Способ определения предрасположенности к развитию ожирения у детей в условиях избыточной контаминации алюминием

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, эндокринологии, и может быть использовано для ранней диагностики и прогнозирования токсического действия алюминия на проявление ожирения и избыточной массы тела у детей. Изобретение предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия алюминия, поступающего из окружающей среды, на здоровье ребенка, проживающего на территориях с повышенным содержанием этого токсиканта в атмосферном воздухе и в питьевой воде.

Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ профилактики, а кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, алюминия, обуславливающего формирование ожирения (метаболического синдрома) у детей.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что повышенный уровень алюминия в окружающей среде может явиться причиной патологии эндокринной системы.

В связи с широким использованием химических технологий в различных производственных циклах и сферах человеческой деятельности пристальное внимание ученых и медиков привлекает проблема выявления пороговых критериев, позволяющих на ранних этапах оценить, что воздействие вредного химического вещества превышает компенсаторные возможности организма и наносит вред здоровью человека, особенно детям, в связи с несформировавшимися в полной мере компенсаторными возможностями. Актуальность исследования неблагоприятного воздействия алюминия особенно обусловлена на территориях, вблизи которых размещены предприятия цветной металлургии.

Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье, ранней диагностики нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики, актуальным является выделение маркерных показателей конкретных заболеваний или их предвестников у человека под воздействием алюминия, которые могут быть использованы в качестве индикаторов нарушения эндокринной системы и в качестве дополнительных диагностических критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.

По результатам эпидемиологических исследований, в Российской Федерации распространенность избыточной массы тела у детей в разных регионах России колеблется от 5,5 до 11,8%, а ожирением страдают около 5,5% детей, проживающих в сельской местности, и 8,5% детей - в городской. Ожирение и избыток массы тела (согласно Международной классификации болезней МКБ-10: Е66.0-Е67.8) в последние годы впервые вышли на первое место и составили (48,1% случаев в структуре эндокринной заболеваемости). У детей, проживающих в условиях повышенного содержания алюминия, установлена достоверная причинно-следственная связь вероятности развития заболеваний эндокринной системы и избыточного питания с повышенным содержанием алюминия в моче (доля дисперсии зависимой переменной R²=0,47-0,7; 261,5≤F≥672,4; достоверность р=0,001).

Ожирение - избыточное отложение жира в организме, может быть либо самостоятельным многофакторным заболеванием, либо синдромом, сопровождающим другие заболевания.

Согласно рекомендациям экспертов по питанию, в качестве высокоинформативного показателя избыточной массы тела и ожирения используется индекс массы тела (далее - ИМТ) или индекс Кетле, определяемый как отношение массы тела (в кг) к росту (в метрах), возведенному в квадрат. Применительно ко взрослым об ожирении говорится, когда индекс массы их тела больше или равен 30 кг/м² (Проблема ожирения в Европейском регионе ВОЗ и стратегии ее решения / Под ред. F. Branca, H. Nikogosian, T. Lobsteim. - Европейское региональное бюро ВОЗ, 2007 - С. 1-7). ИМТ для взрослых и для детей рассчитывается немного по-разному. Дополнительными параметрами при расчете индекса для детей становятся возраст и пол ребенка. Нормальный ИМТ у детей меньше, чем у взрослых - от 15 до 18,5, в зависимости от возраста. Это связано с тем, что у детей и у взрослых разные пропорции тела и, соответственно, соотношения роста и веса.

Из уровня техники известны различные прогностические подходы к установлению возможного ожирения и избыточной массы тела. Часть из них основана на использовании в качестве диагностических маркеров показателей крови и реже генетические критерии.

Например, известен способ прогнозирования прогрессирования абдоминального ожирения у больных метаболическим синдромом, при котором в крови определяется уровень С-пептида (Патент РФ №2297002). При его значении более 3,5 нг/мл прогнозируют прогрессирование абдоминального ожирения. Однако данный известный способ учитывает риск прогрессирования ожирения только в случаях метаболического синдрома и не рассматривает таковую вероятность задолго до метаболических нарушений, что снижает его прогностическую ценность и возможность использования в доклинический период.

