Результат интеллектуальной деятельности: Способ расшифровки вспышек бактериальных инфекций и определения источника заражения

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в бактериологических лабораториях клиник для расшифровки вспышек бактериальных инфекций и определения источника заражения.

Традиционно для определения возбудителей бактериальных инфекций используют способы классической микробиологии, включающие высев культуры бактерий на плотные питательные среды с последующей идентификацией вида по биохимическим признакам. (Клиническая лабораторная аналитика. Том IV. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Агат-Мед, 2003, с. 266).

Применяемый на сегодняшний день классический бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний имеет значительные ограничения и недостатки: высокая стоимость, длительность исследования, обусловленная скоростью роста бактерий при определении биохимических свойств. Кроме того, значительная часть патогенных бактерий являются трудно культивируемыми, и поэтому затруднена их идентификация в большинстве клинических микробиологических лабораторий.

Для прямой идентификации возбудителей бактериальной инфекции используют способ молекулярной диагностики, включающий первичный посев монокультуры от пациентов с последующим выделением ДНК, ее амплификацией и детекцией продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Tissari P., Zumla A., Tarkka Е. et al. Accurate and rapid identification of bacterial species from positive blood cultures with a DNA-based microarray platform: an observational study. Lancet, 2010, vol.16, №375(9710), c. 224-230).

Внедрение молекулярно-генетических методов исследований позволило повысить процент расшифровки вспышечной заболеваемости в закрытых коллективах, выявлять носителей и заболевших среди контактных, правильно проводить противоэпидемические мероприятия в очагах для предотвращения распространения инфекционных заболеваний, выбирать нужные концентрации для проведения дезинфекционных мероприятий в очаге.

Данные способы позволяют существенно сократить временной интервал, требуемый для определения возбудителя, однако перечень идентифицируемых патогенов не перекрывает всего спектра возможных возбудителей бактериальной инфекции, что ограничено технологией реализации метода. Скрининговые наборы для ПЦР позволяют идентифицировать только род возбудителей бактериальных инфекций. Точная видовая идентификация бактерий требует проведения серии дополнительных многоступенчатых исследований. Кроме того, общими недостатками способов, основанных на принципе ПЦР, являются необходимость наличия сложного и дорогостоящего оборудования, а также специально подготовленного персонала.

Наиболее близким к изобретению является способ расшифровки вспышек бактериальных инфекций с помощью масс-спектрометрии («Опыт применения масс-спектрометрии в расшифровке вспышек инфекционных заболеваний», И.В. Белова, А.Г. Точилина, И.В. Соловьева В.А., Жирнов, Т.П. Иванова, И.Ю. Широкова, О.В. Ковалишена, ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, ГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия МЗ РФ, Нижний Новгород), который позволяет не только осуществлять экспресс-идентификацию бактерий, но и изучать сходство масс-спектров их рибосомальных белков с помощью построения дендрограмм/протеинограмм. За основу построения протеинограмм брали метод корреляции с усредненной длиной связи, масс-спектры штаммов, идентифицированных до вида с максимально высоким коэффициентом Score (2,2 и выше). Для определения вспышек пищевых токсикоинфекций (ПТИ) были исследованы культуры, полученные от заболевших, персонала, из продуктов питания и смывов с объектов окружающей среды. При обнаружении объединения масс-спектров штаммов, выделенных от больного, персонала и продукта питания в отдельный подкластер, расценивали это как предварительные данные о выявлении источника и фактора передачи инфекции. Сравнив полученные данные с результатами эпидемического расследования вспышек традиционным методом, установили, что изучение схожести масс-спектров рибосомальных белков штаммов бактерий - возможных этиологических факторов ПТИ - может быть использовано при расследовании вспышек этих заболеваний в качестве предварительного этапа.

Недостатками способа является то, что обнаружение общих масс-спектров штаммов бактерий, выделенных от больного, персонала и продукта питания, в отдельный подкластер, расценивают как предварительные данные о выявлении источника и фактора передачи инфекции. То есть не указывают алгоритм проведения корреляционного анализа протеинограмм анализируемых штаммов бактерий и не определяют цифровой показатель их подобия.

Задачей изобретения является разработка быстрого, эффективного и экономичного способа определения источника заражения при расшифровке вспышек бактериальной инфекции.

Техническим результатом данного изобретения является простота и надежность способа определения штаммов бактерий и определение источника заражения.

Технический результат достигается способом расшифровки вспышек бактериальных инфекций и определения источника заражения, включающим отбор биологического материала, выделение и идентификацию штаммов бактерий классическим бактериологическим методом и методом масс-спектрометрии с максимально высоким коэффициентом Score (2,2 и выше), построение протеинограмм - белковых спектров штаммов бактерий, согласно изобретению полученные протеинограммы подвергают кластерному анализу, показывая однородность анализируемых штаммов бактерий, и корреляционному анализу, при котором определяют показатель корреляционной зависимости - среднее значение коэффициентов корреляции всех анализируемых штаммов бактерий, при этом, показатель корреляционной зависимости выше 0,75 указывает на идентичность штаммов бактерий и принадлежность к одному источнику заражения.

