служит пищей для зоопланктона и зообентоса.

Действие 1. Отбирают пробу зоопланктонных организмов из расположенного в исследуемом регионе водоема известным способом [Абакумов В.А. (ред.) Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений. Л.: Гидрометеоиздат, 1983. – 240 с.] [21], например – с использованием батометра – отбирают пробу фитопланктонных организмов.

Действие 2. Проводят анализ организмов на определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов, по маркерному белку - фрагменту хлоропластного продукта гена (белка) ribulose 1-5 bifosfaat carboxylase Large subunit (rbcL), для чего выполняют следующие шаги:

- Создают выборку аминокислотных последовательностей хлоропластного белка rbcL из международной базы данных, например – TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов, например – из [12] по каждой (от чистой до грязной) зоне сапробности, например – o-, b-, a-сапробности;

- Осуществляют множественное выравнивание, например – с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков, например – rbcL;

- Идентифицируют участки аминокислотных последовательностей маркерного белка, уникальные для каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов, например – для белка rbcL;

- Определяют индикаторный вес каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов по [12]:

• о-сапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 273-277 (YDTLL) для о-сапробной группы индикаторных организмов родов Rhopalodia – Rhopalodia gibba AQM56354 и Pinnularia – Pinnularia subcapitata var elongata AER42030 (индикаторный вес = 1.0);

• b-мезосапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 145-149 (YGTPL) для b-мезосапробной группы индикаторных организмов рода Surirella – Surirella capronii AGE34586, Surirella biseriata AGE34629, Surirella minuta AEB91278, Surirella tenera AGE34623 (индикаторный вес = 2.0);

• a-мезосапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 22-25 (DQYFA) для a-мезосапробной группы индикаторных организмов родов Navicula – Navicula cryptocephala AEB91223 и Cryptomonas – Cryptomonas ovata CAJ19660 (индикаторный вес = 3);

- Получают антитела, специфически распознающие вариабельные участки маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов в пробе, например – для белка rbcL, например:

• YDTLL для о-сапробной группы индикаторных организмов зоны Rhopalodia и Pinnularia;

• YGTPL для b-мезосапробной группы индикаторных организмов рода Surirella;

• DQYFA для a-мезосапробной группы индикаторных организмов родов Navicula и Cryptomonas;

Антитела получают по методике производителя антител, например – фирмы ООО Биалекса (Россия) с использованием стандартных моделей исследования (http://www.bialexa.ru/).

Накапливают полученные антитела в хранилище, например – в холодильнике при температуре минус 30 °С, хранят и используют для оценки экологической ситуации, причем – без необходимости повторного выполнения работ по Действию 2.

Действие 3. Определяют количество (в нанограммах – нг) маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов в пробе, к которым были получены антитела известным методом иммунно-ферментного анализа (ИФА) [Van Weemen B.K., Schuurs A.H. (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 (3): 232–236. doi:10.1016/0014-5793(71)80319-8. PMID 11945853] [19]:

- отделяют фитопланктонные организмы в пробе от воды путем центрифугирования, например, на центрифуге СМ-6МТ, например, в пробирке ёмкостью 50 мл;

- гомогенизируют фитопланктонные организмы в дистиллированной воде при соотношении вода : организмы по объему 1 : 1 (один к одному), например – путем растирания (организмов) в ступе с чистым толченым стеклом, и получают гомогенат;

- выполняют центрифугирование гомогената, например – в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, и получают супернатант (надосадок);

- помещают супернатант в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом);

- получают количество белков ИФА-методом [19], например:

– белок rbcL о-сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов – 0,05 нг;

- белок rbcL b-мезосапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов – 0,15 нг;

- белок rbcL а-мезосапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов – 0,50 нг.

Действие 3 выполняют раздельно для каждого антитела к маркерному белку каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов.

Действие 4. Определяют суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных фитопланктонных организмов, для чего:

- Определяют суммарное ∑ количество маркерных белков всех сапробных групп, содержащихся в пробе индикаторных фитопланктонных организмов, например: ∑= (0,05+0,15+0,50) = 0,70 нг.

- Рассчитывают частоту f встречаемости каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов в пробе, для чего количество маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов делят на суммарное ∑ количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных фитопланктонных организмов в пробе.