Также известен способ дифференциальной диагностики экзогенно-конституциональной и гипоталамической форм первичного ожирения у женщин (Патент РФ №1442189), согласно которому исследуют динамику секреции пролактина на введение нейропептида - люлиберина, путем определения в пробе венозной крови исходного уровня гормона и последующего введения внутривенно люлиберина в дозе 100 мкг однократно. Затем исследуют кровь на пролактин на 30, 60, 90 и 120-й минуте после введения препарата. И при повышении уровня секреции по сравнению с исходным делают вывод об экзогенно-конституциональной форме ожирения, а при стабильном уровне в сравнении с исходным определяют гипоталамическую форму первичного ожирения. Способ направлен на постановку правильного диагноза в спорных случаях.

Недостатками указанного способа является то, что данная методика лишь уточняет клинический диагноз, не определяя вероятность развития нарушений углеводного и жирового обменов ассоциированных с воздействием негативных факторов среды обитания.

В уровне техники описан способ оценки показания для медикаментозной терапии ожирения в сочетании с инсулинорезистентностью у детей (Патент РФ №2279080). Сущность способа: в эритроцитах капиллярной крови у детей с ожирением и подтвержденной инсулинорезистентностью определяют соотношение водных фракций - коэффициент гидратации и при его значении равном или выше 5,36 состояние расценивают как требующее медикаментозной терапии метформином. Применение способа, при простоте выполнения, позволяет осуществлять индивидуальный подход к назначению метформина у детей с ожирением и сформировавшейся инсулинорезистентностью.

Его недостатками является то, что данный способ применим лишь для коррекции лечения, а не для определения индивидуальной чувствительности и всего комплекса медико-профилактических мероприятий (формирование контингентов риска, подбор индивидуальной диеты и физической нагрузки, медикаментозной коррекции и другое).

Из Патента РФ №2452966 известен способ прогнозирования риска развития ожирения у практически здоровых людей, согласно которому в крови людей определяют концентрацию α-фетопротеина (АФП) и содержание Т-лимфоцитов с рецептором к трансферрину (CD71+). На основании полученных данных рассчитывают прогностический индекс (ПИ) как результат отношения концентрации АФП в МЕ/л к абсолютному содержанию лимфоцитов CD71+ в кл/л (ПИ=АФПЛ1Ю71). При величине ПИ, равной 8,1 и более, прогнозируется риск развития ожирения. Заявленный способ можно применять для выявления риска развития ожирения у лиц, ведущих малоподвижный образ жизни, а также при назначении глюкокортикоидов и иммунодепрессивной терапии, при наследуемой патологии с метаболическим дефектом. Его недостатком является то, что данный способ не учитывает вероятность формирования ожирения у детей в условиях воздействия негативных факторов среды обитания.

Из патента РФ №2677274 известен способ прогнозирования индивидуального риска развития ожирения на различные по продолжительности периоды жизни у человека, проживающего в условиях загрязнения среды обитания ароматическими углеводородами и металлами. Способ заключается в том, что в биосредах человека определяют содержание химических элементов, представляющих опасность для развития ожирения; проводят анкетирование; проводят расчет начального значения вероятности p(t_o) возникновения ожирения у человека на текущий возраст человека t_o на момент обследования; для каждого количественного диагностического показателя, кроме ЛПВП и качественного показателя, находят функцию Ф_i его отклонения от физиологической нормы; каждому указанному диагностическому показателю придают следующий весовой коэффициент φ_I; вычисляют начальное значение вероятности p(t₀) возникновения ожирения на текущий возраст человека; с использованием итерационной процедуры производят прогнозирование индивидуального риска развития ожирения у человека с временным шагом 1 день; у обследуемого человека определяют на текущий возраст уровень в крови и в моче прогностических показателей; сравнивают их уровень с физиологической нормой; для прогностического показателя задают вероятность превышения или вероятность снижения его относительно физиологической нормы; устанавливают для прогностического показателя общую вероятность превышения над нормой, либо общую вероятность снижения относительно нормы в возрасте человека t; производят расчет общей вероятности развития у человека ожирения и по величине индивидуального риска прогнозируют риск развития ожирения у человека.

Однако, указанный способ является очень сложным в реализации. А кроме того, он не применим в отношении детей.

