Способ приготовления гистологических препаратов роговицы глаза

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии и гистологии, и может быть использовано для приготовления гистологических препаратов роговицы глаза животного или человека.

Гистологический метод исследования необходим для изучения строения и функции клеток в состоянии нормы, патологии и экспериментальном периоде. Для гистологического исследования берутся элементы тканей и органов, в частности роговица глаза. Однако процесс гистологического исследования сопряжен с определенными трудностями подготовки данного биологического материала: крайне малая толщина роговицы, нарушение целостности слоев оболочек глаза при извлечении (энуклеации) глазного яблока, повреждение внутренней выстилки роговицы. Все это приводит к формированию больших погрешностей в слоистой структуре оболочек глаза и, как следствие, неправильной оценке степени и выраженности патологического процесса, поэтому их предотвращение является важной технологической задачей.

Известен стандартный способ приготовления гистологических препаратов (Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. и другие, М., «Гистология», Изд-во: Медицина, 1983 г., с. 9-10), включающий следующие основные этапы: забор биологического материала и его фиксация, обезвоживание и уплотнение, заливка в парафин материала, приготовление и окрашивание срезов. В основе действия любого фиксатора лежат сложные физико-химические процессы, в первую очередь, коагуляция (свертывание) белков. В качестве фиксаторов используют: простые, содержащие один компонент (формалин, спирт, ацетон) и сложные, содержащие два и более компонентов (жидкость Карнуа: абсолютный спирт, хлороформ, ледяная уксусная кислота; жидкость Ценкера: двухромовокислый калий, сернокислый натрий, сулема, формалин, дистиллированная вода).

Основным недостатком известного способа является низкое качество гистологических препаратов, имеющих слоистую структуру, из-за деформации биологического материала (биоматериала) при взятии и обработки химическими реагентами.

Известен способ приготовления гистологических препаратов, включающий забор биоматериала, фиксацию последнего в растворе 10-12% кислого или нейтрального забуференного формалина, промывку в проточной воде в течение 24 часов с последующим его обезвоживанием путем проведения через спирты восходящей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% и абсолютном спирте), пропитку в растворах ароматических углеводов, затем в смеси хлороформа и парафина при 37°С. Затем биоматериал парафинируют и на парафиновом микротоме изготавливают срезы толщиной 5-7 мкм, которые монтируют на предметные стекла. Затем срезы на стеклах депарафинируют в 2-х порциях ксилола, проводят через спирты нисходящей концентрации (100%, 96%, 70% этанол), промывают дистиллированной водой, окрашивают, просветляют в двух порциях ксилола и заключают в полистирол или биомаунт (Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.П., Артемьев В.Н. Гистологическая техника - 3-е изд. - Омск - Орел, 2006. - 290 с.).

Основным недостатком известного способа является низкое качество гистологических препаратов, имеющих слоистую структуру, из-за деформации биоматериала при взятии и обработки химическими реагентами для последующего гистологического исследования.

Известен способ приготовления гистологических препаратов, при котором обезвоживание производят путем четырехкратной выдержки гистологических образцов в ацетоне (Р. Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1969, с. 69). Обезвоживание в ацетоне происходит быстро: при использовании на каждой стадии свежего ацетона достаточного выдержать образец в каждой порции растворителя по 20 мин. Однако использование свежего растворителя на каждой стадии дорого. Поэтому свежий ацетон используют только для четвертой стадии, сдвигая сосуды на одну позицию; четырежды использованный ацетон очищают перегонкой. При обезвоживании по такой схеме образцы выдерживают в каждой порции по 40 мин. Гистологические препараты, получаемые по данной методике, нуждаются в постоянном контроле и сопровождаются перемещением среза из жидкой среды в воздушную, что приводит к нежелательной деформации биоматериала.

Известен способ приготовления гистологических препаратов, в соответствии с которым для заключения и длительного хранения окрашенных гистологических препаратов применяют 19-21%-ный раствор пенопласта в ксилоле, стабилизированный добавлением диметилфталата из расчета 1:100. После нанесения капли раствора на подготовленный срез и высыхания он оказывается заключенным в прозрачный и устойчивый при хранении материал в виде пленки (патент RU 2117273 С1, опубл. 10.08.1998). Одним из недостатков известного способа является низкое качество гистологических препаратов, поскольку полученная пленка не является прочной по отношению к повреждающим агентам.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ приготовления гистологических препаратов энуклеированного глаза, включающий взятие материала и его фиксацию в жидкости, обезвоживание и заливку в парафин, приготовление и окрашивание срезов, при этом перед фиксацией энуклеированного глаза его склеру прошивают нитками на глубину порядка 1 мм как минимум в двух местах - сверху или снизу, а также с боков - с назальной или височной стороны, при этом используют нить из материала, инертного к материалам, используемым при подготовке среза, - льняную или синтетическую, при этом цвет ниток варьируют по участкам прошивания, кроме того, после фиксации маркированного глаза в жидкости и его заливки в парафин глаз перед его делением на срезы располагают с учетом его исходной ориентации в пространстве, для чего ориентируются на вышеописанные нитяные метки. При этом обработку энуклеированного глаза проводят стандартным способом, используя в качестве фиксатора, преимущественно 10% формалин, а в качестве красителей гематоксилин и эозин (патент RU 2525436 С1, опубл. 10.08.2014).