Так, например:

– частота встречаемости о-сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов f = 0,05/0,70 = 0,07;

- частота встречаемости b-мезосапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов f = 0,15/0,70 = 0,21;

- частота встречаемости а-мезосапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов f = 0,50/0,70 = 0,72;

- Рассчитывают суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных фитопланктонных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема, для чего частоту f встречаемости каждой сапробной группы индикаторных фитопланктонных организмов умножают на её (группы) индикаторный вес [12], полученные результаты суммируют:

СИВ = 0,07 х 1,0 + 0,21 х 2,0 + 0,72 х 3,0 = 0,07+0,42+2,16 = 2,65.

Действие 5. Оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса сапробных групп индикаторных фитопланктонных организмов в пробе.

Суммарный индикаторный вес сапробных групп индикаторных фитопланктонных организмов в пробе СИВ = 2,65 (Таблица 3 на Фиг.3) (в диапазоне 2,5 < СИВ < 3,5), что соответствует α–мезосапробной зоне водоема. В соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [11], по индексу загрязненности 2,65 водоем соответствует α–мезосапробной зоне, т.е. водоем находится в загрязненном состоянии.

По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют (оценивают) загрязнённой, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия.

Таким образом, Пример 3 также является подтверждением достижения поставленных целей и заявленного технического результата – разработан способ, по которому проведена оценка экологического состояния среды, окружающей водоем с использованием фитопланктонных организмов по маркерному белку rbcL.

Из данных, приведенных в Примере 3 видно, что три сапробные группы (o-, b-, a-) фитопланктонных индикаторных организмов состоят суммарно из 8 видов:

- о-сапробная группа состоит из 2-х видов индикаторных фитопланктонных организмов,

- b-мезосапробная группа состоит из 4-х видов индикаторных фитопланктонных организмов,

- a-мезосапробная группа – из 2-х видов.

К каждой из трех сапробных групп получают антитела, т.е. по заявленному техническому решению получают 3 антитела.

При сравнении с прототипом, в котором к 8 видам индикаторных фитопланктонных организмов необходимо получение 8 антител, можно сделать доказательный вывод о том, что в результате использования заявленного технического решения для оценки экологического состояния окружающей среды представляется возможным сэкономить материальные, трудовые и временные затраты не менее, чем в 2,7 раза (8 антител получают по прототипу против 3 у заявленного). При этом в заявленном техническом решении отсутствует весьма значимый у прототипа признак - идентификация видового состава организмов. То есть сокращение количества признаков в заявленном техническом решении привело к реализации всех поставленных задач и заявленных технических результатов, что привело к существенному снижению совокупных затрат при использовании по назначению – не менее, чем в 2,7 раза.

Пример 4, показывающий возможность экспериментального получения отсутствующих в базах данных аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных видов организмов с целью дальнейшего пополнения международных баз данных аминокислотных последовательностей, используемых для оценки экологического состояния окружающей среды.

На Примере 4 заявитель рассматривает возможность использования заявленного технического решения даже в случае, когда аминокислотные последовательности маркерных белков индикаторных видов организмов отсутствуют в международных базах данных, используемых для оценки экологического состояния окружающей среды, путем их (аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных видов организмов) экспериментального получения с целью дальнейшего пополнения международных баз данных, например – TrEMBL/SwissProt (http://www.uniprot.org/).

То есть в случае, рассматриваемом Примере 4, для оценки экологического состояния окружающей среды необходимо сначала экспериментально получить нуклеотидные последовательности гена, например, СО1 индикаторных организмов с последующей трансляцией их в аминокислотные последовательности маркерного белка, например, СО1 организмов, используя следующие действия:

Действие 1: Отбирают пробу организмов из расположенного в исследуемом регионе водоема известным способом.

Действие 2. Определяют видовой состав организмов в пробе – например, по вариабельному митохондриальному гену цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее по тексту – СО1), для чего выполняют следующие шаги:

- просматривают пробу организмов при увеличении, например – под микроскопом Axio Lab.A1(Carl Zeiss) и бинокуляром МБС–10, выделяют отдельный организм;

- каждый отдельный организм помещают в отдельную емкость, например – пробирку, содержащую, например – 50 микролитров 7% водного раствора ионообменной смолы Chelex и инкубируют, например – в течение 20 мин при температуре не менее плюс 90 °С, например – при плюс 99 °С. Получают очищенную ДНК в водном растворе;

Действие 3. Получают экспериментальную нуклеотидную последовательность гена, например, СО1 организмов с последующей трансляцией в аминокислотную последовательность маркерного белка, например, СО1 организмов, для чего:

