Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАЦИТРАЦИНА В МЯСЕ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения антибиотика бацитрацина в мясе и мясных продуктах методом обращеннофазовой высокоэффективной хроматографии.

Бацитрацин относится к кормовым антибиотикам, при введении, которого в рационы животных и птицы улучшается обмен веществ, повышается коэффициент использования кормов, активизируется резистентность организма. При скармливании кормовых препаратов животным качество мяса и мясопродуктов не ухудшается.

Так как в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция ужесточения требований к качеству пищевых продуктов, для исключения возможности попадания антибиотика в продукты животноводства, необходима разработка и введение в практику новых, более эффективных и чувствительных методов анализа.

"Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)" предусматривают контроль антимикробных средств, в том числе бацитрацина, в продуктах животного происхождения. Согласно им, максимально допустимая концентрация бацитрацина в пищевых продуктах не должна превышать 0,02 мг/кг (20 мкг/кг). Технический Регламент Таможенного Союза TP ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" устанавливает такой же уровень. При этом контролю на бацитрацин подлежат не только мясо и субпродукты, но также рыба, яйца и мед.

Бацитрацин представляет собой смесь полипептидных соединений. Это означает, что при анализе бацитрацина необходимо не только определить его концентрацию в пробе, но и отличить эти вещества от других полипептидов. Поскольку в качестве кормовых добавок используются смеси, содержащие множество веществ различной структуры, происхождения и назначения, анализ бацитрацина в пищевых продуктах является сложной задачей.

На сегодняшний день в России наиболее распространенными методами определения антибиотика в продуктах питания является микробиологический и иммуноферментный.

Микробиологический метод основан на чувствительности бактерий к этому антибиотику, способности диффузии его в агаровую среду со спорами тест-микроба, препятствовующий их росту с образованием прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотика в мясе устанавливают по диаметру зон ингибиции.

Тест-система RIDASCREEN® Bacitracin основана на методе иммуноферментного анализа. Она выполнена в формате микротитровального планшета и позволяет быстро и эффективно определять содержание бацитрацина в пробах пищевых продуктов. Система соответствует МУК 4.1.3379-16 ("Методические указания по определению остаточных количеств бацитрацина в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа").

Однако эти методы имеют ряд недостатков:

- низкая специфичность. В настоящее время в продуктах питания используется большое количество добавок (консерванты, красители, усилители вкуса и т.д.), которые могут давать ложноположительный эффект;

- длительный период проведения анализа. Требуется время для выращивания спор тест-культур (от 1 до 7 суток) и для проведения самого анализа (18 часов), т.е. одно исследование занимает от 2 до 8 суток. Кроме того, для исследования необходимо постоянно поддерживать чистоту тест-культур.

Одним из наиболее перспективных и наиболее близком к предлагаемому методу является способ определения цинкбацитрацина в мясе и мясных продуктах, включающий отбор пробы, экстракцию, центрифугирование, фильтрацию, введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента (ГОСТ 33934-2016. Межгосударственный стандарт. Мясо и мясные продукты. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной экстракции с масс-спектрометрическим детектором. МКС 67, 120.10 введен 2018-01-01).

Существенным недостатком данного метода, ограничивающим его повсеместное использование, является применение дорогостоящего, технически сложного в освоении оборудования, с жесткими требованиями к качеству реактивов и расходным материалам.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка воспроизводимого, прецизионного способа выделения и концентрирования бацитрацина из биологических объектов и его количественного определения.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в расширении диапазона применения способа, в простате использования и в сокращении времени проведения анализа при сохранении высокой чувствительности способа.

Для достижения этого технического результата в способе определения бацитрацина в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающим отбор пробы, экстракцию, центрифугирование, фильтрацию, введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, в качестве пробы берут навеску тканей или органов животных массой 5 г, экстракцию проводят 1,5 мМ водным раствором трилона Б и 1%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, после фильтрации проводят очистку экстракта путем твердофазной экстракции на картридже Oasis HLB 3 см³ × 60 мг, который предварительно перед использованием конденсируют 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты (рН~4,0), полученный экстракт пропускают со скоростью 1 мл/мин через картридж, сушат на вакууме под давлением 20 мм рт.ст. и промывают 5 мл бидистиллированной водой, элюируют по 2,5 мл метанолом 2 раза, полученный элюат выпаривают под слабым током азота при температуре +25°С до 1 мл, полученный остаток растворяют в 4 мл раствора смеси 0,05М калия фосфорнокислого однозамещенного, ацетонитрила и метанола взятых в соотношении 40/15/45, а в качестве хроматографа используют в жидкостной хроматограф Agilent 1260 Infinity с ультрафиолетовым детектором G 1315 D и колонкой Reprosil ODS -АС 18 мм (250×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм.

