СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЭТАНОЛА ИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к способам получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья.

В настоящее время в России и за рубежом биоэтанол производится в основном из пищевого сахаро- и крахмалсодержащего сырья, что негативно отражается на себестоимости продукта и отрицательно влияет на продовольственную безопасность стран. Благодаря обилию, низкой стоимости и высокому содержанию углеводов растительное целлюлозосодержащее сырье (отходы агропромышленного комплекса, энергетические культуры) является перспективным источником для деполимеризации и биоконверсии с получением биоэтанола.

Технология получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья состоит из четырех основных стадий: предварительной физико-химической обработки сырья, ферментативного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлоз полученного субстрата, сбраживания этанолсинтезирующими микроорганизмами моносахаридов ферментативного гидролизата, выделения биоэтанола. Стадии ферментативного гидролиза и спиртового брожения могут проводиться совместно.

Изучение уровня техники выявило сходные по своей сути известные технические решения.

Известен способ получения биоэтанола по патенту РФ №2421521 (дата публикации 20.06.2011 г.), включающий предварительную обработку морских водорослей, ферментативный гидролиз, осуществление процесса брожения с помощью этанолсинтезирующих дрожжей и выделение биоэтанола.

Основным и главным недостатком описанного технического решения является ограниченная сырьевая база, для успешной и рентабельной работы производственные мощности целесообразно располагать только вблизи водоемов.

В патенте РФ №2284355 (дата публикации 27.09.2006 г.) предлагается способ получения этанола из растительного сырья, включающий гидролиз растительного сырья серной кислотой, нейтрализацию гидролизата аммиачной водой, аэробно-спиртовое брожение, ректификацию спиртовой бражки, утилизацию отходов.

Основным недостатком вышеописанного способа получения этанола является деградация сахаров в реакции гидролиза и образование нежелательных побочных продуктов, это не только снижает выход сахаров, но и некоторые из побочных продуктов также сильно ингибируют образование этанола в ходе спиртового брожения, концентрация этанола в бражке очень низка.

В публикации [Unrean, P. Systematic optimization of fed-batch simultaneous saccharification and fermentation at high-solid loading based on enzymatic hydrolysis and dynamic metabolic modeling of Saccharomyces cerevisiae / P. Unrean, S. Khajeeram, K. Laoteng // Appl Microbiol Biotechnol. 2016. №100. C. 2459-2470] описан способ получения биоэтанола из предварительно обработанного растительного сырья - багассы (отхода сахарного тростника) - проведением одновременного ферментативного гидролиза и спиртового брожения с подпиткой.

К недостаткам способа следует отнести: неэффективность предварительной обработки сырья, дающей субстрат с содержанием целлюлозы всего 37,6%, гемицеллюлоз 23,5%; добавление в реакционную массу довольно большого объема мелассы (10%), которая могла быть более рационально использована в пищевой, кормовой и микробиологической промышленности. Кроме того, получение биоэтанола, например, в России по данному способу невозможно, так как используемое сырье является экзотическим в силу климатических условий страны.

По части ферментативного гидролиза известен способ получения высококонцентрированных растворов глюкозы из целлюлозосодержащего сырья по патенту РФ №2624668 (дата публикации 05.07.2017 г.), включающий предварительную обработку сырья и последующий ферментативный гидролиз. В способе предлагается проводить ферментативный гидролиз при концентрации субстрата 250-300 г/дм³ с внесением свежей порции субстрата каждые 2-8 ч и отводом глюкозы с помощью мембранной фильтрации.

Недостатки описанного способа в следующем: дороговизна отвода глюкозы с помощью мембранной фильтрации; нужны особенные условия хранения раствора глюкозы; большие трудозатраты, возникающие из-за необходимости перекачки раствора глюкозы в другой ферментер для использования в качестве питательной среды для биосинтеза этанола и других продуктов микробного метаболизма.

Наиболее близким и потому принятым за прототип является способ получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья по патенту РФ №2593724 (дата публикации 10.08.2016 г.), включающий предварительную обработку сырья, совмещенные стадии ферментативного гидролиза и спиртового брожения, выделение биоэтанола из бражки.

Основным и главным недостатком описанного способа является относительно низкий выход биоэтанола и, как следствие, нерентабельность его дистилляции из бражки и ректификации.

Задачей предлагаемого технического решения является создание более рентабельного способа получения биоэтанола из быстровозобновляемого целлюлозосодержащего сырья с повышенным выходом продукта и минимизацией затрат на стадиях дистилляции и ректификации биоэтанола.