- выполняют центрифугирование содержимого емкости с отобранным организмом, например – в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, получают ДНК-содержащий супернатант (надосадок). Супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом);

- осуществляют полимеразную цепную реакцию (далее по тексту – ПЦР) с использованием супернатанта в качестве матрицы. ПЦР проводят, например – в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5-кратную реакционную смесь qPCRmix-HS (фирмы Евроген, Россия), бидистиллированную воду, 0,4 мМ прямого и обратного праймеров, например – 5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3' и 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3'. Амплификацию осуществляют, например, 35-кратным повторением стадий в следующей последовательности: денатурация (при плюс 95 °С, 30 сек), отжиг (+59 °С, 30 сек) и элонгация (полимеризация при +72 °С, 120 сек), – используя известную комбинацию праймеров – 5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3' и 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3' [Folmer O. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates / O.Folmer, M.Black, W.Hoeh, R.Lutz, R.Vrijenhoek // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. – 1994. – V.3. – P.294–299] [22]. Таким образом получают достаточное для дальнейших процедур количество определенного (конкретного) фрагмента ДНК митохондриального гена цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1).

Фрагмент ДНК, например – СО1, является уникальным (единственным в своем роде) фрагментом гена, свойственным каждому виду среди всех видов живых организмов, что обеспечивает высокодостоверное, с точностью 99,9%, определение конкретного организма до вида. При этом для практического использования достаточно определение организма с точностью не менее 90%, то есть определение организма по вариабельным фрагментам гена в полной мере обеспечивает потребную для промышленного применения достоверность результатов.

- продукты ПЦР детектируют и очищают, например – электрофорезом в горизонтальном 1% агарозном геле. В качестве электродного буферного раствора для электрофореза используют, например, однократный раствор 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диола уксусной кислоты и этилендиаминтетраацетатной кислоты с рН 8,1 (далее по тексту – ТАЕ). Для нанесения проб используют буферный красящий раствор, например – состава: 10 mM Трис-HCl, pH 7,8, 50 mM ЭДTA, 0,03% бромфенолового синего, 0,03% ксилен цианолового, 15% глицерина. Пробу с красителем смешивают в соотношении 4 : 1 (8 : 2 мкл). Электрофорез проводят, например – при силе тока 50 мА, гель просматривают в ультрафиолетовом свете, например – на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция). Проявляют ДНК (полученную в результате ПЦР, пункт 1.2.1), добавляя в агарозу флуоресцирующий в ультрафиолетовом свете бромистый этидий в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Проявленная ДНК становится видимой в ультрафиолетовом свете, что подтверждает наличие ДНК в пробе.

- продукты ПЦР-амплификации выделяют из агарозного геля, например – с помощью набора реактивов фирмы Eurogen (Новосибирск, РФ) по методике производителя, путём добавления в 200 мкл лизирующего раствора (из набора) 200 мкг агарозного геля, содержащего определенный фрагмент ДНК, например – митохондриальный ген цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1). Смесь лизирующего раствора и агарозного геля инкубируют в водяной бане при температуре плюс 55 °С до полного растворения геля. Полученный раствор переносят в фильтрующую колонку, вставленную в собирательную колонку (из набора Eurogen, Новосибирск, РФ), и инкубируют при комнатной температуре в течение 120 сек. После этого раствор центрифугируют 60 сек при скорости вращения 5000 об/мин и сливают содержимое собирательной колонки. После центрифугирования в фильтрующей колонке остается смесь фрагмента ДНК с посторонними веществами. Смесь (остаток) промывают буферным раствором, например – известным Wash buffer.

- для промывания смеси фильтрующую колонку вставляют обратно в собирательную колонку, затем в фильтрующую колонку добавляют 50 мкл промывочного раствора и центрифугируют, например – в течение 60 сек при 8000 об/мин. Процедуру промывки повторяют не менее двух раз, до получения чистой ДНК. После промывания чистая ДНК остается на мембране фильтрующей колонки. Использованную собирательную колонку заменяют на чистую пробирку емкостью 1,5 мл. Фильтрующую колонку с чистой ДНК вставляют в чистую пробирку. Затем ДНК элюируют добавлением 30 мкл буферного раствора (из набора) для элюции в фильтрующую колонку и буферным раствором смывают ДНК в пробирку. После выполнения всех вышеописанных процедур в пробирке получают раствор, содержащий определенный фрагмент ДНК отдельного организма, например – митохондриальный ген цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1).