Признаками, отличающими предлагаемый способ от наиболее близкого к нему известного по ГОСТу 33934-2016, являются взятие пробы в виде навески тканей или органов животных массой 5 г, проведение экстракции 1,5 мМ водным раствором трилона Б и 1% раствором трихлоруксусной кислоты, проведение очистки после фильтрации - твердофазной экстракцией на картридже Oasis HLB 3 см³ × 60 мг, предварительное конденсирование перед использованием его 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты (рН~4,0), пропускание через картридж полученного экстракта со скоростью 1 мл/мин, сушку его в вакууме под давлением 20 мм рт.ст. и его промывание 5 мл бидистиллированной водой, элюирование по 2,5 мл метанолом 2 раза, выпаривание полученного элюента под слабым током азота при температуре +25°С до 1 мл, растворение полученного остатка в 4 мл раствора смеси 0,05М калия фосфорнокислого однозамещенного, ацетонитрила и метанола взятых в соотношении 40/15/45 соответственно, использование в качестве хроматографа - жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity с ультрафиолетовым детектором G 1315 D и колонкой Reprosil ODS -AC 18 мм (250×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм. Это позволяет расширить диапазоны применения способа - определить все компоненты антибиотика бацитрацина, а также широко использовать, упростить процесс анализа и сократить время его проведения в 2 раза, при сохранении высокой чувствительности.

Способ определения бацитрацина в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют следующим образом. Берут навеску мяса измельчают в гомогенизаторе-лабораторном MPW-302 в количестве 5 г, взвешенной с записью результата до второго десятичного знака на весах лабораторных ВЛТЭ-500, помещают в центрифужную пробирку и добавляют 5 мл 1,5 мМ водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилона Б) и 5 мл 1% водного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), экстрагируют на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Раствор перемешивают 20 мин на встряхивателе, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге MPW-310 и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон.

Очистку экстракта осуществляют путем твердофазной экстракции на картридже Oasis HLB 3 см³ × 60 мг. Предварительно картридж конденсируют 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты (рН~4,0). Доводят 1% водный раствор трихлоруксусной кислоты до (рН~4,0) 5% раствором трихлоруксусной кислоты с применением рН-метра с комбинированными стеклянными электродами с диапазоном измерений от 0 до 14 ед. рН с пределом допустимой абсолютной погрешности не более ±0,01 ед. рН.

Полученный экстракт пропускают через картридж со скоростью 1 мл/мин. Картридж сушат на вакууме под давлением 20 мм рт.ст. и промывают 5 мл бидистиллированной водой. Элюируют по 2,5 мл метанола 2 раза. Элюат выпаривают под слабым током азота на термостатируемом нагревательном модуле с системой отдувки растворителей инертным газом при температуре +25°С до 1 мл и добавляют 4 мл раствора (0,05М калия фосфорнокислого 1-замещенного (KH₂PO₄), ацетонитрила и метанола в соотношении 40/15/45).

При необходимости полученный раствор пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон.

Конечный объем вносят в жидкостной хроматограф Agilent 1260 Infinity тип G 1315 D с ультрафиолетовым детектором G 1315 D.

Условия проведения анализа жидкостной хроматографии соответствует следующим параметрам:

Обработка результатов производится вычислением показателя, площадь хроматографического пика, исследуемого образца и раствора стандарта по формуле:

S=hW_h;

где h - высота пика, то есть расстояние от максимума пика до его основания, измеренное вдоль оси отклика детектора, W_h - ширина пика у основания, то есть отсекаемый пиком отрезок линии, проведенный параллельно основанию пика на середине его высоты.