Известен способ оценки риска развития метаболического синдрома (МС) у детей на основе генетических и биохимических маркеров (Патент РФ №2492485). Согласно этому способу, после исследования биохимических показателей HOMA-IR проводят исследование коэффициента атерогенности (КА). По коэффициенту 3хКА+HOMA-IR делают вывод о развитии метаболического синдрома (МС) и выявлении группы риска развития заболевания среди детей. Диапазон значений коэффициента до 10 соответствует здоровым детям; от 10 до 14,5 - дети с отдельными метаболическими нарушениями и ожирением; выше 14,5 - диагностируют МС. В группе детей со значениями, посчитанными по формуле больше 10, но меньше 14,5, дополнительно определяют риск МС с помощью метода ПЦР участков гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) с дальнейшей обработкой эндонуклеазами рестрикции и при выявлении генотипа С/Т полиморфного варианта 677С/Т гена MTHFR таких детей относят к группе риска по развитию МС. Изобретение позволяет начать терапевтические и профилактические мероприятия на самых ранних сроках развития данного заболевания.

Недостатком указанного способа является то, что в основе диагностического блока данного методического подхода к идентификации метаболического синдрома лежит определение индекса HOMA-IR и коэффициента атерогенности (КА), которые характеризуют уже наличие (факт) биохимических изменений углеводного и жирового обменов, то есть отнести данные нарушения к ранним нельзя - показатели энергетического обмена авторами не учитываются, а определение полиморфности гена MTHFR будет характеризовать только предрасположенность к гипергомоцистеинемии и фолиевой анемии, т.е. к состояниям, не имеющим прямого отношения к ожирению (в перечень ассоциаций с заболеваниями полиморфных вариантов 677С/Т гена MTHFR ожирение и метаболический синдром не входят).

Известен способ оценки риска метаболического синдрома, основанный на выявлении генотипа 4G/4G (вариант - 675 4G/5G) по гену РА1. Он нацелен на формирование группы риска, но не позволяет проводить дифференциальную диагностику (Berberoglu) М. et al. Plasminogen activator inhibitor (PAI-1) gene polymorphism (-675 4G/5G) associated with obesity and vascular risk in children. J/ Pediatr. Endocrinol Metab. 2006 May; 19(5):741-8).

Известен способ оценки индивидуального риска формирования избыточной массы тела и ожирения у детей, потребляющих питьевую воду с повышенным содержанием хлороформа и тетрахлорметана (Патент РФ №2619872). Осуществляют отбор пробы мочи, производят определение в ней концентрации хлороформа и тетрахлорметана, определение уровней общего холестерина и липопротеида низкой плотности (ЛПНП). Проводят анамнестическое обследование ребенка по трехбалльной шкале и генотипирование. Риск формирования у ребенка избыточной массы тела прогнозируют в случае повышения уровня общего холестерина выше 3,9 ммоль/л и уровня ЛПНП выше 1,8 ммоль/л, наличия у ребенка 6 и более баллов при анамнестическом обследовании, наличия гетерозиготного генотипа гена HTR2A (rs7997012), повышения концентрации тетрахлорметана в моче выше референтной и концентрации хлороформа в пределах 5,17-5,59 мкг/л. Риск формирования ожирения прогнозируют при концентрации хлороформа равной или более 5,79 мкг/л. Изобретение обеспечивает эффективный способ оценки индивидуального риска формирования избыточной массы тела и ожирения у детей, однако он не предназначен для обследования эндокринных нарушений у детей, проживающих в условиях повышенного содержания алюминия в среде обитания.

