НАЦЕЛЕННЫЕ КОНЪЮГАТЫ И ЧАСТИЦЫ И ИХ СОСТАВЫ

Ссылка на связанные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 62/019001, поданной 30 июня 2014 года, озаглавленной Targeted Conjugates Encapsulated in Particles and Formulations Thereof, предварительной заявки на патент США № 62/077487, поданной 10 ноября 2014 года, озаглавленной Targeted Conjugates Encapsulated in Particles and Formulations Thereof, и предварительной патентной заявки США № 62/150413, поданной 21 апреля 2015 года, озаглавленной Targeted Conjugates and Particles and Formulations Thereof, содержание каждой из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение в целом относится к области нацеливающих лигандов, их конъюгатов и частиц для доставки лекарственных средств. В частности, изобретение относится к применению молекул, нацеливающих на рецепторы соматостатина, например, для лечения злокачественного новообразования.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Разработки в области наномедицины, как правило, направлены на улучшение фармацевтических свойств лекарственных средств и, в некоторых случаях, на усиление нацеленной доставки клеточно-специфическим образом. Было описано несколько клеточно-специфичных лекарственных средство, и они включают моноклональные антитела, аптамеры, пептиды и низкомолекулярные молекулы. Несмотря на некоторые из возможных преимуществ таких лекарственных средств, целый ряд проблем ограничивают их клиническое применение, включая размер, стабильность, стоимость производства, иммуногенность, слабую фармакокинетику и другие факторы.

Системы доставки лекарственных средств с помощью наночастиц являются привлекательными для системной доставки лекарственного средства, так как они могут удлинять период полураспада лекарственного средства в циркуляции, уменьшать неспецифический захват лекарственного средства, а также улучшать накопление лекарственного средства в опухолях, например, посредством улучшенного проникновения и эффекта удержания (EPR). Существует ограниченные примеры терапевтических средств, рецептура которых подходят для доставки в виде наночастиц, к ним относятся ДОКСИЛ® (липосомальный инкапсулированный доксирубицин) и АБРАКСАН® (связанные с альбумином наночастицы паклитаксела).

Развитие нанотехнологий для эффективной доставки лекарственных средств или кандидатных лекарственных средств в конкретные пораженные клети и ткани, например, в злокачественные клетки, в специфические органы и ткани, временно-пространственным образом может преодолеть или смягчить терапевтические трудности, такие как системная токсичность. Тем не менее, в то время как нацеливание системы доставки может предпочтительно доставлять лекарственное средство к участку, где необходима терапия, лекарственное средство, высвобожденное из наночастиц может, например, не оставаться в области клеток-мишеней в эффективных количествах или может не оставаться в циркуляции в относительно нетоксичном состоянии в течение достаточного количества времени для снижения частоты введения или возможности снижения количества вводимого лекарственного средства при этом по прежнему достижения терапевтический эффект. Соответственно, в данной области существует потребность в улучшении нацеливания и доставки лекарственных средств, в том числе в идентификации нацеливающих молекул, которые могут быть введены в частицы, и чье присутствие существенно не влияет на эффективность препарата.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявители создали молекулы, которые представляют собой конъюгаты связывающей рецептор соматостатина молекулы и активного средства, например, противоракового терапевтического средства, такого как платина-содержащее средство. Кроме того, такие конъюгаты могут быть инкапсулированы в частицы. Конъюгаты и частицы могут быть использованы для доставки активных средств, таких как противоопухолевые цитотоксические средства, в клетки, экспрессирующие рецепторы соматостатина (SSTR).

Заявители разработали новые конъюгаты и частиц, в том числе полимерные наночастицы, и их фармацевтические композиции. Конъюгаты активного средства, такого как терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство, связаны через линкер с нацеливающей молекулой, которая может связываться с рецептором соматостатина. Конъюгаты и частицы могут обеспечить улучшенную временно-пространственную доставку активного средства и/или улучшенное биораспределение по сравнению с доставкой активного средства самостоятельно. В некоторых случаях, нацеливающая молекула также может действовать в качестве терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления нацеливающее средство по существу не влияет на эффективность терапевтического средства in vivo. Способы получения конъюгатов, частиц и составов, содержащих такие частицы, описаны в настоящем документе. Такие частицы могут быть использованы для лечения или профилактики заболеваний, которые чувствительны к активному средству, например, для лечения или профилактики злокачественных новообразований или инфекционных заболеваний.

Конъюгаты включают нацеливающий лиганд и активное средство, присоединенное с помощью линкера, где конъюгат в некоторых вариантах осуществления имеет формулу:

(X-Y-Z)

где Х представляет собой нацеливающую на рецептор соматостина молекулу; Y представляет собой линкер; и Z представляет собой активное средство.

Один лиганд может быть конъюгирован с двумя или более активными средствами, где конъюгат имеет формулу: X-(Y-Z)_n. В других вариантах осуществления одна молекула активного средства может быть связана с двумя или более лигандами, где конъюгат имеет формулу: (X-Y)_n-Z. n представляет собой целое число, равное или больше 1.

Нацеливающая молекула, X, может быть любой нацеливающей на рецептор соматостатина молекулой, такой как, но ими не ограничиваясь, соматостатин, октреотид, окреотат, вапреотид, пасиреотид, ланреотид, сеглитид, или любым другим примером лигандов, связывающих рецептор соматостатина. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула представляет собой молекулу, связывающую рецептор соматостатина, которая связывается с рецепторами соматостатина 2 и/или 5.

Линкер, Y, связан с одним или более активными средствами и с одним или более нацеливающими лигандами с образованием конъюгата. Линкер Y присоединен к нацеливающей молекуле X и активному средству Z с помощью функциональных групп, независимо выбранных из сложноэфирной связи, дисульфида, амида, ацилгидразона, простого эфира, карбамата, карбоната и мочевины. В качестве альтернативы линкер может быть присоединен либо к нацеливающему лиганду, либо к активному лекарственному средству с помощью нерасщепляемой группы, такой как предусмотрено конъюгатом, между тиолом и малеимидом, азидом и алкином. Линкер независимо выбран из группы, включающей алкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил, где каждый из алкила, алкенила, циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила необязательно замещен одной или несколькими группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, циано, нитро, гидроксила, карбоксила, карбамоила, простого эфира, алкокси, арилокси, амино, амида, карбамата, алкила, алкенила, алкинила, арила, арилалкила, циклоалкила, гетероарила, гетероциклила, где каждый из карбоксила, карбамоила, простого эфира, алкокси, арилокси, амино, амида, карбамата, алкила, алкенила, алкинила, арила, арилалкила, циклоалкила, гетероарила или гетероциклила необязательно замещен одной или несколькими группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, циано, нитро, гидроксила, карбоксила, карбамоила, простого эфира, алкокси, арилокси, амино, амида, карбамата, алкила, алкенила, алкинила, арила, арилалкила, циклоалкила, гетероарила, гетероциклила.

В некоторых вариантах осуществления линкер содержит расщепляемую функциональную группу. Расщепляемая функциональная группа может быть гидролизована in vivo или может быть разработана так, чтобы ферментативно гидролизоваться, например, с помощью катепсина В.

Активное средство, Z, также называемое полезной нагрузкой, может быть терапевтическим, профилактическим, диагностическим или пищевым средством. В некоторых вариантах осуществления активное средство, Z может представлять собой противораковое средство, химиотерапевтическое средство, противомикробное, противовоспалительное средство, или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат может быть соединением следующей формулы Ia:

Ia

где Х представляет собой нацеливающую на рецептор соматостина молекулу, как определено выше; Z представляет собой активное средство; Х', R¹, Y', R² и Z' такие, как определено в настоящем документе.