Поставленная задача решается предлагаемым способом получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья, который включает предварительную обработку целлюлозосодержащего сырья разбавленным раствором кислоты с концентрацией 1-12% при атмосферном давлении, совмещенную стадию ферментативного гидролиза и спиртового брожения, выделение биоэтанола из бражки; при этом на стадии ферментативного гидролиза при начальной концентрации сухих веществ 6-9% достигают общей концентрации сухих веществ 15-27% порционным внесением субстрата и ферментных препаратов с интервалом 4-8 ч, и стадию проводят до момента конверсии субстрата в редуцирующие вещества на 40-50%, после чего вносят посевной материал этанолсинтезирующих микроорганизмов, стимуляторы биосинтеза этанола и проводят спиртовое брожение, совмещенное с ферментативным гидролизом. Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что на стадии ферментативного гидролиза при начальной концентрации сухих веществ 6-9% достигают общей концентрации сухих веществ 15-27% порционным внесением субстрата и ферментных препаратов с интервалом 4-8 ч, при этом стадию проводят до момента конверсии субстрата в редуцирующие вещества на 40-50%, после чего вносят посевной материал этанолсинтезирующих микроорганизмов, стимуляторы биосинтеза этанола и проводят спиртовое брожение, совмещенное с ферментативным гидролизом. Известно, что получить биоэтанол из целлюлозосодержащего сырья с высоким выходом довольно проблематично и очевидным решением является увеличение концентрации субстрата, но, как правило, эффективность биоконверсии целлюлозы при ферментативном гидролизе уменьшается с увеличением концентрации субстрата ввиду реологических свойств реакционной массы (масса очень густая, процессы массо- и теплообмена идут медленно с низкой эффективностью). Эту проблему можно решить методом подпитки при применении правильно подобранной для конкретного субстрата технологической схемы.

Также известны преимущества совмещения стадий ферментативного гидролиза и спиртового брожения. Совмещение стадий позволяет сократить общую продолжительность процесса; чем раньше будет внесен продуцент этилового спирта, тем выше будет микробиологическая стабильность процесса; при внесении продуцентов этилового спирта редуцирующие вещества начинают отводиться из системы и расходоваться на синтез биоэтанола, таким образом, равновесие ферментативной реакции гидролиза целлюлозы постоянно смещается в сторону образования продуктов реакции, этим достигается интенсификация процесса осахаривания. Такой процесс, как правило, начинается с отдельной стадии ферментативного гидролиза и заканчивается стадией совмещенного ферментативного гидролиза и спиртового брожения. Отдельная стадия ферментативного гидролиза представляет собой стадию частичного ферментативного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлоз субстрата, проводится с помощью ферментных препаратов целлюлазно-ксиналазно-глюканазного действия при перемешивании и оптимальных для действия ферментов температуре и активной кислотности. Так как ферментативный гидролиз различных по природе и способу предобработки субстратов идет с разной скоростью, в данном техническом решении предлагается продолжительность отдельной стадии ферментативного гидролиза определять по степени конверсии субстрата в редуцирующие вещества.

Важно с посевным материалом этанолсинтезирующих микроорганизмов вносить в реакционную массу стимуляторы биосинтеза этанола, потому как гидролизаты из целлюлозосодержащего сырья обеднены некоторыми макро-, микроэлементами, витаминами, аминокислотами. В условиях недостатка азотного и фосфорного питания этанолсинтезирующие микроорганизмы, будучи автотрофами, способны самостоятельно синтезировать необходимые витамины, однако, при этом глюкоза будет расходоваться нецелевым образом, что приведет к снижению скорости биосинтеза этанола и его выхода. Самым простым технологическим решением представляется внесение питательных солей (сульфат или дигидрофосфат аммония, мочевина, монофосфат калия, сульфат магния, хлорид кальция). Другим доступным технологическим решением является добавление в гидролизаты не питательных солей, способствующих синтезу витаминов в клетках микроорганизмов, а непосредственно готовых витаминов, являющихся стимуляторами биосинтеза этанола. Главным критерием применения возможных добавок является экономическая целесообразность, поэтому в зависимости от рыночной стоимости имеет смысл вносить в питательную среду витамины, полученные химическим или микробиологическим способом, либо дрожжевой экстракт. Еще одним необходимым стимулятором биосинтеза этанола являются аминокислоты, самым дешевым источником которых могут служить пептон, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, комплексные препараты аминокислот, полученные путем микробиологического синтеза, белково-витаминные концентраты и др.

Общая концентрация сухих веществ на стадии ферментативного гидролиза составляет 12-27%, этот интервал выбран исходя из следующего: если концентрация будет меньше 12%, то концентрация этанола в полученной бражке не превысит технический и экономический предел для дистилляции в промышленном масштабе; если концентрация сухих веществ будет больше 27%, то в силу реологических свойств высококонцентрированной суспензии будет затруднен массообмен, возможно субстратное ингибирование ферментов, необратимая адсорбция ферментов и этанолсинтезирующих микроорганизмов на субстрат, в результате чего будет недостижима высокая степень гидролиза субстрата и высокая концентрация этанола. Следует отметить, что при высоких концентрациях сухих веществ в реакционной массе применяются технологически устойчивые к повышенному осмосу этанолсинтезирующие микроорганизмы.