Обработку результатов анализа проводят методом абсолютной градуировки, содержание бацитрацина в биологических объектах (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где

X - содержание бацитрацина в пробе, мг/кг;

С - концентрация стандартного раствора бацитрацина, мкг/мл;

S₁ - площадь пика бацитрацина в стандартном растворе, мм²;

S₂ - площадь пика бацитрацина в анализируемой пробе, мм²;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Анализ метрологических характеристик способа определения бацитрацина в мясе и мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии показывает высокую чувствительность и избирательность и доступность метода соответствует разработанной нормативной документации за счет точного подбора экстрагента 1,5 мМ водного раствора трилона Б и 1% трихлоруксусной кислоты, использования твердофазной экстракции на картриджах Oasis HLB 3 см³ × 60 мг и колонки (250×4) мм Reprosil ODS -AC 18 с размером частиц 5 мкм, а также подвижной фазы 0,05 М KH₂PO₄ - ацетонитрил - метанол в соотношении 40:15:45 позволяет сократить продолжительность проведения анализа в два раза и сохранить высокую чувствительность анализа.

Предлагаемый способ определения бацитрацина в мясе и мясных продуктах с использованием жидкостной хроматографии был апробирован в лаборатории химического анализа ФГБНУ «Казанского Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности».

Экспериментальные данные представлены на фиг. 1 и 2.

Фиг. 1 представляет идентификацию мажорного пика А бацитрацина в стандартном растворе, содержащем 90% действующего вещества (European Pharmacopeia Reference Standard) методом ВЭЖХ.

На фиг. 1 представлена хроматограмма антибиотика бацитрацина в стандартном растворе с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity с УФ-детектором G 1315 D при длине волны возбуждения 254 нм. При данных условиях установлено время удержания пика антибиотика бацитрацина - 26,03 мин, площадь хроматографического пика - 2,9192 мм.

Фиг. 2 представляет идентификацию мажорного пика А бацитрацина в опытной пробе мяса. Искусственная затравка мяса антибиотиком бацитрацином проводилась на уровне МДУ в дозе 0,02 мг/кг.

На фиг. 2 представлена хроматограмма антибиотика бацитрацина в опытной пробе с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity с УФ-детектором G 1315 D при длине волны возбуждения 254 нм. При данных условиях установлено время удержания пика антибиотика бацитрацина - 26,05 мин, площадь хроматографического пика - 2,4960 мм.

Приводим расчет площадей пиков бацитрацина в стандартном растворе и в анализируемой пробе.

S₁=7,12×0,41=2,9192 мм² (площадь пика бацитрацина в стандартном растворе)

S₂=6,24×0,40=2,4960 мм² (площадь пика бацитрацина в анализируемой пробе)

Извлекаемость в процентом отношении составляет 85,50%.

Отработка оптимальных жидкостно-хроматографических параметров для определения бацитрацина в мясе и мясной продукции предлагаемым способом осуществлялась с использованием жидкостного хроматографа «Agilent 1260 Infinity», оснащенного термостатом колонок, градиентным насосом и с ультрафиолетовым детектором G 1315 D.

Полнота разделения бацитрацина в присутствии компонентов матрицы достигнута на колонке Reprosil ODS -AC 18 длиной 250 мм и внутренним диаметром 4 мм с сорбентом Eclipse РАН (АС 18) зернением 5 мкм при температуре колонки +25°С, при использовании режимов указанного выше градиентного состава подвижной фазы. Максимальный сигнал ультрафиолетового детектора получен при длине волны возбуждения 254 нм.

Таким образом, предлагаемый способ определения бацитрацина в мясе и мясных продуктах с использованием ВЭЖХ обладает высокой чувствительностью, прост и экономичен в осуществлении и может быть применен в любой химической лаборатории, где имеется жидкостной хроматограф с УФ-детектором. Стандартное отклонение измерения составляет 0,45% для концентрации до 0,02 мг/кг.

Источники информации

1. ГОСТ 33934-2016 МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ. Определение высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. Межгосударственный стандарт. - М. Стандартинформ, 2017. - 12 с.

2. Определение остаточных количеств бацитрацина в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа: Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. - 10 с.

3. Определение остаточных количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения: Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 12 с.