Х' либо отсутствует, либо независимо выбран из карбонила, амида, мочевины, амино, сложного эфира, арила, арилкарбонила, арилокси, ариламино, одной или нескольких природных или неприродных аминокислот, тио или сукцинимидо; R¹ и R² либо отсутствуют, либо состоят из алкила, замещенного алкила, арила, замещенного арила, полиэтиленгликоля (2-30 единиц); Y' отсутствует, представляет собой замещенный или незамещенный 1,2-диаминоэтан, полиэтиленгликоль (2-30 единиц) или амид; Z' либо отсутствует, либо независимо выбран из карбонила, амида, мочевины, амино, сложного эфира, арила, арилкарбонила, арилокси, ариламино, тио или сукцинимидо. В некоторых вариантах осуществления линкер может позволить одной активной молекуле средства быть связанной с двумя или более нацеливающим лигандами, или один нацеливающий лиганд может быть связан с двумя или более активными средствами.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат может быть соединением, в котором линкер Y представляет собой A_m следующей формулы Ib:

Ib

где А определен в настоящем документе, m=0-20.

А в формуле Ia представляет собой спейсерную единицу, либо отсутствует, либо независимо выбран из следующих заместителей. Для каждого заместителя пунктирные линии означают участки замещения X, Z или другой независимо выбранной единицей А, где Х, Z или А могут быть присоединены по обе стороны от заместителя:

, , , , , ,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или , где z=0-40, R представляет собой Н или необязательно замещенную алкильную группу, и R' представляет собой любую боковую цепь природных или неприродных аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления линкер может быть соединением со следующей формулой Iс:

Iс

где А определен выше, m=0-40, n=0-40, х=1-5, у=1-5, и С представляет собой элемент разветвления, определенный в настоящем документе.

С в формуле Ic представляет собой разветвленную единицу, содержащую от трех до шести функциональных групп для ковалентного присоединения спейсерных единиц, лигандов или активных лекарственных средств, выбранных из аминов, карбоновых кислот, тиолов или сукцинимидов, в том числе аминокислот, таких как лизин, 2,3-диаминопропановой кислоты, 2,4-диаминомасляной кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и цистеина.

Не ограничивающий пример конъюгата по изобретению представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:

1 2 3 4 5 6 7

В некоторых вариантах осуществления активное средство Z представляет собой DM1. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая на рецептор соматостатина молекула Х выбрана из соматостатина, сеглитида, Tyr³-октреотата (TATE), цикло(AA-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Phe) или их аналогов или производных. Х может ковалентно связан с линкером Y на С-конце или N-конце. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула Х содержит по крайней мере один остаток D-Phe, а фенильное кольцо остатка D-Phe нацеливающей молекулы X заменено на молекулу, содержащую линкер.

В одном из аспектов предложены комплексы пар гидрофобных ионов, содержащие конъюгаты по изобретению и противоионы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения противоионы отрицательно заряжены. В другом аспекте предложены частицы, содержащие конъюгаты по изобретению или комплексы пар гидрофобных ионов конъюгата по изобретению. В другом аспекте предложены фармацевтические составы, содержащие конъюгаты или частицы, содержащие конъюгаты, описанные в настоящем документе, или их фармацевтически приемлемые соли, в фармацевтически приемлемом носителе.

В одном из аспектов предложены частицы, содержащие конъюгат по изобретению. В некоторых вариантах осуществления частица имеет диаметр в диапазоне от 10 нм до 5000 нм. В некоторых вариантах осуществления частица имеет диаметр от 30 нм до 70 нм, от 120 нм до 200 нм, от 200 нм до 5000 нм или от 500 нм до 1000 нм.

Предложены способы получения конъюгатов и частиц, содержащих конъюгаты. Также предложены способы лечения заболевания или состояния, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества частиц, содержащих конъюгат, индивиду, при необходимости. В одном из вариантов осуществления целью конъюгатов являются злокачественные или гиперпролиферативные заболевания, например, лимфома, почечно-клеточный рак, лейкоз, рак предстательной железы, рак легкого (например, мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и не-SCLC), рак поджелудочной железы (например, протоков), меланома, колоректальный рак, рак яичников (например, эпителиальный рак яичников), рак молочной железы, глиобластома (например, астроцитома и глиобластома), рак желудка, рак печени, саркома, рак мочевого пузыря, рак яичка, рак пищевода, рак головы и шеи, рак эндометрия и лептоменингиальный карциноматоз.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 представлен график концентрации (мкМ) конъюгата октреотид-кабазитаксел Примера 1 в плазме крови как функция времени (часы) после инъекции в хвостовую вену крысам. Вводимые составы содержали либо свободный конъюгат октреотид-кабазитаксел или наночастицы октреотид-кабазитаксел Примера 11.

На Фигуре 2 представлен график концентрации в плазме крови (мкМ) октреотид-доксорубицин конъюгата примера 2, в зависимости от времени (часы) после инъекции в хвостовую вену у крыс. Вводимые препараты содержали либо свободный конъюгат октреотид-доксорубицин или наночастицы октреотид-доксорубицин Примера 12.

На Фигуре 3 представлен график различных конъюгатов, представленный в виде столбиков и показывающий на оси Y их активность в анализе пролиферации H524 с и без конкуренции с октреотидом. Ось Y показывает отношение IC₅₀ с добавлением октреотида к IC₅₀ без добавления октреотида. Этот анализ показывает в какой мере активность конъюгатов зависит от рецепторов соматостатина. Только конъюгаты DM1 показывают соотношение значительно больше 1. Это говорит о неожиданных выводах, что только конъюгаты DM1 проявляют активность, которая зависит от рецептора.

На Фигуре 4 показано изменение объема опухоли в течение периода до 100 дней после обработки Конъюгатом 10, Конъюгатом 10 NP6 и DM1 на модели NCI-H69.

На Фигуре 5 представлен график, показывающий процент мышей с опухолью размером <2000 мм³ в течение периода до 100 дней после обработки Конъюгатом 10, Конъюгатом 10 NP6 и DM1 на модели NCI-H69.

На Фигуре 6 показано изменение объема опухоли в течение периода 30 дней при введении нескольких доз Конъюгата 10 и Конъюгата 10 NP6.

На Фигуре 7 показан рК Конъюгата 10 и Конъюгата 10 NP6 в плазме крове крыс.

На Фигуре 8 показан ответ фосфо-гистона H3 в опухоли NCI-H69 после лечения обработки Конъюгатом 10 и Конъюгатом 10 NP6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Были охарактеризованы по крайней мере пять подтипов рецепторов соматостатина, и опухоли могут экспрессировать различные подтипы рецепторов. (например, см. Shaer et al., Int. 3. Рак 70: 530-537, 1997). Природный соматостатин и его аналоги проявляют различное связывание с подтипами рецептора. Заявители использовали эту возможность для создания новых частиц для улучшения нацеливания конъюгата, содержащего активное средство, на ткань болезни-мишени. Такое нацеливание может, например, повысить количество активного средства на участке и уменьшить токсичность активного средства в отношении индивида. Используемый в настоящем описании термин «токсичность» относится к способности вещества или композиции быть вредной или ядовитой для клеток, тканей организма или клеточной среды. Низкая токсичность относится к пониженной способности вещества или композиции быть вредной или ядовитой для клеток, тканей организма или клеточной среды. Такая пониженная или низкая токсичность может быть по отношению к стандартному значению, по сравнению с лечением или по сравнению с отсутствием лечения.