Временной интервал внесения порций субстрата и ферментных препаратов каждые 2-8 ч обусловлен следующим: при уменьшении этого интервала возникнут трудности с массообменом, а с увеличением этого интервала увеличится и общая продолжительность процесса получения биоэтанола, что, помимо экономических соображений, также чревато возможностью контаминации реакционной массы посторонней микрофлорой.

Стадия ферментативного гидролиза проводится до момента конверсии субстрата в редуцирующие вещества на 40-50%. Совмещение ферментативного гидролиза и спиртового брожения при степени конверсии, не достигшей 40%, не даст высокий выход биоэтанола ввиду раннего изменения температурного оптимума для действия гидролитических ферментов и адсорбции этанолсинтезирующих микроорганизмов на субстрат. Проведение стадии ферментативного гидролиза до степени конверсии более 50% увеличит общую продолжительность процесса, увеличит риск контаминации посторонней микрофлорой, не приведет к существенной интенсификации процесса ферментативного гидролиза за счет отведения сбраживаемых сахаров этанолсинтезирующими микроорганизмами.

В качестве целлюлозосодержащего сырья в предлагаемом способе используется солома, или шелуха зерновых культур, или отходы овощных и плодово-ягодных культур, или мискантус.

При уборке и переработке зерновых культур остается огромное количество отходов - соломы и шелухи. Например, шелуха овса - это отход массовой культуры, занимающей значительные площади мире, особенно на территории России (по данным Росстата сбор овса в 2017 г. в России составил 5,45 млн т.). Овес характеризуется высокой пленчатостью, которая достигает 30%. На зерноперерабатывающих предприятиях накапливается огромное количество шелухи, при этом, мало того, что сырье многотоннажно скапливается в одном месте, оно не требует дальнейшей технологической переработки, а стоимость сбора шелухи перенесена на стоимость продуктов переработки овса (крупа, хлопья, толокно, мука, овсяное молоко, слайсы и т.д.). Шелуха овса не может быть использована ни в качестве топлива, ни в качестве сырья для топливных пеллет из-за высокой зольности с повышенным содержанием легкоплавких солей калия, которые приводят к образованию в печах прочного нагара. Ввиду высокого содержания целлюлозы (около 40%) шелуха овса не может быть применена и в качестве индивидуального корма для сельскохозяйственных животных, однако, по той же причине этот отход может быть успешно трансформирован в биоэтанол.

Технология переработки овощных и плодово-ягодных культур предусматривает образование большого количества отходов при инспекции, очистке, резке, протирании, прессовании и других технологических операциях. К примеру, свекловичный жом представляет собой обессахаренную стружку и составляет до 82% от общей массы переработанной свеклы. В настоящее время в качестве корма в свежем виде используют 35-40% свекловичного жома, а остальное оказывается невостребованным и вывозится в отвал. Сухой свекловичный жом содержит около 45% целлюлозы и гемицеллюлоз, что делает его перспективным сырьем для получения биоэтанола.

Мискантус - род многолетних травянистых растений семейства мятликовых, техническая культура, обладающая высокой урожайностью при минимальных затратах на возделывание и способная расти на почвах, непригодных для традиционного земледелия. Возможно получать до 15 т/га сухой массы мискантуса в течение 15-20 лет после однократных затрат на его посадку. Содержание целлюлозы в биомассе мискантуса находится на уровне 50%.

Для пояснения предлагаемого технического решения ниже приведены примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Берем шелуху овса влажностью 5,5%, проводим ее обработку 4% раствором азотной кислоты в течение 5 ч при температуре 96°С, промываем до нейтральной реакции. Ферментативный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз полученного субстрата осуществляем с помощью мультиэнзимной композиции на основе ферментных препаратов: «Целлолюкс-А» и «Ультрафло Коре». Начальная концентрация сухих веществ 6%; с интервалом в 4 ч в систему вносим порции субстрата и соответствующего количества ферментных препаратов до 15% сухих веществ. По достижении степени конверсии субстрата в редуцирующие вещества 50% и после охлаждения реакционной массы до 28°С вносим посевной материал Schizosaccharomyces pombe и стимуляторы биосинтеза этанола: сульфата аммония - 1,8 г/дм³, монофосфата калия - 1,0 г/дм³, сульфата магния - 1,0 г/дм³, хлорида кальция - 0,2 г/дм³ и дрожжевого экстракта - 6,5 г/дм³. По окончании спиртового брожения биоэтанол из бражки выделяем с помощью брагоректификационной установки. Выход биоэтанола составляет 23,4 дал/т шелухи овса.