- Далее с помощью операции секвенирования определяют нуклеотидную последовательность (порядок расположения нуклеотидов) фрагмента ДНК. Операцию проводят, например, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей воду, ДНК, 5-кратный буферный раствор ТМS, 2,5-кратный Ready Reaction Premix и 3.3мМ праймеры. Операцию секвенирования осуществляют, например, 35-кратным повторением. Результат расшифровывают, например – с помощью автоматического генетического анализатора ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) согласно инструкциям производителя [Watts D. Automated fluorescent DNA sequencing on the ABI PRISM 310 Genetic Analyzer / D. Watts, J.R. MacBeath // Methods Mol Biol. 2001. – Р. 167, 153–170] [23]. Получают сиквенсные хроматограммы.

- Результаты секвенирования обрабатывают, например – программным пакетом Lasergene 5.03 (DNA STAR, Inc., США) и программным пакетом SeqMan для анализа сиквенсных хроматограмм, получают нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК отдельного организма, например – митохондриального гена цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1).

- Затем проводят конвертацию (трансляцию) полученной нуклеотидной последовательности, например – гена СО1 организма, в аминокислотную последовательность белка, например – белка СО1 организма, с использованием стандартного генетического кода специализированной компьютерной программы, например – ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf).

Действие 4. Пополнение международных баз данных экспериментально-полученными первичными последовательностями генов и белков:

- Вводят экспериментально полученную последовательность гена и продукта гена – белка в международные базы данных, например - TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для каждого индикаторного организма и используют для целей заявленного способа.

Далее проводят такие же действия (Действия 1-5), как в Примерах 1-3 по оценке экологического состояния окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса (СИВ) организмов в пробе.

Используя приведенную в Примере 4 Инструкцию производителя, возможно получать последовательности любых маркерных генов и белков любых организмов.

На Примере 4 заявителем показана возможность использования заявленного технического решения даже в случае, когда аминокислотные последовательности маркерных белков индикаторных видов организмов отсутствуют в международных базах данных, используемых для оценки экологического состояния окружающей среды, путем их (аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных видов организмов) экспериментального с целью дальнейшего пополнения международных баз данных.

Пример 5. Проведение сопоставления результатов заявленного технического решения с результатами экспертной оценки экологического состояния водоема – озера Малое Глубокое Республики Татарстан и окружающей озеро природной среды.

Для подтверждения достоверности результатов, полученных по заявленному техническому решению, заявителем проведено сопоставление результатов по заявленному техническому решению с результатами оценки состояния озера Малое Глубокое по материалам [Экология города Казани. – Казань: Изд-во АН РТ, 2005. – 527с.] [9, Табл. 19, С.126] [24], в которых (материалах) эксперты оценивают состояние озера Малое Глубокое, как благополучное (умеренно-загрязненное).

Для этого заявителем выполнена оценка экологического состояния озера Малое Глубокое, расположенного на территории г. Казани Республики Татарстан и окружающей озеро природной среды, по заявленному способу с использованием маркерных белков по сапробным группам на примере индикаторных видов зоопланктонных организмов.

Последовательность действий:

Действие 1. Отбирают пробу зоопланктонных организмов из находящегося в оцениваемой окружающей среде озера Малое Глубокое.

Действие 2-3. Действуя вышеописанным путем (Пример 1), определяют сапробные группы индикаторных видов зоопланктонных организмов с использованием маркерных белков СО1, например, определяют уникальный участок TTV для о-сапробной группы, включающей индикаторные виды Chydorus sphaericus ACJ01614 и Mesocyclops leuckarti ADQ90208; TTI для b-мезосапробной группы, включающей индикаторные виды Keratella cochlearis AMZ04798, Bosmina longirostris AVP51787, Simocephalus vetulus AHL83628, рассчитывают частотное содержание каждой сапробной группы индикаторных видов зоопланктонных организмов в пробе и суммарный индикаторный вес (СИВ), см. Таблицу 4 на Фиг.4.

Действие 4. Рассчитывают суммарный индикаторный вес СИВ по белку СО1 сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов в пробе СИВ = 1,14 (озеро Малое Глубокое) (Таблица 4 на Фиг.4).

Действие 5. Оценивают экологическое состояние водоема на этой местности – озера Малое Глубокое по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов в пробе.

Суммарный индикаторный вес сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов в пробе СИВ = 1,14 (Таблица 4 на Фиг.4) (в диапазоне 0,5 < СИВ< 1,5) соответствует o-сапробности водоема. В соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [11], по индексу загрязненности 1,14 водоем соответствует o-сапробной зоне, т.е. водоем находится в состоянии вполне чистом.