Также известен способ для выявления генетической предрасположенности к ожирению путем установления наличия гена FTO (fat mass and obesity associated), кодирующего белок FTO, вовлеченный в энергетический обмен и влияющий на метаболизм в целом (информация с сайта интернета: https://helix.ru/kb/item/18-051). Экспрессия гена происходит в основном в клетках гипоталамуса и регулируется посредством процессов, ответственных за чувства насыщения и голода. В европейской популяции встречается два аллельных варианта гена FTO по генетическому маркеру G(45+52261)A (rs1861868), который ассоциирован с повышенной массой тела и ожирением. В регуляторной области гена находится полиморфный участок, в котором происходит замена гуанина (G) на аденин (А). Если в данной позиции находится гуанин (G), такой вариант гена обозначается как G-аллель, а если аденин (А) - А-аллель. Исследования показывают, что у носителей аллеля А наблюдается повышение массы тела и окружности талии, по сравнению с носителями G-аллелей. Риск развития ожирения у людей с генотипом А/А достоверно выше, чем у людей с генотипом G/G и G/A.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы определения предрасположенности к развитию ожирения у детей именно в условиях избыточной контаминации алюминием, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности оценки влияния алюминия на предрасположенность проявлений эндокринных нарушений в виде ожирения, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии таких состояний у детей уже на ранних стадиях их формирования.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом определения предрасположенности к развитию ожирения у детей в условиях избыточной контаминации алюминием, характеризующийся тем, что производят отбор проб крови и мочи у ребенка, определяют в пробе мочи содержание алюминия, а в сыворотке крови - уровень иммуноглобулина G (IgG) к алюминию, также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма генов MTNR1B и SIRT1, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена MTNR1B (rs 10830963) и гена SIRT1 (rs 7069102), устанавливая при этом для каждого из указанных генов: гетерозиготное CG, нормальное гомозиготное СС, вариантное гомозиготное GG для гена MTNR1B (rs 10830963); гетерозиготное CG, нормальное гомозиготное СС, вариантное гомозиготное GG для гена SIRT1 (rs 7069102), и при одновременном обнаружения у ребенка следующих диагностических критериев: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена MTNR1B (rs 10830963) и гена SIRT1 (rs 7069102), при условии одновременного превышения концентрации алюминия в моче более чем в 2 раза по сравнению с референтным уровнем содержания алюминия в моче, равным 0,01 мг/дм³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к алюминию, делают вывод о наличии у ребенка предрасположенности к развитию ожирения в условиях избыточной контаминации алюминием.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего: идентификация генетических нарушений в виде полиморфных вариантов кандидатных генов (гена сиртуина - SIRT1 rs7069102; гена мелатонинового рецептора В1 - MTNR1B rs10830963), формирующих энергетический дисбаланс и циркадную аритмию (потребность в приеме пищи в неурочное - вечернее и ночное время), приводящие к абдоминальному ожирению, с одновременной идентификацией запускающего (реализующего) конституциональные (генетические) изменения фактора - алюминия, действие которого подтверждается наличием специфических антител (IgG к алюминию).

Роль избытка алюминия в организме проявляется во влиянии на обмен веществ, особенно, минеральный (в частности, вызывает нарушения фосфорно-кальциевого обмена и снижает абсорбцию железа); на функции нервной системы (снижение или потеря памяти, судороги и т.д.); в способности действовать непосредственно на клетки - их размножение и рост; длительное вдыхание соединений алюминия ведет к фиброзированию легочной ткани. Высокая способность алюминия образовывать комплексные соединения обусловливает его роль в снижении активности многих ферментов и их систем. Установлено, что алюминий аккумулируется в плазме и тканях и оказывает отравляющее действие на больных с хронической почечной недостаточностью. Имеются данные о мутагенной активности алюминия.

Важную роль в патогенезе интоксикации алюминием играют конкурентные отношения его с фосфором, кальцием и железом. Техногенные и аномальные геохимические локусы избыточного присутствия алюминия в почве и питьевой воде часто встречаются при низкой концентрации кальция и магния в этих средах. Подвижность ионов алюминия резко возрастает при увеличении кислотности (рН) природных сред, в результате, например, воздействия "кислотных дождей". К основным источникам поступления алюминия в среду и, затем, в организм человека являются выбросы в районах расположения алюминиевых заводов и сточные воды горнорудного производства, лакокрасочных, бумажных, текстильных и ряда других производств.

В качестве диагностического критерия возникновения нарушений эндокринных функций (ожирение) у детей в условиях избыточной контаминации алюминием рекомендуется использовать измененный генотип гена сиртуина (SIRT1 rs7069102), отвечающего за экспрессию эволюционно консервативных НАД-зависимых белков, обладающих деацетилазной или АДФ-рибозилтрансферазной активностью, и вовлеченных в регуляцию важных клеточных процессов и метаболических путей, когда, в случае мутации, создаются условия для формирования энергетических нарушений, способствующих накоплению жировой ткани (адипоцитов). Условия подверженности воздействию аэрозолей, содержащих алюминий, способствует замене фосфора в молекулах циклического аденозинмонофосфата (далее - цАМФ) и систем никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАД-Ф) и аденозинтрифосфата (АТФ), присутствующих в клетках живого организма.