Токсичность может также быть измерена по сравнению с потерей веса индивидом, где потеря веса более чем на 15%, более чем на 20% или более 30% от массы тела является показателем токсичности. Также могут быть измерены другие показатели токсичности, такие как представленные показатели пациента, включая вялость и общее недомогание. Нейтропения или тромбопения также могут быть показателями токсичности.

Фармакологические показатели токсичности включают повышенные уровни АСТ/АЛТ, нейротоксичность, повреждение почек, повреждение GI и тому подобное.

Конъюгаты высвобождаются после введения частиц. В нацеленных конъюгатах лекарственного средства используется нацеливание активной молекулы в сочетании с повышенным проникновением и эффектом удержания (EPR) и улучшенным общим биораспределением частиц для обеспечения большей эффективности и переносимости по сравнению с введением нацеленных частиц или инкапсулированных лекарственных средств без нацеливающей способности.

Кроме того, предполагается, что токсичность конъюгата, содержащего молекулу, нацеливающую на соматостатин, связанную с активным средством, на клетки, которые не экспрессируют SSTR, будет снижена по сравнению с токсичностью, вызываемой активным средством не нацеливающей молекулы. Без привязки к какой-либо конкретной теории, заявители полагают, что эта особенность связана с пониженной способностью конъюгированного активного средства проникать в клетку по сравнению со способностью проникать в клетку только активного средства. Соответственно, конъюгаты, содержащие активное средство и частицы, содержащие конъюгаты, как описано в настоящем описании, обычно имеют пониженную токсичность в отношении клеток, не экспрессирующих SSTR, и по крайней мере такую же или повышенную токсичность в отношении клеток, экспрессирующих SSTR, по сравнению использованием только активного средства.

Задачей настоящего изобретения является создание улучшенных соединений, композиций и составов для временно-пространственной доставки лекарственного средства.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются способы получения улучшенных соединений, композиций и составов для временно-пространственной доставки лекарственных средств.

Кроме того, объектом настоящего являются способы введения улучшенных соединений, композиций и составов индивидуумам, при необходимости.

Определения

Термин «соединение», как используется в настоящем описании, включает все стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры и изотопы изображенных структур. В настоящей заявке соединение и конъюгат используют взаимозаменяемо. Таким образом, конъюгат, как используется в настоящем описании, также включает все стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры и изотопы изображенных структур.

Соединения, описанные в настоящем описании, могут быть асимметричными (например, имеют один или более стереоцентров). Подразумеваются все стереоизомеры, такие как энантиомеры и диастереомеры, если не указано иное. Соединения по настоящему изобретению, которые содержат несимметрично замещенные атомы углерода, могут быть выделены в оптически активной или рацемической форме. Способы получения оптически активных форм из оптически активных исходных веществ известны в данной области техники, например, путем разделения рацемических смесей или путем стереоселективного синтеза. Многие геометрические изомеры олефинов, C=N двойные связи и тому подобное, также могут присутствовать в описанных соединениях, и все такие стабильные изомеры рассматриваются в настоящем описании. Описаны цис- и транс-геометрические изомеры соединений по настоящему изобретению, и они могут быть выделены в виде смеси изомеров или в виде отдельных изомерных форм.

Соединения по настоящему изобретению также включают таутомерные формы. Таутомерные формы являются результатом замены одинарной связи на соседнюю двойную связь и сопутствующей миграции протона. Таутомерные формы включают прототропные таутомеры, которые являются изомерным состоянием протонирования, имеющим одинаковую эмпирическую формулу и суммарный заряд. Примеры прототропных таутомеров включают пары кетон-енол, пары амид-имидная кислота, пары лактам-лактим, пары амид-имидная кислота, пары енамин-имин и кольцевые формы, где протон может занимать два или более положений гетероциклической системы, например, 1Н- и 3H-имидазол, 1Н-, 2H- и 4H-1,2,4-триазол, 1Н- и 2Н-изоиндол и 1Н- и 2Н-пиразол. Таутомерные формы могут находиться в равновесии или стерически заблокированы в одной форме путем соответствующей замены.

Соединения по настоящему изобретению также включают все изотопы атомов, присутствующих в промежуточных или конечных соединениях. «Изотопы» относятся к атомам, имеющим тот же атомный номер, но отличающиеся массовые числа в результате разного числа нейтронов в ядрах. Так, например, изотопы водорода включают тритий и дейтерий.

Соединения и соли по настоящему изобретению могут быть получены в комбинации с растворителем или молекулами воды с образованием сольватов и гидратов обычными методами.

Термины «индивид» или «пациент», как используется в настоящем описании, относятся к любому организму, в который могут быть введены частицы, например, для экспериментальных, терапевтических, диагностических и/или профилактических целей. Примеры индивидов включают животных (например, млекопитающие, такие как мыши, крысы, кролики, морские свинки, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, лошади, собаки, кошки, хомяки, ламы, нечеловеческие приматы и человек).

Термины «лечение» или «профилактика», как используется в настоящем описании, могут включать профилактику заболевания, расстройства или состояния у животного, которое может быть предрасположено к заболеванию, расстройству и/или состоянию, но у которого еще не было диагностировано заболевание, расстройство или состояние; ингибирование заболевания, расстройства или состояния, например, препятствуя его прогрессу; и облегчение заболевания, расстройства или состояния, например, регрессию заболевания, расстройства и/или состояния. Лечение заболевания, расстройства или состояния может включать облегчение по крайней мере одного симптома определенного заболевания, расстройства или состояния, даже если патофизиология, лежащая в его основе, не затрагивается, например, лечение боли у индивида анальгезирующим средством, даже если такое средство не лечит причину боли.

«Мишень», как используется в настоящем описании, означает участок, с которым связывается нацеленная конструкция. Мишень может быть либо in vivo, либо in vivo. В некоторых вариантах осуществления мишенью могут быть клетки злокачественного новообразования, обнаруживаемые при лейкозах или в опухолях (например, в опухолях головного мозга, легкого (мелкоклеточный и немелкоклеточный рак), яичников, предстательной железы, молочной железы и толстой кишки, а также других карциномах и саркомах). В других вариантах осуществления изобретения мишень может относиться к молекулярной структуре, с которой связывается нацеливающая молекула или лиганд, такой как гаптен, эпитоп, рецептор, двух-цепочечный ДНК-фрагмент, углевод или фермент. Мишень может быть разновидностью ткани, например, нервной тканью, тканью кишечника, тканью поджелудочной железы, печени, почек, простаты, яичников, легких, костного мозга или тканью молочной железы.

«Клетками-мишеням», которые могут служить в качестве мишени для способа или конъюгатов или частиц, как правило, являются животные клетки, например, клетки млекопитающих. Способ по настоящему изобретению может использоваться для модификации клеточной функции живых клеток in vitro, то есть, в культуре клеток, или in vivo, когда клетки являются частью или иным образом существуют в тканях животных. Таким образом, клетки-мишени, могут включать, например, кровь, лимфатическую ткань, клетки, выстилающие пищеварительный тракт, например, ротовую полость и слизистую глотки, клетки, образующие ворсинки тонкой кишки, клетки, выстилающие толстую кишку, клетки, выстилающие дыхательную систему (носовые проходы/легкие) животного (контакт с которыми может происходить при вдыхании настоящего изобретения), клетки дермы/эпидермальные клетки, клетки влагалища и прямой кишки, клетки внутренних органов, включая клетки плаценты и так называемого гематоэнцефалического барьера и тому подобное. В общем случае, клетка-мишень экспрессирует по крайней мере один тип SSTR. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень может быть клеткой, которая экспрессирует SSTR, и являться мишенью конъюгата, описанного в настоящем описании, и находится рядом с клеткой, на которую действует высвобождаемое активное средство конъюгата. Например, мишенью может быть кровеносный сосуд, экспрессирующий SSTR, который находится в непосредственной близости к опухоли, при этом активное средство, высвобождаемое в определенном месте будет влиять на опухоль.