По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют (оценивают) чистой и благополучной, в настоящее время не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий.

Таким образом, из Примера 5 видно, что результаты оценки состояние озера Малое Глубокое, полученные по заявленному способу, полностью совпадают с экспертной оценкой по [9], где состояние озера Малое Глубокое также оценивается, как благополучное, что, по мнению заявителя, подтверждает их (результатов заявленного способа) достоверность.

Из данных, приведенных в Примере 5 видно, что две сапробные группы (o-, b-) состоят суммарно из 5 видов зоопланктонных индикаторных организмов, а именно:

- о-сапробная группа состоит из 2-х видов индикаторных зоопланктонных организмов,

- b-мезосапробная группа – из 3-х видов.

К каждой из двух сапробных групп получают антитела, т.е. по заявленному техническому решению получают 2 антитела.

При сравнении с прототипом, в котором к 5 видам индикаторных зоопланктонных организмов необходимо получение 5 антител, можно сделать доказательный вывод о том, что в результате использования заявленного технического решения для оценки экологического состояния окружающей среды представляется возможным сэкономить материальные, трудовые и временные затраты не менее, чем в 2,5 раза (5 антител получают по прототипу против 2 у заявленного). При этом в заявленном техническом решении отсутствует весьма значимый у прототипа признак - идентификация видового состава организмов. То есть сокращение количества признаков в заявленном техническом решении привело к реализации всех поставленных задач и заявленных технических результатов, что привело к существенному снижению совокупных затрат при использовании по назначению – не менее, чем в 2,5 раза.

Из описанных в Примерах 1-5 результатов можно сделать следующие общие выводы.

Заявителем, по сравнению с прототипом, достигнуты поставленные цели и заявленные технические результаты:

- разработан способ для оценки экологического состояния окружающей среды с использованием маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов, в котором (способе) вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов. По заявленному способу проведена оценка экологического состояния среды, окружающей водоем (см. Примеры 1 – 5);.

- снижена трудоёмкость работ, сокращены сроки оценки экологического состояния окружающей среды – см. выводы в Примерах 1, 2, 3, 5. По результатам, изложенным в Примерах, можно сделать доказательный вывод о том, что в результате использования заявленного технического решения для оценки экологического состояния окружающей среды представляется возможным сэкономить материальные, трудовые и временные затраты при использовании по назначению - в зависимости от количества видов индикаторных организмов в сапробной группе – чем больше видов индикаторных организмов в группе, тем больше эффект от снижения затрат. Так, затраты на определение сапробной группы индикаторных организмов по заявленному техническому решению, в которой (сапробной группе) находится, например, от 2-х до 10-ти (и более) видов, ниже, чем затраты по прототипу, в 2-10 (и более) раз.

- повышена точность и достоверность результатов экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер посредством того, что вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов, что дало превышающий суммарный технический эффект (см. Примеры 1-5), так как уменьшение объёма работ сопровождается снижением вероятности случайных ошибок, которые сказываются на точности и достоверности результатов оценки экологического состояния исследуемой окружающей среды.

Таким образом, сокращение количества признаков в заявленном техническом решении по сравнению с прототипом не только привело к реализации всех поставленных задач и заявленных технических результатов, но и к существенному снижению совокупных затрат (см. Примеры 1-5).

В дополнение к изложенным выше выводам следует подчеркнуть, что полученные заявителем антитела накапливают в хранилище и создают базу данных антител к маркерным белкам каждой сапробной группы индикаторных организмов. Базу данных используют для оценки экологической ситуации, причем – без повторного получения антител. Занесенные в банк данных антитела к маркерным белкам сапробных групп индикаторных организмов доступны для применения всем пользователям, в том числе – оценивающим экологическую обстановку экспертам. Эта информация воспринимается, интерпретируется и используется одинаково (однозначно) различными специалистами, вне зависимости от их местонахождения и субъективного влияния эксперта – специалиста. Использование инструментально полученной, единой для всех экспертов международной базы данных антител к маркерным белкам по сапробным группам индикаторных организмов делает оценку экологического состояния окружающей среды независимой от субъективности оценок того или иного эксперта, то есть результат оценки всегда носит объективный, достоверный характер, чем выгодно отличается от носящих субъективный характер оценок с использованием прототипа. Указанное подтверждает достижение заявителей поставленных целей и заявленного технического результата.