А также предлагается использовать одновременно в качестве диагностического критерия измененный генотип гена мелатонинового рецептора B1 (MTNR1B rs10830963), отвечающего за циркадные биоритмы режима дня и употребления пищи, совокупные проявления полиморфизма которых способствуют формированию нарушений энергетического баланса и феномену абдоминального ожирения.

Также показателем, характеризующим сам феномен нарушения энергетического обмена, является цАМФ, которая осуществляет функции вторичного внутриклеточного посредника в действии первичных посредников (веществ, имеющих короткий период биодеградации) - например, ряда гормонов, нейромедиаторов (мелатонин), сиртуина. цАМФ опосредует биологическую функцию биологически активных медиаторов путем активации (инактивации) клеточных протеинкиназ (фосфатаз). Протеинкиназы, в свою очередь, фосфорилируют эффекторные белки и изменяют (увеличивают или уменьшают) их активность.

Модулирующие данные процессы ионы алюминия в данном изобретении будут характеризовать два критерия - содержание алюминия в моче и ответ на его контаминацию - уровень содержания IgG в сыворотке крови к алюминию.

Подтверждающим фактором нарушения энергетического обмена и формирования ожирения будет служить угнетение цАМФ и нарастание уровня специфического ответа на алюминий по критерию содержания IgG к алюминию.

Реализующим или запускающим процесс нарушения фосфорного обмена служит экспозиция алюминия, превышающая референтную концентрацию (в качестве референтного значения содержания алюминия в моче был принят показатель, равный 0,01 мг/дм³ (верхняя граница референтных пределов 6,5±3,5 мкг/л по Н.Тиц, 2003, с. 21).

Таким образом, для установления ранних проявлений и формирования специфического нарушения энергетического обмена в виде ожирения, ассоциированного с повышенным содержанием алюминия в моче, рекомендуется использование методического подхода, основанного на определении генотипов кандидатных генов и в случае гетерозиготы и/или вариантной гомозиготы участков генов MTNR1B (rs10830963) и SIRT1 (rs7069102), отклонении от физиологической нормы содержания IgG специфического к алюминию в виде его гиперпродукции, избыточном содержании алюминия в моче, превышающем референтный уровень не менее чем в 2 раза, регистрируют наличие формируемого нарушения энергетического обмена, выражающегося ожирением, связанного с экспозицией алюминием. Это доказывается снижением экспрессии цАМФ, т.к. циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), производное основного источника энергии в организме - АТФ, является посредником, передающим эффект стимуляции внеклеточных рецепторов к внутренним структурам клетки, зависит от полиморфизма сиртуина, который снижает активность глюкозочувствительного цАМФ, а также от уровня контаминации Аl, когда реализуются его конкурентные отношения с фосфором, что способствует замене фосфора в молекулах ц-АМФ и инактивация клеточных протеинкиназ.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб крови и мочи, а также стандартных методик изучения генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта - алюминия, именно в моче обусловлено тем, что моча является средой, имеющей реферируемые (фоновые) уровни в отношении техногенных химических веществ, а также стандартной средой используемой для протоколов интоксикаций, вызванных металлами.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПНР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов MTNR1B и SIRT1. При этом предлагается использовать в качестве праймера участок ДНК гена MTNR1B (rs10830963) и гена SIRT1 (ts7069102), устанавливая при этом для каждого гена одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное.

У гена MTNR1B (rs10830963) и у гена SIRT1 (rs7069102): СС - нормальный гомозиготный генотип; CG - гетерозиготный генотип; GG - вариантный гомозиготный генотип.

Благодаря тому, что в заявляемом способе в качестве диагностических критериев предлагается использовать одновременно именно полиморфизм гена MTNR1B (rs10830963) и гена SIRT1 (rs7069102), обеспечивается точность диагностики, т.к. ген сиртуин SIRT1 относится к семейству энергозависимых и энергоопосредующих белков (НАД и АДФ), нарушения экспрессии которого приводят к возникновению связки - нарушение гликолиза - сахарный диабет-ожирение. Ген мелатонин MTNR1B - рецептор гипоталамуса, осуществляет центральную регуляцию циркадных биоритмов (полиморфные изменения генов и нарушенная экспрессия рецептора ведет к непреодолимости желания принимать пищу в неурочное время (вечером, ночью), что в совокупности с измененной экспрессией сиртуина снижают процессы экспрессии цАМФ, АТФ, АДФ и т.д. и ведут к накоплению и избыточности адипоцитарных элементов, чему способствует и активность ионов алюминия, которых наблюдается в моче с избытком. Поэтому по данным показателям можно судить о генетически детерминированном характере эндокринных нарушений в виде ожирения и разрабатывать индивидуальные программы определения предрасположенности к ожирению и коррекции.