Термин «терапевтический эффект» является известным в данной области и относится к локальному или системному эффекту у животных, в частности у млекопитающих, и более конкретно у человека, вызываемому фармакологически активным веществом. Таким образом, термин означает любое вещество, предназначенное для применения в диагностике, лечении, уменьшении негативных последствий, лечении или профилактики заболевания, расстройства или состояния в повышении желаемого физического или психического развития и состояний у животного, например, у человека.

Термин «модуляция» является известным в данной области и относится к усилению (т.е., активации или стимуляции), уменьшению (т.е. ингибированию или супрессии) ответа, либо в комбинации, либо независимо друг от друга. Модуляцию, как правило, сравнивают с базовым или ссылочным значением, которое может быть внутренним или внешним по отношению к обрабатываемому объекту.

«Парентеральное введение», как используется в настоящем описании, означает введение любым способом, кроме через желудочно-кишечный тракт (энтеральное) или неинвазивного местного пути. Например, парентеральное введение может включать введение пациенту внутривенно, внутрикожно, внутрибрюшинно, внутриплеврально, трахеально, внутрикостно, интрацеребрально, интратекально, внутримышечно, подкожно, субконъюктивальное, путем инъекции и путем инфузии.

«Местное введение», как используется в настоящем описании, означает неинвазивное введение в кожу, отверстие или слизистую. При местном введение может быть осуществлена местная доставка, то есть, терапевтическое средство может обеспечить местный эффект в области доставки без системного воздействия или с минимальным системным воздействием. Некоторые местные составы могут оказывать системное действие, например, посредством адсорбции в кровоток индивидуума. Местное введение может включать, но ими не ограничивается, кожное и трансдермальное введение, трансбуккальное введение, интраназальное введение, интравагинальное введение, внутрипузырное введение, глазное введение и ректальное введение.

«Энтеральное введение», как используется в настоящем документе, означает введение посредством абсорбции через желудочно-кишечный тракт. Энтеральное введение может включать пероральное и сублингвальное введение, желудочное введение или ректальное введение.

«Легочное введение», как используется в настоящем документе, означает введение в легкие путем ингаляции или эндотрахеального введения. Как используется в настоящем описании термин «ингаляция» относится к поступлению воздуха в альвеолы. Поступление воздуха может происходить через рот или нос.

Термины «достаточный» и «эффективный», как используется в настоящем описании взаимозаменяемо, относится к количеству (например, масса, объем, доза, концентрация и/или период времени), необходимому для достижения одного или более желаемых результатов. Термин «терапевтически эффективное количество» означает по крайней мере минимальную концентрацию, необходимую для осуществления измеримого улучшения или профилактики по крайней мере одного симптома или конкретного состояния или расстройства, для осуществления измеримого повышения продолжительности жизни, или к улучшению качества жизни пациента в целом. Терапевтически эффективное количество, таким образом, зависит от конкретной биологически активной молекулы и конкретного состояния или расстройства, на которое направлено лечение. Терапевтически эффективные количества большого числа активных веществ, таких как антитела, известны в данной области техники. Терапевтически эффективные количества соединений и композиций, описанных в настоящем документе, например, для лечения конкретных расстройств, могут быть определены с помощью методик, которые хорошо известны специалисту в данной области, например, врачу.

Термины «биологически активное средство» и «активный агент», как используется в настоящем документе взаимозаменяемо, включают, но ими не ограничиваются, физиологически или фармакологически активные вещества, которые действуют место или системно в организме. Биологически активное средство представляет собой вещество, используемое для лечения (например, терапевтического средства), профилактики (например, профилактическое средство), диагностики (например, диагностическое средство), лечения или уменьшения отрицательных последствий заболевания или болезни, вещество, которое влияет на структуру или функцию организма, или пролекарства, которые становятся биологически активными или более активными после помещения в заранее определенную физиологическую среду.

Термин «пролекарство» относится к средству, в том числе к низкомолекулярной органической молекуле, пептиду, нуклеиновой кислоте или белку, которое преобразуется в биологически активную форму in vitro и/или in vivo. Пролекарства могут быть эффективными, поскольку в некоторых ситуациях, их можно легче вводить, чем исходное соединение (активное соединение). Например, пролекарство может быть биодоступным при пероральном введении, тогда как исходное соединение таким не является. Пролекарство также может иметь улучшенную растворимость в фармацевтических композициях по сравнению с исходным лекарственным средством. Пролекарство может также быть менее токсичным, чем исходное вещество. Пролекарство может быть преобразовано в исходное лекарственное средство различными механизмами, в том числе ферментативными процессами и метаболическим гидролизом. Harper, N.J. (1962) Drug Latentiation in Jucker, ed. Progress in Drug Research, 4:221-294; Morozowich et al. (1977) Application of Physical Organic Principles to Prodrug Design in E. B. Roche ed. Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs, APhA; Acad. Pharm. Sci.; E. B. Roche, ed. (1977) Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design, Theory and Application, APhA; H. Bundgaard, ed. (1985) Design of Prodrugs, Elsevier; Wang et al. (1999) Prodrug approaches to the improved delivery of peptide drug, Curr. Pharm. Design. 5(4):265-287; Pauletti et al. (1997) Improvement in peptide bioavailability: Peptidomimetics and Prodrug Strategies, Adv. Drug. Delivery Rev. 27:235-256; Mizen et al. (1998). The Use of Esters as Prodrugs for Oral Delivery of β-Lactam antibiotics, Pharm. Biotech. 11:345-365; Gaignault et al. (1996) Designing Prodrugs and Bioprecursors I. Carrier Prodrugs, Pract. Med. Chem. 671-696; M. Asgharnejad (2000). Improving Oral Drug Transport Via Prodrugs, in G. L. Amidon, P. I. Lee and E. M. Topp, Eds., Transport Processes in Pharmaceutical Systems, Marcell Dekker, p. 185-218; Balant et al. (1990) Prodrugs for the improvement of drug absorption via different routes of administration, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet., 15(2): 143-53; Balimane and Sinko (1999). Involvement of multiple transporters in the oral absorption of nucleoside analogues, Adv. Drug Delivery Rev., 39(1-3):183-209; Browne (1997). Fosphenytoin (Cerebyx), Clin. Neuropharmacol. 20(1): 1-12; Bundgaard (1979). Bioreversible derivatization of drugs--principle and applicability to improve the therapeutic effects of drugs, Arch. Pharm. Chemi. 86(1): 1-39; H. Bundgaard, ed. (1985) Design of Prodrugs, New York: Elsevier; Fleisher et al. (1996) Improved oral drug delivery: solubility limitations overcome by the use of prodrugs, Adv. Drug Delivery Rev. 19(2): 115-130; Fleisher et al. (1985) Design of prodrugs for improved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting, Methods Enzymol. 112: 360-81; Farquhar D, et al. (1983) Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups, J. Pharm. Sci., 72(3): 324-325; Han, H.K. et al. (2000) Targeted prodrug design to optimize drug delivery, AAPS PharmSci., 2(1): E6; Sadzuka Y. (2000) Effective prodrug liposome and conversion to active metabolite, Curr. Drug Metab., 1(1):31-48; D.M. Lambert (2000) Rationale and applications of lipids as prodrug carriers, Eur. J. Pharm. Sci., 11 Suppl. 2:S15-27; Wang, W. et al. (1999) Prodrug approaches to the improved delivery of peptide drugs. Curr. Pharm. Des., 5(4):265-87.