Способ осуществляют следующим образом.

В ходе эпидемиологического расследования вспышек бактериальных инфекций или спорадических случаев в стационаре (ИСМП инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи) проводят отбор биологического материала от больных, с объектов окружающей среды, пищевых продуктов. Исследования проводят в соответствии с нормативной документацией: МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории»; приказ №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» от 22 апреля 1985 г; «Методическим указаниям по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями» №04-723/3 от 17.12.1984 года. МУК 4.2.2942-11 «Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях», ГОСТ 31904-2012 «ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. Методы отбора проб для микробиологических испытаний».

Выделенные штаммы бактерий идентифицируют классическим бактериологическим методом и методом масс-спектрометрии, в результате которого получают их протеинограммы - белковые спектры (фиг. 1). Полученные протеинограммы подвергают кластерному и корреляционному анализу. Корреляционный и кластерный анализ выполняют в программном обеспечении MALDI Biotyper прибора MICROFLEX, Bruker Daltonics. Кластерный анализ показывает однородность анализируемых штаммов бактерий (фиг. 2). В результате корреляционного анализа сравнивают белковые спектры штаммов выборки и определяют коэффициенты корреляции, по которым вычисляется показатель корреляционной зависимости - это среднее значение коэффициентов корреляции всех сравниваемых протеинограмм штаммов бактерий с учетом стандартной ошибки среднего.

Стандартная ошибка среднего (m) вычисляется по формуле:

m - стандартная ошибка среднего

σ - величина среднеквадратического отклонения генеральной совокупности;

n - количество значений коэффициента корреляции (n, если ≥30; n-1, если ≤30)

Расчет величины среднеквадратического отклонения производят по формуле:

x - значение коэффициента корреляции;

x_cp - среднее значение коэффициентов корреляции

При оценке полученного показателя корреляционной зависимости с учетом стандартной ошибки среднего, берут значения выше 0,75, что свидетельствует о высокой корреляционной зависимости и идентичности анализируемых штаммов бактерий, так как их показатели (m/z) массы белка на заряд совпадают. При этом считают, что все идентичные штаммы бактерий относятся к одному источнику бактериальной инфекции. Эпидемиологическое расследование на основе полученных данных позволяет точно определить источник заражения (больной человек, продукт питания, окружающая среда).

Таким образом, по кластерному анализу и показателям высокой корреляционной зависимости протеинограмм исследуемых штаммов бактерий можно сделать вывод об их высоком подобии, а, следовательно, об общем источнике заражения бактериальной инфекцией.

Пример.

В инфекционное отделение поступили 13 человек с признаками кишечной инфекции в тяжелом и среднетяжелом состоянии. Все пациенты примерно в одно время посещали одно кафе. Для определения источника инфекции у всех пациентов и обслуживающего персонала кафе взят нативный кал на выявление патогенных штаммов возбудителей кишечных инфекций. Во всех пробах биоматериала от пациентов и у одной из сотрудниц кафе изолирован возбудитель острой кишечной инфекции - Salmonella enteritidis. Исследование осуществлялось классическим бактериологическим методом согласно «Методическим указаниям по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями» №04-723/3 от 17.12.84. Видовую идентификацию выделенных штаммов бактерий Salmonella enteritidis с характерными для них биохимическими свойствами проводили согласно антигенно-диагностической схеме Кауфмана-Уайта с применением коммерческих агглютинирующих сывороток. В реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой к сальмонеллам О-групп АВСДЕ, с отдельными О-сыворотками 1, 9, 12, Н-сыворотками 1 фаза g, m, 2 фаза 1, 7, исследуемые штаммы бактерий дали положительную агглютинацию, что подтверждает видовую принадлежность их к Salmonella enteritidis. Параллельно выделенные штаммы бактерий были идентифицированы методом масс-спектрометрии по белковому профилированию, как Salmonella sp., получены их протеинограммы (фиг. 1). Показатель идентификации штаммов бактерий «score» составил в среднем 2,2. По таблице классификации результатов Maldi Biotyper Bruker Daltonics все пробы отнесены к Salmonella sp (enterica st Anatum) 11LAL (NCBI 58712). В программе MALDI Biotyper проведен кластерный и корреляционный анализ протеинограмм всех выделенных штаммов бактерий Salmonella enteritidis. Кластерный анализ (фиг. 2) показал высокую степень подобия выделенных штаммов бактерий от всех пациентов, в том числе сотрудницы кафе. В результате проведения корреляционного анализа протеинограмм всех штаммов бактерий между собой получены значения коэффициентов корреляции, таблица 1.

Затем рассчитывали значение показателя корреляционной зависимости с учетом стандартной ошибки среднего (т). Для этого необходимо рассчитать среднеквадратичное отклонение всей выборки по формуле (2).

Стандартная ошибка среднего (m), рассчитанная по формуле (1)

Таким образом, значение показателя корреляционной зависимости составило 0,85±0,01.

Таким образом, кластерный и корреляционный анализ показал, что источником вспышки кишечной инфекции в данном случае можно считать сотрудницу кафе.