Причем из уровня техники неизвестны методы выявления предрасположенности к развитию ожирения у детей в условиях избыточной контаминации алюминием с использованием одновременно именно полиморфизмов этих генов.

Уровень IgG к алюминию характеризует сам феномен специфической сенсибилизации.

Таким образом, при оценке влияния алюминия на предрасположенность к ожирению у ребенка в предлагаемом способе рекомендуется использовать следующие критерии:

- одновременное наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена MTNR1B (rs10830963) и наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена гена SIRT1 (rs7069102);

- превышение концентрации алюминия в моче выше референтного уровня более чем в 2 раза,

- и превышение по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к алюминию,

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами указанных генов, ассоциированных с генетическим дефектом эндокринной системы и врожденной чувствительностью к внешним факторам (например, алюминий), одновременно с количеством химического токсиканта - алюминия в моче, и превышением уровня IgG к алюминию по сравнению с физиологической нормой, будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния алюминия на потенциальное развитие ожирения у ребенка.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории одного из промышленных городов Российской Федерации, характеризующейся наличием в атмосферном воздухе повышенных концентраций алюминия (до 2 ПДКм.р.)

2. На указанной территории проводят отбор группы детей одной этнической популяции. Затем проводят отбор пробы мочи у обследуемого ребенка - для определения содержания алюминия. Содержание алюминия в моче определяют по Методике «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500сх с октопольной реакционной ячейкой (USA). Устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе мочи над его референтным уровнем (в примере конкретного осуществления на территории референтным значением по алюминию был показатель равный 0,01 мг/дм³).

3. Затем определяют в пробе крови содержание IgG к алюминию по методике: Зайцева Н.В., Беляев Е.Н., Долгих О.В. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям / Методические рекомендации. - М., 2002. - С. 29. А также определяют в пробе крови содержание цАМФ по методике иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора Assay Designs Correlate-EIA cyclic AMP (Биохиммак, Москва).

4. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт : ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена MTNR1B (rs10830963) и гена SIRT1 (rs7069102).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного ребенка готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов MTNR1B (rs10830963) и SIRT1 (rs7069102) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма MTNRJB (rs10830963) и SIRT1 (rs7069102) ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена MTNR1B в исследуемом участке ДНК rs10830963, а также гена SIRT1 в исследуемом участке ДНК rs7069102 (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние гена MTNR1B (rs10830963) и гена SIRT1 (rs7069102).

5. И при выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена MTNR1B (rs10830963) и гена SIRT1 (rs7069102), превышение концентрации алюминия в моче выше референтного уровня более, чем в 2 раза, а также превышение по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG в сыворотке крови к алюминию, делают вывод о предрасположенности ребенка к развитию у него ожирения в условиях избыточной контаминации алюминием.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено обследование детского населения, проживающего в различных по содержанию алюминия условиях среды обитания.

Были сформированы две группы: группа наблюдения, дети которой проживали на неблагополучной в отношении алюминия территории, и группа сравнения, проживающая в условиях санитарно-гигиенического благополучия. В группу наблюдения вошли 33 ребенка (средний возраст 6,2±0,6 года; 51% мальчиков и 49% девочек). В группу сравнения вошел 31 ребенок (средний возраст 6,4±0,3 года; 48% мальчиков и 52% девочек). Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню семьи, качеству и составу питания.

На территориях проживания детей группы наблюдения отмечено превышение содержания алюминия до 2,1 ПДК м.р.

Оценка риска здоровью детей показала, что при хронической экспозиции контаминантов коэффициенты опасности для алюминия составили - до 1,12. Установлено, что хроническое воздействие алюминия формирует опасность развития нарушений со стороны эндокринной системы (индекс опасности HI - до 1,97).

Оценка риска развития заболеваний осуществляется по стандартизованной методике в соответствии с «Руководством по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду» (Р 2.1.10.1920-04).