Термин «биосовместимый», как используется в настоящем документе, относится к веществу, которое, как и любые его метаболиты или продукты деградации, как правило, нетоксично для реципиента и не вызывает каких-либо существенных негативных последствий для реципиента. Вообще говоря, биосовместимые вещества представляют собой вещества, которые не вызывают значительного воспалительного или иммунного ответа при введении пациенту.

Термин «биодеградируемый», как используется в настоящем описании, как правило, относится к веществу, которое будет деградировать или распадаться при физиологических условиях до более мелких единиц или химических соединений, которые могут быть усвоены, устранены или экскретированы из организма индивидуума. Время деградации является функцией состава и морфологии. Время деградации может составлять от нескольких часов до нескольких недель.

Термин «фармацевтически приемлемый», как используется в настоящем документе, относится к соединениям, веществам, композициям и/или лекарственным формам, которые, в пределах медицинских показаний, пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных, не вызывая чрезмерную токсичность, раздражение, аллергическую реакцию или другие проблемы или осложнения, соизмеримые с разумным соотношением польза/риск, в соответствии с инструкциям агентств, таких the U.S. Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов). Термин «фармацевтически приемлемый носитель», как используется в настоящем описании, относится ко всем компонентам фармацевтического состава, которые облегчают доставку композиции in vivo. Фармацевтически приемлемые носители включают, но ими не ограничиваются, разбавители, консерванты, связующие вещества, смазывающие вещества, дезинтеграторы, агенты, вызывающие набухание, наполнители, стабилизаторы и их комбинации.

Термин «молекулярная масса», как используется в настоящем документе, как правило, относится к массе или средней массе вещества. Для полимера или олигомера, молекулярная масса может относиться к относительной средней длины цепи или относительной массе цепи всего полимера. На практике, молекулярная масса полимеров и олигомеров может быть оценена или охарактеризована различными способами, включая гель-проникающую хроматографию (GPC) или капиллярную вискозиметрию. Молекулярные массы GPC представлены как усредненная молекулярная масса (М_w) в отличие от среднечисловой молекулярной массы (М_n). Капиллярная вискозиметрия дает оценку молекулярной массы как удельную вязкость раствора полимера, определенную из разбавленного раствора полимера, используя определенный набор условий концентрации, температуры и растворителя.

Термин «низкомолекулярная молекула», как используется в настоящем описании, как правило, относится к органической молекуле, молекулярная масса которой меньше 2000 г/моль, меньше 1500 г/моль, меньше 1000 г/моль, меньше 800 г/моль или меньше 500 г/моль. Низкомолекулярные молекулы не являются полимерными и/или олигомерными.

Термин «гидрофильный», как используется в настоящем описании, относится к веществам, которые имеют сильные полярные группы, которые легко взаимодействуют с водой.

Термин «гидрофобный», как используется в настоящем описании, относится к веществам, которые не имеют сродства к воде; отталкивают воду и не впитывают воду, а также не растворяются в ней или в смеси с водой.

Термин «липофильный», как используется в настоящем описании, относится к соединениям, обладающим сродство к липидам.

Термин «амфифильный», как используется в настоящем описании, относится к молекуле, сочетающей гидрофильные и липофильные (гидрофобные) свойства. «Амфифильное вещество», как используется в настоящем описании, относится к веществу, содержащему гидрофобный или более гидрофобными олигомер или полимер (например, биодеградируемый олигомер или полимер) и гидрофильный или более гидрофильный олигомер или полимер.

Термин «нацеливающая молекула», как используется в настоящем описании, относится к молекуле, которая связывается или локализуется в конкретном месте. Молекула может быть, например, белком, нуклеиновой кислотой, аналогом нуклеиновой кислоты, углеводом или низкомолекулярной молекулой. Местом может быть ткань, конкретный тип клеток или субклеточный компартмент. В некоторых вариантах нацеливающая молекула может специфически связываться с выбранной молекулой.

Термин «реакционноспособная группа», как используется в настоящем описании, относится к любой химической функциональной группе, способной вступать в реакцию со второй функциональной группой с образованием ковалентной связи. Выбор реакционноспособных групп находится в пределах способности специалиста данной области. Примеры реакционноспособных групп связи могут включать первичные амины (-NH₂) и амино-реактивные связывающие группы, такие как изотиоцианаты, изоцианаты, ацилазиды, сложные эфиры NHS, сульфонилхлориды, альдегиды, глиоксали, эпоксиды, оксираны, карбонаты, арилгалогениды, имидоэфиры, карбодиимиды, ангидриды и сложные эфиры фторфенила. Большинство из этих конъюгируют с аминами либо путем ацилирования, либо путем алкилирования. Примеры реакционноспособных групп могут включать альдегиды (-COH) и альдегидные реакционноспособные группы, такие как гидразиды, алкоксиамины и первичные амины. Примеры реакционноспособных групп могут включать тиольные группы (-SH) и сульфгидрильные реактивные группы, такие как малеимиды, галогенацетилы и пиридилдисульфиды. Примерами реакционноспособных групп в реакции сочетания могут включать фото-реактивные группы, такие как арилазиды или диазирины. Реакция сочетания может включать применение катализатора, тепла, рН-буферов, света или их комбинаций.

Термин «защитная группа», как используется в настоящем описании, относится к функциональной группе, которая может быть добавлена к и/или замещена другой желаемой функциональной группой при определенных реакционных условиях и селективно удалена и/или замещена для снятия защиты или введения желаемой функциональной группы. Защитные группы известны специалисту в данной области. Подходящие защитные группы могут включать группы, которые описаны в Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, (1991). Защитные группы, чувствительные к кислотам, включают диметокситритил (DMT), трет-бутилкарбамат (tBoc) и трифторацетил (tFA). Защитные группы, чувствительные к основаниям, включают 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), изобутирил (iBu), бензоил (Bz) и фетоксиацетил (pac). Другие защитные группы включают ацетамидометил, ацетил, трет-амилоксикарбонил, бензил, бензилоксикарбонил, 2-(4-бифенилил)-2-пропилоксикарбонил, 2-бромбензилоксикарбонил, трет-бутил трет-бутилоксикарбонил, l-карбобензоксамидо-2,2,2-трифторэтил, 2,6-дихлорбензил, 2-(3,5-диметоксифенил)-2-пропилоксикарбонил, 2,4-динитрофенил, дитиасукцинил, формил, 4-метоксибензолсульфонил, 4-метоксибензил, 4-метилбензил, o-нитрофенилсульфенил, 2-фенил-2-пропилоксикарбонил, α-2,4,5-тетраметилбензилоксикарбонил, п-толуолсульфонил, ксантенил, бензиловый эфир, N-гидроксисукцинимидные эфир, п-нитробензиловый эфир, п-нитрофениловый эфир, фениловый эфир, п-нитрокарбонат, п-нитробензилкарбонат, триметилсилил и пентахлорфениловый эфир.

Термин «активированный эфир», как используется в настоящем описании, относится к алкильным эфирам карбоновых кислот, где алкил является хорошо удаляемой группой, делая карбонил чувствительным к нуклеофильной атаке молекулами, несущими аминогруппы. Активированные сложные эфиры, поэтому чувствительны к аминолизу и вступают в реакцию с аминами, образуя амиды. Активированные сложные эфиры содержат группы сложных эфиров карбоновых кислот -CO₂R, где R является уходящей группой.

Термин «алкил» относится к радикалу насыщенных алифатических групп, включая алкильные группы с прямой цепью, алкильные группы с разветвленной группой, циклоалкильные (алициклические) группы, алкил-замещенные циклоалкильные группы и циклоалкил-замещенные алкильные группы.