Исходя из сказанного, по мнению заявителя, способ оценки экологического состояния среды с использованием маркерных белков – универсален, не зависит от географического местонахождения объекта, обладает надежностью на уровне высших достижений молекулярной генетики и биоинформатики, а результаты применения способа – более достоверны по сравнению с изобретениями, известными из уровня техники на дату подачи заявки.

Таким образом представляется возможным сделать вывод о том, что в заявленном техническом решении достигнуто разрешение противоречия в плане того, что при необходимости повысить качество результатов в случаях обычного проектирования прибегают к повышению либо количества действий, либо затрат, что усложняет технологию. В заявленном же техническом решении заявителю удалось повысить качество результатов при одновременном снижении количества действий и вытекающих из этого затрат. Это подтверждает изобретательский уровень заявленного технического решения, так как не является очевидным для специалиста в данной области техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, т.к. так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, представленным в независимом пункте формулы изобретения, включая характеристику назначения, при достижении более высоких, по сравнению с прототипом, технических результатов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат. При этом заявленное техническое решение обеспечило разрешение противоречий, неразрешимых до даты подачи заявочных материалов - определение сапробных групп индикаторных организмов, затрачивая при этом такое же количество материальных средств, сколько требуется на идентификацию одного вида организма по прототипу. При этом повышается доступность заявленного технического решения, так как его применение по назначению обеспечивает возможность снижения затрат при одновременном снижении технологичности.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. может быть реализовано в промышленных масштабах для природоохранной, сельскохозяйственной, рекреационной деятельности (организации отдыха), деятельности организаций здравоохранения, причем - посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.

Использованные источники

1. http://бмэ.орг/index.php/Антигены.

2. https://ru.wikipedia.org/wiki/Биоиндикация.

3. https://ru.wikipedia.org/wiki/Сапробность.

4. Межгосударственный стандарт ГОСТ 17.1.2.04-77"Охрана природы. Гидросфера. Показатели состояния и правила таксации рыбохозяйственных водных объектов" (введен в действие постановлением Госстандарта СССР от 27 июня 1977 г. N 1609).

5. https://ru.wikipedia.org/wiki/Биота.

6. http://www.33cats.ru/guide/item/210-hydrobionty.html Гидробионты.

7. https://ru.wikipedia.org/wiki/ Организм.

8. http://wikiredia.ru/wiki/Зоопланктон.

9. http://wikiredia.ru/wiki/Зообентос.

10. http://wikiredia.ru/wiki/Фитопланктон.

11. https://studbooks.net/842069/ekologiya/metody_otsenki_ekologicheskogo_sostoyaniya_okruzhayuschey_sredy Методы оценки экологического состояния окружающей среды.

12. Sladechek V. System of water quality from the biological point of view. Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol, 1973. – Р.179-191.

13. Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий/ под ред. С.Я. Цалолихина. – СПб.: Изд. «Наука», 1994. – 394 с.

14. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс. http://www.polismed.com/articles-immunofermentnyjj-analiz-ifa-elisa-sut-princip-metoda-i-ehtapy-issledovanija.html.

15. Патент на изобретение WO9946401.

16. Патент на изобретение RU 2661739.

17. Жукинский В.Н., Оксиюк О.П., Олейник Г.Н., Кошелева С.И. Принципы и опыт построения экологической классификации качества поверхностных вод суши // Гидробиол. журн. – 1981. –17, № 2. – С. 38-49.

18. Винберг Г.Г. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева // Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1982. – 33 с.

19. Van Weemen B.K., Schuurs A.H. (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 (3): 232–236. doi:10.1016/0014-5793(71)80319-8. PMID 11945853.

20. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зообентос и его продукция. / Ред. Г.Г.Винберг, Г.М.Лаврентьева. – Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР. – 51 с.

21. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Фитопланктон и его продукция. – Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1984. – 32 с. (Ред. Г.Г.Винберг, Г.М.Лаврентьева).

22. Folmer O. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates / O.Folmer, M.Black, W.Hoeh, R.Lutz, R.Vrijenhoek // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. – 1994. – V.3. – P.294–299.

23. Watts D. Automated fluorescent DNA sequencing on the ABI PRISM 310 Genetic Analyzer / D. Watts, J.R. MacBeath // Methods Mol Biol. 2001. – Р. 167, 153–170.

24. Экология города Казани. – Казань: Изд-во АН РТ, 2005. – 527с.