У всех обследуемых детей была взята проба мочи и проба венозной крови, исследование которых проводилось по вышеуказанной схеме. Также была взята проба буккального эпителия для установления по реакции ПЦР полиморфизма исследуемых генов.

Для доказательства достоверности заявляемых критериев диагностики предрасположенности к ожирению при повышенной контаминации алюминием было установлено в пробе сыворотки крови содержание цАМФ. Этот показатель цАМФ является подтверждающим фактором избыточной нагрузки (контаминации) алюминием с одной стороны (замена фосфора в молекулах ц-АМФ и инактивация клеточных протеинкиназ) и нарушением экспрессии сиртуина, с другой (мутации сиртуина снижают активность глюкозочувствительного цАМФ), так как наблюдаемый дефицит производного аденозинтрифосфата - цАМФ характеризует снижение интенсивности энергетических процессов, обеспечивающих завершенность глюкозо- и холестерин-зависимых реакций, нарушение который приводит к формированию избыточного веса.

Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблице 1.

Результаты приведены в таблице 1 в виде пяти блоков, в каждом из которых показано различное сочетание полиморфизмов указанных генов, содержание алюминия в моче, уровень IgG в сыворотке крови к алюминию и содержание цАМФ в крови.

Данные, приведенные в указанной таблице 1, показывают, что при одновременном сочетании вариантного (гетерозиготное или вариантное гомозиготное состояние генотипа) аллеля гена MTNR1B (rs10830963) и гена SIRT1 (rs7069102), концентрации «виновного» фактора (алюминия) в моче выше референтной концентрации (0,01 мг/дм³) более, чем в 2 раза, и превышении выше физиологической нормы уровня IgG к алюминию (пациенты 1-4), наблюдается снижение по сравнению с физиологической нормой содержания цАМФ. А это значит, что при этом фиксируется реализация алюминием негативной генетической программы у ребенка, выражающейся в нарушении эндокринной системы через проявление ожирения.

Тогда как при допустимом (на уровне референтной концентрации) содержании алюминия в моче, даже в условиях наследования гетерозиготного или вариантного генотипа указанных генов (пациенты 8-11), уровень IgG и содержание цАМФ находятся в пределах физиологической нормы.

И, наоборот, в случае превышения содержания алюминия в моче более, чем 2 раза по сравнению с референтным уровнем, но при отсутствии полиморфных изменений указанных генов (пациенты 12-13), уровень IgG и содержание цАМФ находятся в пределах физиологической нормы.

У пациентов 5-7, которые характеризуются превышением содержания алюминия в моче более чем 2 раза по сравнению с референтным уровнем, превышением по сравнению с нормой уровня IgG к алюминию, но при этом имеют наследование гетерозиготного генотипа только одного из указанных генов, а не одновременно вместе обоих, вывод о предрасположенности к ожирению не диагностирован, при этом содержание цАМФ находится в пределах нормы, что указывает на отсутствие необходимых генетических условий (предрасположенности) для реализации имеющегося воздействия в виде эндокринного нарушения.

Таким образом, это доказывает то, что только одновременное превышение содержания алюминия в моче более, чем в 2 раза, по отношению к референтному уровню, превышение IgG к алюминию выше нормы и только одновременное наличие полиморфных генотипов гена MTNR1B (rs10830963) и гена SIRT1 (rs7069102), характеризуется появлением негативных эффектов в виде отклонения от нормы содержания цАМФ, характеризующего нарушение энергетического обмена, снижение которого приводит к формированию ожирения, и таким образом подтверждается точность и достоверность предлагаемого способа.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы детей с повышенным содержанием алюминия в моче и детей с содержанием алюминия в моче в пределах референтной концентрации.