В некоторых вариантах осуществления алкил с прямой цепью или разветвленной цепью имеет 30 или несколько атомов углерода в своем скелете (например, C₁-C₃₀ для прямых цепей, C₃-C₃₀ для разветвленных цепей), 20 или несколько, 12 или несколько или 7 или несколько. Точно так же, в некоторых вариантах осуществления циклоалкилы имеют от 3 до 10 атомов углерода в своей кольцевой структуре, например, 5, 6 или 7 атомов углерода в кольцевой структуре. Термин «алкил» (или «низший алкил»), как используется в описании, примерах и формуле изобретения, включает как «незамещенные алкилы», так и «замещенные алкилы», последний относится к алкильным молекулам, имеющим один или несколько заместителей, заменяющих водород на одном или более атомах углерода в углеводородной цепи. Такие заместители включают, но ими не ограничиваются, галоген, гидроксил, карбонил (например, карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (например, тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкоксил, фосфорил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино, амидо, амидин, имин, циано, нитро, азидо, сульфгидрил, алкилтио, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, сульфонил, гетероциклил, аралкил или ароматическую или гетероароматическую молекулу.

Если не указано иного для числа атомов углерода, то «низший алкил», как используется в настоящем описании, означает алкильную группу, как определено выше, но имеющую от одного до десяти атомов углерода, или от одного до шести атомов углерода в своем структурном скелете. Аналогично, «низший алкенил» и «низший алкинил» имеют цепи подобной длины. В некоторых вариантах осуществления алкильные группы представляют собой низшие алкилы. В некоторых вариантах осуществления заместитель, обозначенный в описании как алкил, представляет собой низший алкил.

Как должно быть понятно специалистам в данной области, молекулы, замещенные на углеводородной цепи, сами могут быть замещенными, если это возможно. Например, заместители замещенного алкила, могут включать галоген, гидрокси, нитро, тиолы, амино, азидо, имино, амидо, фосфорил (включая фосфонат и фосфинат), сульфонил (включая сульфат, сульфонамидо, сульфамоил и сульфонат) и силильные группы, а также простые эфиры, алкилтио, карбонилы (включая кетоны, альдегиды, карбоксилаты и сложные эфиры), -CF₃, -CN и тому подобное. Циклоалкилы могут быть замещены аналогичным образом.

Термин «гетероалкил», как используется в настоящем описании, относится к прямой или разветвленной цепи, или к циклическим углерод-содержащим радикалам, или к их комбинациям, содержащим по крайней мере один гетероатом. Подходящие гетероатомы включают, но ими не ограничиваются, O, N, Si, P, Se, В и S, где атомы фосфора и серы необязательно окислены, и гетероатом азота необязательно кватернизирован. Гетероалкилы могут быть замещены, как определено выше, для алкильных групп.

Термин «алкилтио» относится к алкильной группе, как определено выше, имеющей присоединенный радикал серы. В некоторых вариантах осуществления группа «алкилтио» представляет собой один из -S-алкила, -S-алкенила и -S-алкинила. Характерные алкилтиогруппы включают метилтио и этилтио. Термин «алкилтио» также включает циклоалкильные группы, алкен и циклоалкеновые группы, а также алкиновые группы. «Арилтио» относится к арильным или гетероарильным группам. Алкилтиогруппы могут быть замещены, как определено выше для алкильных групп.

Термины «алкенил» и «алкинил», относятся к ненасыщенным алифатическим группам, аналогичным по длине и возможному замещению алкилам, описанным выше, но которые содержат, по крайней мере одну двойную или тройную связь, соответственно.

Термины «алкоксил» или «алкокси», как используется в настоящем описании, относятся к алкильной группе, как определено выше, имеющей присоединенный радикал кислород. Характерные алкоксильные группы включают метокси, этокси, пропилокси и трет-бутокси. «Эфир» представляет два углеводорода, ковалентно связанных с кислородом. Таким образом, заместитель алкила, который делает этот алкил простым эфиром, является или напоминает алкоксил, например, может быть представлен один из -O-алкила, -O-алкенила и -O-алкинила. Арокси могут быть представлены -O-арилом или O-гетероарилом, где арил и гетероарил имеют значения, указанные ниже. Группы алкокси и арокси могут быть замещены, как описано выше для алкила.

Термины «амин» и «амино» являются известными в данной области и относятся как к незамещенным, так и замещенным аминам, например, их молекула может быть представлен общей формулой:

или

где каждый R₉, R₁₀ и R'₁₀ независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, -(CH₂)_m-R₈ или R₉ и R₁₀, взятые вместе с атомом N, к которому они присоединены образуют гетероцикл, имеющий от 4 до 8 атомов в кольцевой структуре; R₈ представляет собой арил, циклоалкил, циклоалкенил, гетероцикл или полицикл; и m равно нулю или целому числу в диапазоне от 1 до 8. В некоторых вариантах осуществления, только один R₉ или R₁₀ может быть карбонилом, например, R₉, R₁₀ и азот вместе не образуют имид. В других вариантах осуществления термин «амин» не включает амиды, например, если один R₉ и R₁₀ представляет собой карбонил. В дополнительных вариантах осуществления R₉ и R₁₀ (и, необязательно, R'₁₀) независимо друг от друга представляют собой водород, алкил или циклоалкил, алкенил или циклоалкенил или алкинил. Таким образом, термин «алкиламин», как используется в настоящем описании, означает аминогруппу, как определено выше, с замещенным (как описано выше для алкила) или незамещенным алкилом, присоединенный к нему, то есть, по крайней мере, один из R₉ и R₁₀ представляет собой алкильную группу.

Термин «амидо» известен в данной области как аминозамещенный карбонил и включает молекулу, которая может быть представлена общей формулой:

где R₉ и R₁₀ определены выше.

«Арил», как используется в настоящем описании, относится к C₅-С₁₀-членных ароматическим гетероциклическим, конденсированным ароматическим, конденсированным гетероциклическим, биароматическим или бигетероциклическим кольцевым системам. В широком смысле, «арил», как используется в настоящем описании, включает 5-, 6-, 7-, 8-, 9- и 10-членные ароматические группы с одним кольцом, которые могут включать от нуля до четырех гетероатомов, например, бензол, пиррол, фуран, тиофен, имидазол, оксазол, тиазол, триазол, пиразол, пиридин, пиразин, пиридазин и пиримидин, и тому подобное. Арильные группы, имеющие гетероатомы в кольцевой структуре, также могут быть указаны как «арильные гетероциклы» или «гетероароматические». Ароматическое кольцо может быть замещено в одном или более положениях кольца одним или несколькими заместителями, включая, но ими не ограничиваясь, галоген, азид, алкил, аралкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, гидроксил, алкоксил, амино (или кватернизованный амино), нитро, сульфгидрил, имино, амидо, фосфонат, фосфинат, карбонил, карбоксил, силил, простой эфир, алкилтио, сульфонил, сульфонамидо, кетон, альдегид, сложный эфир, гетероциклил, ароматические или гетероароматические остатки, -CF₃, -CN; и их сочетания.