Основным недостатком прототипа является низкое качество получаемых гистологических препаратов, имеющих слоистую структуру из-за деформации биоматериала при взятии и обработки химическими реагентами для последующего гистологического исследования.

Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение сохранности гистоструктуры роговицы глаза за счет предотвращения деформации биоматериала в виде расслоения и изгиба при взятии и дальнейшей обработке.

Технический результат: повышение качества гистологических препаратов роговицы глаза.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем:

Перед забором биоматериала производят предварительное введение фиксирующего раствора в переднюю камеру глаза, для чего в роговице на 13-15 часах, в 1,5-2,0 мм от лимба, производят прокол (парацентез) передней камеры глаза с помощью инсулинового шприца, при этом срез иглы направлен к лимбу вверх (обращен к эндотелию роговицы), и вводят фиксирующий раствор в количестве 0,25-0,5 мл в переднюю камеру глаза. В качестве фиксирующего раствора используют преимущественно 10-12% раствор нейтрального (забуференного до рН 7,0) формалина. Через 10-15 минут (время, необходимое для фиксации заднего эпителия роговицы) производят извлечение (энуклеацию) глаза. Забор биоматериала (роговицы глаза) производят с использованием трепана роговицы. Отделенный от глаза биоматериал (роговицу) пускают в дальнейшую обработку, включающую фиксацию биоматериала, его промывку водой, обезвоживание, заливку в парафин, приготовление срезов и их окрашивание, которые осуществляют следующим образом.

Роговицу помещают в фиксирующий раствор (10-12%-ный раствор формалина) на 24 часа. После фиксации роговицу промывают проточной водой в течение нескольких часов для освобождения от остатков фиксатора. Затем проводят обезвоживание роговицы путем последовательной обработки растворами этилового спирта с возрастающей концентрацией: 70%, 80%, 96% и 100%. Далее роговицу помещают в ксилол-парафин, затем в жидкий парафин на 1 час при 56°С, после остывания и затвердевания парафина известным образом вырезают блок с заключенной в нем роговицей и известным образом закрепляют на деревянном или пластмассовом бруске.

Приготовление срезов роговицы осуществляют известным образом с использованием микротома стандартной конструкции после закрепления брусков на объектодержателе. Затем с помощью подающего устройства объектодержатель вместе с бруском перемещают за каждый шаг на фиксированное расстояние 3-6 мкм. Микротомный нож срезает с парафинового блока слой - срез - заданной толщины. После чего срезы помещают на поверхность теплой воды для их расправления, а затем на предметное стекло.

Перед окраской срезов удаляют уплотняющую среду, освобождают от парафина (депарафинизация) с помощью спиртов (100%, 96%, 80%, 70% и 60%) и затем с помощью окраски гематоксилином и эозином достигают контрастности изучаемого гистологического препарата.

В результате получают гистологические препараты высокого качества с сохраненной гистоструктурой, позволяющей быстро и достоверно провести исследование.

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

- до забора биологического материала производят предварительное введение фиксирующего раствора (10-12%-го раствора нейтрального забуференного формалина) в переднюю камеру глаза, после чего производят извлечение глаза с последующим забором роговицы глаза в дальнейшую обработку, что позволяет более эффективно зафиксировать слоистую структуру роговицы и исключить ее деформацию при заборе материала;

- для введения в переднюю камеру глаза фиксирующего раствора, в роговице на 13-15 часах, в 1,5-2,0 мм от лимба, производят прокол с помощью инсулинового шприца и вводят фиксирующий раствор в объеме 0,25-0,5 мл, что позволяет повысить качество гистологического препарата роговицы за счет экспериментально подобранного оптимального объема введенного фиксатора, достаточного для исключения деформации роговицы при заборе и обработке, а также повысить информативность полученных срезов гистологических препаратов и точность при постановке диагноза.

Таким образом, роговица глаза после предварительной фиксации проходит все этапы стандартной гистологической обработки вплоть до изготовления срезов и окрашивания, полностью сохраняя исходную структуру, исключая возможность ее деформации, не вызывая сложностей при постановке диагноза и определения изменений.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа:

Пример 1.