Пример 1. Пациент, 6 лет, русский, метаболический синдром. Установлен уровень алюминия в моче более чем в 2 раза выше референтного уровня - 0,04 мг/дм³. Установлено наличие гетерозиготного генотипа гена MTNR1B (rs10830963) - CG и вариантного гомозиготного генотипа гена SIRT1 (rs7069102) - GG. Значение содержания IgG к алюминию: 0,205 у.е., т.е. в 2,0 раза выше верхней границы нормы. Содержание цАМФ в крови - маркера интенсивности энергетического обмена, 5,5 пмоль/см³, т.е. ниже диапазона нормы (5,9-10,9 МЕ/мл). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к алюминию и дефицит цАМФ на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза содержания алюминия в моче, а также наличие гетерозиготного полиморфизма гена MTNR1B (rs10830963) - CG и вариантного гомозиготного генотипа гена SIRT1 (rs7069102) - GG, кодирующих белки ответственные за циркадные биоритмы режима дня и употребления пищи и экспрессию эволюционно консервативных белков, обладающих деацетилазной или АДФ-рибозилтрансферазной активностью, что указывает на формирование энергетических нарушений, когда в случае мутации создаются условия, способствующих накоплению жировой ткани, инициированной действием алюминия.

Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного ребенка состояние от воздействия алюминия оценивается, как формирование ранних проявлений метаболического синдрома (ожирения), имеющего генетическую предрасположенность, реализующуюся в условиях избыточной контаминации алюминием.

Для доказательства данного вывода, были установлены следующие показатели метаболизма у данного ребенка, которые имели следующие значения: уровень глюкозы - 6,1 ммоль/дм³ (физиологическая норма 3,3-5,5 ммоль/дм³); уровень ЛПНП - 4,2 ммоль/дм³ (норма 1,5-3,9 ммоль/дм³).

Анализируя представленные данные, можно сделать вывод, что у пациента имеются изменения в углеводном и жировом обменах, в частности, наличие избыточного содержания глюкозы и липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), которое характеризует наличие нарушений их утилизации, то есть сниженного энергетического обмена, что запускает процессы метаболических нарушений, ведущих к формированию ожирения, ассоциированного с контаминацией алюминием.

Пример 2. Пациент, 7 лет, русский. Определяется уровень алюминия в моче более, чем в 2 раза выше референтного уровня - 0,05 мг/дм³. Отсутствуют полиморфные (вариантные) генотипы гена MTNR1B (rs10830963) - СС и гена SIRT1 (rs7069102) - СС. Значение содержания IgG к алюминию: 0,049 у.е. - в диапазоне нормы. Содержание цАМФ в крови - маркера интенсивности энергетического обмена - 5,9 пмоль/см, в диапазоне нормы (норма 5,9-10,9 МЕ/мл). Таким образом, отсутствие полиморфизма генов - гена MTNR1B (rs10830963) - СС и гена SIRT1 (rs7069102) - СС на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза, содержания алюминия в моче, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgG к алюминию и цАМФ, то есть в отсутствии негативной генетической программы превышение референтной концентрации алюминия в моче не формирует развитие дефицита энергозависимых процессов, и не приводит к развитию ожирения у данного пациента.

Для доказательства точности данного вывода - отсутствия нарушений углеводного и жирового обменов, были установлены следующие показатели метаболизма у данного ребенка, которые имели следующие значения: уровень глюкозы - 5,1 ммоль/дм³ (физиологическая норма 3,3-5,5 ммоль/дм³); уровень ЛПНП - 3,2 ммоль/дм³ (норма 1,5-3,9 ммоль/дм³).

Анализируя представленные данные, можно сделать вывод, что у обследуемого пациента отсутствуют нарушения энергетического и связанного с ним углеводного и жирового обменов. Таким образом, при анализе маркеров метаболизма изменений показателей энергетического обмена, обусловленных действием алюминия, выявлено не было.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев обеспечивается его назначение.

Для доказательства достоверности предлагаемого способа, было проведено генетическое обследование двух групп детей, проживающих на территории с повышенным содержанием в воздухе и питьевой воде алюминия. При этом первая группа (22 ребенка) страдала ожирением, вторая группа (19 детей) была нормального веса. У данных детей был проведен сравнительный анализ полиморфных изменений генотипов мелатонинового рецептора и сиртуина. Данные, полученные в ходе указанного обследования, приведены в таблице 2.

Результаты генетического обследования детей показали, что в группе детей, страдающих ожирением, носителями мутаций в гетерозиготе генов MTNR1B (rs10830963) и SIRT1 (rs7069102) является большинство, в то время как в группе детей с нормальным весом такой закономерности не выявлено.

Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники ожирения, ассоциированные с влиянием алюминия, по заявляемым генетическим критериям, содержанию алюминия в моче и по уровню IgG к алюминию, и начать профилактические мероприятия.