Термин «арил» также включает полициклические кольцевые системы, содержащие два или более циклических кольца, в которых два или более атомов углерода являются общими для двух соседних колец (то есть «конденсированные кольца»), в которых по крайней мере одно из колец является ароматическим, например, другое циклическое кольцо или кольца могут быть циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами, арилами и/или гетероциклами. Примеры гетероциклических колец включают, но ими не ограничиваются, бензмидазолил, бензофуранил, бензтиофуранил, бензотиофенил, бензоксазолили, бензоксазолинил, бензтиазолил, бензтриазолил, бензтетразолил, бензизоксазолил, бензизотиазолил, бензимидазолинил, карбазолил, 4aH карбазолил, карболинил, хроманил, хроменил, циннолинил, декагидрохинолинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, дигидрофуро[2,3b]тетрагидрофуран, фуранил, фуразанил, имидазолидин, имидазолинил, имидазолил, 1H-индазолил, индоленил, индoлинил, индолизинил, индолил, 3H-индолил, изатиноил, изобензофуранил, изохроманил, изоиндазолил, изоиндолинил, изоиндолил, изохинолинил, изотиазолил, изоксазолил, метилендиоксифенил, морфолинил, нафтиридинил, октагидроизохинолинил, оксадиазолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, оксазолидинил, оксазолил, оксиндолил, пиримидинил, фенантридинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, феноксатинил, феноксазинил, фталазинил, пиперазинил, пиперидинил, пиперидонил, 4-пиперидонил, пиперонил, птеридинил, пуринил, пиранил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолил, пиридaзинил, пиридооксазол, пиридоимидазол, пиридотиазол, пиридинил, пиридил, пиримидинил, пирролидинил, пирролинил, 2H-пирролил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, 4H-хинолизинил, хиноксалинил, хинуклидинил, тетргидрофуранил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидрохинолинил, тетразолил, 6H-1,2,5-тиадиазинил, 1,2,3-тиадиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, 1,2,5-тиадиазолил, 1,3,4-тиадиазолил, тиантренил, тиазолил, тиенил, тиенотиазолил, тиеноксазолил, тиеноимидазолил, тиофенил и ксантенил. Одно или более из колец может быть замещено как определено выше для «арила».

Термин «аралкил», как используется в настоящем описании, относится к алкильной группе, замещенную арильной группой (например, ароматическая или гетероароматическая группа).

Термин «карбоцикл», как используется в настоящем описании, относится к ароматическому или неароматическому кольцу, в котором каждый атом кольца представляет собой углерод.

«Гетероцикл» или «гетероциклический», как используется в настоящем описании, относится к циклическому радикалу, присоединенному через кольцевой атом углерода или азота моноциклического или бициклического кольца, содержащего 3-10 атомов в кольце, например, 5-6 кольцевых атомов, состоящих углерода и от одного до четырех гетероатомов, каждый из которых выбран из группы, состоящей из непероксидного кислорода, серы и N (Y), где Y отсутствует или представляет собой Н, O, (C₁-С₁₀)алкил, фенил или бензил, и, необязательно, содержащий 1-3 двойные связи и необязательно замещенный одним или несколькими заместителями. Примеры гетероциклических колец включают, но ими не ограничиваются, бензимидазолил, бензофуранил, бензотиофуранил, бензотиофенил, бензоксазолил, бензоксазолинил, бензтиазолил, бензтриазолил, бензтетразолил, бензизоксазолил, бензизотиазолил, бензимидазолинил, карбазолил, 4aH-карбазолил, карболинил, хроманил, хроменил, циннолинил, декагидрохинолинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, дигидрофуро[2,3-b]тетрагидрофуран, фуранил, фуразанил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, 1H-индазолил, индоленил, индолинил, индолизинил, индолил, 3H-индолил, изатоиноил, изобензофуранил, изохроманил, изоиндазолил, изоиндолинил, изоиндолил, изохинолинил, изотиазолил, изоксазолил, метилeендиоксифенил, морфолинил, нафтиридинил, октагидроизохинолинил, оксадиазолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, оксазолидинил, оксазолил, оксепанил, оксетанил, оксиндолил, пиримидинил, фенантридинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, феноксатинил, феноксазинил, фталазинил, пиперазинил, пиперидинил, пиперидонил, 4-пиперидонил, пиперонил, птеридинил, пуринил, пиранил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолили, пиридaзинил, пиридооксазол, пиридоимидазол, пиридотиазол, пиридинил, пиридил, пиримидинил, пирролидинил, пирролинил, 2H-пирролил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, 4H-хинолизинил, хиноксалинил, хинуклидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетразолил, 6H-1,2,5-тиадиазинил, 1,2,3-тиадиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, 1,2,5-тиадиазолил, 1,3,4-тиадиазолил, тиантренил, тиазолил, тиенил, тиенотиазолил, тиенооксазолил, тиеноимидазолил, тиофенил и ксантенил. Гетероциклические группы могут быть необязательно замещены одним или несколькими заместителями в одном или более положениях, как определено выше для алкила и арила, например, галоген, алкил, аралкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, гидроксил, амино, нитро, сульфгидрил, имино, амидо, фосфат, фосфонат, фосфинат, карбонил, карбоксил, силил, простой эфир, алкилтио, сульфонил, кетон, альдегид, сложный эфир, гетероциклил, ароматический или гетероароматический остаток, -CF3 и -CN.

Термин «карбонил» является известным в данной области и включает такие молекулы, которые могут быть представлены общей формулой:

или

где Х представляет собой связь или кислород, или серу, а R₁₁ представляет собой водород, алкил, циклоалкил, алкенил, циклоалкенил или алкинил, R'₁₁ представляет собой водород, алкил, циклоалкил, алкенил, циклоалкенил или алкинил. Если Х представляет собой кислород, а R₁₁ или R'₁₁ не являются водородом, то формула представляет «сложный эфир». Если Х представляет собой кислород, а R₁₁ такой, как определено выше, то молекула называется в настоящем описании карбоксильной группой, и в частности, если R₁₁ представляет собой водород, то формула представляет «карбоновую кислоту». Если Х представляет собой кислород, а R'₁₁ представляет собой водород, то формула представляет «формиат». В общем случае, когда атом кислорода в вышеуказанной формуле заменен на серу, то формула представляет «тиокарбонильную» группу. Если X представляет собой серу, а R₁₁ или R'₁₁ не является водородом, то формула представляет «тиоэфир». Если X представляет собой серу, а R₁₁ представляет собой водород, то формула представляет «тиокарбоновую кислоту.» Если X представляет собой серу, а R'₁₁ представляет собой водород, то формула представляет «тиоформиат.» С другой стороны, если Х представляет собой связь, а R₁₁ не является водородом, то вышеприведенная формула представляет «кетонную» группу. Если X представляет собой связь, а R₁₁ представляет собой водород, то вышеприведенная формула представляет «альдегидную» группу.

Термин «моноэфир», как используется в настоящем описании, относится к аналогу дикарбоновой кислоты, в котором одна карбоновая кислота функционализирована как сложный эфир, а другая карбоновая кислота представляет собой свободную карбоновую кислоту или соль карбоновой кислоты. Примеры моноэфиров включают, но ими не ограничиваются, моноэфиры янтарной кислоты, глутаровой кислоты, адипиновой кислоты, пробковой кислоты, себациновой кислоты, азелаиновой кислоты, щавелевой и малеиновой кислоты.

Термин «гетероатом», как используется в настоящем описании, означает атом любого элемента, отличного от углерода или водорода. Примерами гетероатомов являются бор, азот, кислород, фосфор, сера и селен. Другие используемые гетероатомы включают кремний и мышьяк.

Как используется в настоящем описании, термин «нитро» означает -NO₂; термин «галоген» обозначает -F, -Cl, -Br или -I; термин «сульфгидрил» означает -SH; термин «гидроксил» означает -ОН; и термин «сульфонил» означает -SO₂-.