Пример 2.

Берем солому ячменя влажностью 15%, проводим ее обработку 12% раствором соляной кислоты в течение 5 ч при температуре 96°С, промываем до нейтральной реакции. Ферментативный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз полученного субстрата осуществляем с помощью мультиэнзимной композиции на основе ферментных препаратов: «Целлолюкс-А» и «Брюзайм BGX». Начальная концентрация сухих веществ 9%; с интервалом в 4 ч в систему вносим порции субстрата и соответствующего количества ферментных препаратов до 18% сухих веществ. По достижении степени конверсии субстрата в редуцирующие вещества 50% и после охлаждения реакционной массы до 30°С вносим посевной материал Pachysolen tannophillus и стимуляторы биосинтеза этанола: сульфата аммония - 2,0 г/дм³, монофосфата калия - 0,5 г/дм³, сульфата магния - 0,5 г/дм³ и дрожжевого экстракта - 8,0 г/дм³. По окончании спиртового брожения биоэтанол из бражки выделяем с помощью брагоректификационной установки. Выход биоэтанола составляет 22,0 дал/т соломы ячменя

Пример 3.

Берем свекловичный жом влажностью 14%, проводим его обработку 1% раствором серной кислоты в течение 1 ч при температуре 85°С, промываем до нейтральной реакции. Ферментативный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз полученного субстрата осуществляем с помощью мультиэнзимной композиции на основе ферментных препаратов: «Целлолюкс-А» и «Ультрафло Коре». Начальная концентрация сухих веществ 6%; с интервалом в 8 ч в систему вносим порции субстрата и соответствующего количества ферментных препаратов до 20% сухих веществ. По достижении степени конверсии субстрата в редуцирующие вещества 47% и после охлаждения реакционной массы до 32°С вносим посевной материал Saccharomyces cerevisiae и стимуляторы биосинтеза этанола: сульфата аммония - 1,0 г/дм³, монофосфата калия - 1,0 г/дм³, пептона - 9,5 г/дм³. По окончании спиртового брожения биоэтанол из бражки выделяем с помощью брагоректификационной установки. Выход биоэтанола составляет 11,0 дал/т свекловичного жома.

Пример 4.

Берем яблочный жмых влажностью 10%, проводим его обработку 1% раствором серной кислоты в течение 1,5 ч при температуре 90°С, промываем до нейтральной реакции. Ферментативный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз полученного субстрата осуществляем с помощью мультиэнзимной композиции на основе ферментных препаратов: «Целлолюкс-А» и «Ультрафло Коре». Начальная концентрация сухих веществ 8%; с интервалом в 8 ч в систему вносим порции субстрата и соответствующего количества ферментных препаратов до 22% сухих веществ. По достижении степени конверсии субстрата в редуцирующие вещества 45% и после охлаждения реакционной массы до 32°С вносим посевной материал Schizosaccharomyces pombe и стимуляторы биосинтеза этанола: дигидрофосфата аммония - 4,0 г/дм³, сульфата магния - 1,0 г/дм³ и дрожжевого экстракта - 3,6 г/дм³. По окончании спиртового брожения биоэтанол из бражки выделяем с помощью брагоректификационной установки. Выход биоэтанола составляет 8,5 дал/т яблочного жмыха.

Пример 5.

Берем мискантус влажностью 13%, проводим его обработку 10% раствором надуксусной кислоты в течение 3 ч при температуре 98°С, промываем до нейтральной реакции. Ферментативный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз полученного субстрата осуществляем с помощью мультиэнзимной композиции на основе ферментных препаратов: «Целлолюкс-А» и «Брюзайм BGX». Начальная концентрация сухих веществ 9%; с интервалом в 6 ч в систему вносим порции субстрата и соответствующего количества ферментных препаратов до 27% сухих веществ. По достижении степени конверсии субстрата в редуцирующие вещества 40% и после охлаждения реакционной массы до 30°С вносим посевной материал Kluyveromyces marxianus и стимуляторы биосинтеза этанола: дигидрофосфата аммония - 4,0 г/дм³, сульфата магния - 1,0 г/дм³, хлорида кальция - 0,2 г/дм³ и пептона - 10,2 г/дм³ По окончании спиртового брожения биоэтанол из бражки выделяем с помощью брагоректификационной установки. Выход биоэтанола составляет 19,5 дал/т мискантуса.

Предлагаемый способ реализуется на стандартном оборудовании, он эффективен и технологически целесообразен. Способ позволяет удовлетворить существующую потребность в рентабельном способе получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья.