Способ выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний а именно к средствам диагностики инфекции у животных.

Известен способ выявления ДНК вируса ринотрахеита у крупного рогатого скота при помощи одноступенчатой ПЦР с использованием пары праймеров , комплиментарных высоко консервативной области генома вируса ринотрахеита у крупного рогатого скота гена ти-мидинкиназы (tk) (Kibenge F.S. et al, "Amplification of strains of bovine herpesvirus 1 by use polymerase chain reaction with primers in the thymidine kinase region", American Journal of Veterinary Research, 1994, Sep; 55(9):1206-1212).

Также известен способ выявления ДНК вируса ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции -с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя ДНК вируса ринотрахеита олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов (патент RU №2259398, кл. С12N 15/38, С12Q 1/68, 2005 г., - прототип).

Однако в известном способе последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, кроме того - ограниченные функциональные возможности.

Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома вируса ринотрахеита крупного рогатого скота.

Техническим результатом является получение достоверной диагностики возбудителя ДНК вируса ринотрахеита крупного рогатого скота. Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота, включающий выделение ДНК сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов согласно изобретению проводят флуоресцентную детекцию, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1), а по каналу FAM/Green сигнал внутреннего контрольного образца, и интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1), что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM/Green сигнал внутреннего контроля, на фиг. 2 - канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1), фиг. 3 - количественные данные таблица количественных данных для Cycling A.Yellow (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и A. Green (BКO).

Способ выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1)

у крупного рогатого скота осуществляется следующим образом Предварительно из биологического материала, который берут по выбору: сперму, мазки из влагалища или со слизистой носовой, ткани и органы (селезенка, легкие) и лимфоузлы выделяют ДНК сорбционным методом. Осуществляют постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуорофорных красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1), а по каналу FAM/Green - сигнал внутреннего контрольного образца. Затем проводят интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, т.е. ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) присутствует, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК вируса ринотрахеита отсутствует т.е. результат реакции - отрицательный. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, если соотношение будет отклоняться в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов.

Фрагмент генома ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и фрагмент генома бактериофага Т4 представлены следующими нуклеотидными последовательностями:

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Праймеры, специфичные для ДНК Infectious bovine rhinotracheites virus были отобраны на основе консервативного участка гена "glycoprotein" (Herpesvirus type 1 glycoprotein gene, complete cds. M23257) и спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). С помощью BLAST праймеры были проверены на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека. Термодинамический анализ выбранных праймеров был выполнен с помощью Vector NTI. Расчетная длина специфического фрагмента составила 120 пар нуклеотидов.

Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклео-тидный флуоресцентно-меченный зонд IRT-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров IRT-F и IRT-R). Зонд был помечен красителем R6G. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР были описаны с помощью программы "Oligo 6.0".

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного осуществления способа выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота.

Для исследования используют следующий биологический материал по выбору:

- сперму отбирают в объеме не менее 2 мл в стерильные пробирки.

- мазки из влагалища берут стерильным зондом с использованием стерильных гинекологических инструментов. Собранный материал помещают в пробирку, содержащую 500 мкл стерильного физиологического раствора.

- мазки со слизистой носовой полости берут стерильным зондом, помещая собранный материал в пробирку, содержащую 500 мкл стерильного физиологического раствора.

- из тканей и органов (селезенка, легкие) вырезают кусочки размером 1×1×1 см и помещают в стерильный контейнер. Лимфоузлы берут целиком Подготовку исследуемого материала осуществляют следующим образом:

Мазки из влагалища и со слизистой носовой полости используют без предварительной подготовки.

Образцы спермы смешивают в соотношении 1:4 с физиологическим раствором. Для экстракции ДНК используют 100 мкл полученной смеси.

Пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс об/мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции ДНК. Далее проводят анализ, состоящий из трех этапов:

- экстракция НК (на этом этапе дополнительно используют реактивы для экстракции, например набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР»);

- проведение ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

- учет результатов анализа.

Для проведения анализа используют набор в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-РИНОТРАХЕИТ-КРС-ФАКТОР» для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР РВ), ТУ 21.10.60-125-51062356-2016, для диагностики in vitro, (http://www.vetfaktor.ru/.).

Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР РВ (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы); 2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). В набор не входят реактивы для экстракции нуклеиновых кислот. Выделение ДНК может проводиться, например, с помощью наборов на основе сорбционного метода, в состав которых входит силика или микроцентрифужные колонки, а также наборов на основе фенол-хлороформной экстракции и т.п. Рекомендуется использовать набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР» либо аналогичный. Состав набора приведен в таблицах 1 и 2.

* Возможна легкая опалесценция

1-й этап анализа - экстракция (выделение) нуклеиновых кислот (НК) из исследуемых проб.

Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образец (ВКО) BoHV-1. В качестве внутреннего контрольного образец (ВКО) BoHV-1 используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклео-тидных последовательностей на 1 мкл.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции, к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначить как ВК-).

Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

Далее подготавливают образцы к проведению ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) BOHV-1, ВКО BOHV-1 и ДНК буфера. В качестве положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, при не соблюдении этого соотношения наблюдаются повторности сомнительных образцов.

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ BOHV-1

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР BOHV-1

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной по п. 7.1 (включая пробу ВК-);

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BOHV-1

2-й этап анализа - проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией с помощью прибора «Rotor-Gene Q».

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.

Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки ампли-фикатора. Запрограммировать прибор согласно инструкции производителя.

После завершения программы амплификации отработанные пробирки утилизируют в соответствии с МУ 1.3. 2569 -09.

3-й этап - учет результатов анализа, интерпретация результатов анализа. Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4, фиг. 1, 2, 3

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE (HEX)/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green (фиг 1, 3) указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.

Образец считается положительным (ДНК вируса ринотрахеита КРС присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE (HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4, фиг. 2, 3). Если для исследуемого образца по каналу JOE (HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE (HEX)/Yellow более 37), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого технического решения с прототипом, в котором использовался метод ПНР с электрофоретической детекцией. Оказалось чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при выявлении генома ДНК вируса ринотрахеита КРС на 3,0-3,3% выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.