Эксперимент проведен в условиях морфологической лаборатории кафедры общей патологии Сургутского медицинского института на кролях породы Новозеландский белый. В роговице глаза кролика, на 13 часах, в 1,5 мм от лимба, произвели прокол передней камеры глаза с помощью инсулинового шприца объемом 1,0 мл (срез иглы направлен к лимбу вверх) и ввели в переднюю камеру глаза 0,25 мл 12% раствора нейтрального забуференного формалина (забуферен фосфатами натрия до рН 7,0 для предотвращения пигментации). Через 10 минут произвели энуклеацию (извлечение) глазного яблока. Забор биоматериала (роговицы глаза) произвели с помощью трепана роговицы.

Извлеченную роговицу поместили в 12% раствор нейтрального забуференного формалина на 24 часа. После фиксации роговицу промыли проточной водой в течение нескольких часов и провели обезвоживание путем обработки растворами этилового спирта с возрастающей концентрацией: 70%, 80%, 96% и 100%. Затем роговицу поместили в ксилол-парафин, затем в жидкий парафин на 1 час при 56°С, после остывания и затвердевания парафина известным образом вырезали блок с заключенной в нем роговицей и закрепили на деревянном бруске. Приготовление срезов осуществили с использованием ротационного микротома (Leica RM 2265) после закрепления брусков на объектодержателе. Затем с помощью подающего устройства объектодержатель вместе с бруском перемещали за каждый шаг на фиксированное расстояние 3-6 мкм и получали срезы, которые помещали на поверхность теплой воды для их расправления, а затем на предметное стекло. Перед окраской срезов удалили уплотняющую среду, освободили срезы от парафина с помощью спиртов с нисходящей концентрацией: 100%, 96%, 80%, 70% и 60%, далее промыли дистиллированной водой и затем окрасили срезы гематоксилином и эозином для гистологического исследования с помощью световой микроскопии.

При гистологическом исследовании установлено, что препараты (срезы) имеют хорошо сохранившуюся гистоструктуру, отсутствуют изгибы и деформация слоев роговицы.

Было отчетливо видно, что передний эпителий роговицы сохранил обычное строение, передняя пограничная мембрана визуализировалась четко. Собственное вещество роговицы характеризовалось выраженным отеком, наиболее распространенным в задней трети. Коллагеновые волокна стромы роговицы имели повышенно извитой характер. Задняя пограничная мембрана гомогенна, границы ее четко не определялись. Со стороны эндотелия обнаружилась выраженная пролиферация клеток отростчатой формы. При гистологическом исследовании поставлен диагноз: отек роговицы.

Пример 2.

Эксперимент проведен в условиях морфологической лаборатории кафедры общей патологии Сургутского медицинского института на кролях породы Новозеландский белый. В роговице глаза кролика, на 15 часах, в 2,0 мм от лимба, произвели прокол передней камеры глаза с помощью инсулинового шприца объемом 1,0 мл (срез иглы направлен к лимбу вверх), и ввели в переднюю камеру 0,5 мл 10% раствора нейтрального забуференного формалина. Через 15 минут произвели энуклеацию (извлечение глазного яблока). Забор биоматериала (роговицы глаза) произвели с помощью аппарата-трепана роговицы.

Извлеченную роговицу поместили в 10% раствор нейтрального забуференного формалина на 24 часа. После фиксации роговицу промыли проточной водой в течение нескольких часов и провели обезвоживание путем обработки растворами этилового спирта с возрастающей концентрацией: 70%, 80%, 96% и 100%. Затем роговицу поместили в ксилол-парафин, затем в жидкий парафин на 1 час при 56°С, после остывания и затвердевания парафина известным образом вырезали блок с заключенной в нем роговицей и закрепили на пластмассовом бруске. Приготовление срезов осуществили с использованием ротационного микротома (Leica RM 2265) после закрепления брусков на объектодержателе. Затем с помощью подающего устройства объектодержатель вместе с бруском перемещали за каждый шаг на фиксированное расстояние 3-6 мкм и получали срезы, которые помещали на поверхность теплой воды для их расправления, а затем на предметное стекло. Перед окраской срезов удалили уплотняющую среду, освободили срезы от парафина с помощью спиртов (100%, 96%, 80%, 70% и 60%), промыли дистиллированной водой и затем окрасили срезы гематоксилином и эозином для гистологического исследования с помощью световой микроскопии.

При гистологическом исследовании отчетливо просматривалось нарушение строения стромы роговицы, видны участки соединительной ткани, деструктивные изменения стромы и переднего эпителия, а также проникновение васкуляризованной ткани между передним эпителием и передней пограничной пластинкой. Поставлен диагноз: лейкома роговицы, паннус.

Использование предлагаемого способа позволит повысить качество гистологических препаратов путем предварительной фиксации глубоких слоев роговицы глаза до извлечения органа (энуклеации), что позволит сохранить ее структуру, форму и целостность, а также значительно повысить информативность полученных срезов гистологических препаратов и повысить точность диагноза.