Термин «замещенный», как используется в настоящем описании, относится ко всем допустимым заместителям соединений, описанных в настоящем документе. В самом широком смысле допустимые заместители включают ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические заместители органических соединений. Характерные заместители включают, но ими не ограничиваются, галогены, гидроксильные группы или любые другие органические группы, содержащие любое число атомов углерода, например, 1-14 атомов углерода, и, необязательно, включают один или более гетероатомов, таких как кислород, сера или азот, в линейных, разветвленных или циклических структурных форматах. Характерные заместители включают алкильную, замещенную алкильную, алкенильную, замещенную алкенильную, алкинильную, замещенную алкинильную, фенильную, замещенную фенильную, арильную, замещенную арильную, гетероарильную, замещенную гетероарильную группы, галоген, гидроксильную группу, алкокси, замещенную алкокси, фенокси, замещенную фенокси, арокси, замещенную арокси, алкилтио, замещенную алкилтио, фенилтио, замещенную фенилтио, арилтио, замещенную арилтио, циано, изоциано, замещенную изоцианогруппу, карбонильную, замещенную карбонильную, карбоксильную, замещенную карбоксильную группу, амино, замещенную амино, амидо, замещенную амидогруппу, сульфонильную, замещенную сульфонильную группу, сульфокислоту, фосфорильную, замещенную фосфорильную, фосфонильную, замещенную фосфонильную, полиарильную, замещенную полиарильную, C₃-С₂₀ циклическую, замещенную C₃-С₂₀ циклическую, гетероциклическую, замещенную гетероциклическую группу, аминокислотные, пептидные и полипептидные группы.

Гетероатомы, такие как азот могут иметь водородные заместители и/или любые допустимые заместители органических соединений, описанных в настоящем документе, которые соответствуют валентности гетероатомов. Понятно, что «замена» или «замещенный» включает безусловное ограничение, заключающееся в том, что такая замена находится в соответствии с разрешенной валентностью замещенного атома и заместителя, и что замещение приводит к стабильному соединению, то есть, соединение, которое самопроизвольно не трансформируется, например, не перегруппируется, не циклизуется или не разрушается.

В широком смысле допустимые заместители включают ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические заместители органических соединений. Характерные заместители включают, например, заместители, которые описаны в настоящем документе. Допустимый заместитель может быть единственными, или их может быть несколько, и могут быть одинаковыми или различными для соответствующих органических соединений. Гетероатомы, такие как азот могут иметь водородные заместители и/или любые допустимые заместители органических соединений, описанных в настоящем документе, которые соответствуют валентности гетероатомов.

В различных вариантах осуществления, заместитель выбран из алкокси, арилокси, алкила, алкенила, алкинила, амида, амино, арила, арилалкила, карбамата, карбокси, циано, циклоалкила, сложного эфира, простого эфира, формила, галогена, галогеналкила, гетероарила, гетероциклила, гидроксила, кетона, нитро, фосфата, сульфида, сульфинила, сульфонила, сульфокислоты, сульфонамида и тиокетона, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими подходящими заместителями. В некоторых вариантах осуществления, заместитель выбран из алкокси, арилокси, алкила, алкенила, алкинила, амида, амино, арила, арилалкила, карбамата, карбокси, циклоалкила, сложного эфира, простого эфира, формила, галогеналкила, гетероарила, гетероциклила, кетона, фосфата, сульфида, сульфинила, сульфонила, сульфокислоты, сульфонамида и тиокетона, где каждый из алкокси, арилокси, алкила, алкенила, алкинила, амида, амино, арила, арилалкила, карбамата, карбокси, циклоалкила, сложного эфира, простого эфира, формила, галогеналкила, гетероарила, гетероциклила, кетона, фосфата, сульфида, сульфинила, сульфонила, сульфокислоты, сульфонамида и тиокетона, которые могут быть дополнительно замещены одним или несколькими подходящими заместителями.

Примеры заместителей включают, но ими не ограничиваются, галоген, азид, алкил, аралкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, гидроксил, алкоксил, амино, нитро, сульфгидрил, имино, амидо, фосфонат, фосфинат, карбонил, карбоксил, силил, простой эфир, алкилтио, сульфонил, сульфонамидо, кетон, альдегид, тиокетон, сложный эфир, гетероциклил, -CN, арил, арилокси, пергалогеналкокси, аралкокси, гетероарил, гетероарилокси, гетероарилалкил, гетероаралкокси, азидо, алкилтио, оксо, ацилалкил, карбоксиэфиры, карбоксамидо, ацилокси, аминоалкил, алкиламиноарил, алкиларил, алкиламиноалкил, алкоксиарил, ариламино, аралкиламино, алкилсульфонил, карбоксамидоалкиларил, карбоксамидоарил, гидроксиалкил, галогеналкил, алкиламиноалкилкарбокси, аминокарбоксамидоалкил, циано, алкоксиалкил, пергалогеналкил, арилалкилоксиалкил, и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления, заместитель выбран из циано, галогена, гидроксила и нитро.

Термин «сополимер», как используется в настоящем описании, как правило, относится к единому полимерному веществу, которое состоит из двух или более различных мономеров. Сополимер может быть любой формы, например, случайным, блок или привитым. Сополимеры могут иметь любую конечную группу, в том числе концевую реакционноспособную группу или кислотную концевую группу.

Термин «средний размер частиц», как используется в настоящем описании, как правило, относится к статистически среднему размеру (диаметру) частиц в композиции. Диаметр, по существу, сферической частицы может быть отнесен к физическому или гидродинамическому диаметру. Диаметр несферической частицы может относиться к гидродинамическому диаметру. Как используется в настоящем описании, диаметр несферической частицы может относиться к величине линейного расстояния между двумя точками на поверхности частицы. Средний размер частиц может быть измерен с использованием способов, известных в данной области, таких как динамическое рассеяние света. Можно сказать, что две популяции имеют «по существу эквивалентный средний размер частиц», если статистический средний размер частиц первой популяции частиц находится в пределах 20% от статистического среднего размера частиц второй популяции частиц; например, в пределах 15% или в пределах 10%.

Термины «монодисперсная» и «равномерное распределение размера», как используется в настоящем описании взаимозаменяемо, описывают популяцию частиц, микрочастиц или наночастиц, имеющих один и то же или почти одинаковый размер. Как используется в настоящем описании монодисперсное распределение относится к распределению частиц, в которых 90% распределения находится в пределах 5% от среднего размера частиц.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» в общем случае относятся к полимеру из аминокислотных остатков. Как используется в настоящем описании, термин также относится к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислот являются химическими аналогами или модифицированными производными соответствующих природных аминокислот или неприродных аминокислот. Термин «белок», как в целом используется в настоящем описании, относится к полимеру из аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями с образованием полипептида, для которых длина цепи является достаточной для получения третичной и/или четвертичной структуры. Термин «белок» исключает небольшие пептиды по определению, небольшие пептиды, не имеющие структуру, требуемую для высшего порядка, необходимого для того, чтобы рассматривать их как белок.

Термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» используются взаимозаменяемо для обозначения дезоксирибонуклеотидного или рибонуклеотидного полимера, линейной или круговой конформации, а также находящегося либо в одно-, либо в двух-цепочечной форме. Эти термины не следует рассматривать как ограничивающие длину полимера. Термины могут включать известные аналоги природных нуклеотидов, а также нуклеотиды, которые модифицированы в основной, сахарной и/или фосфатных частях (например, фосфортиоатные скелеты). В общем, и если не указано иного, то аналог конкретного нуклеотида имеет ту же специфичность образования пар; то есть, аналог А будет образовывать пару с Т. Термин «нуклеиновая кислота» является термином, который относится к нити по крайней мере из двух мономерных звеньев «основание-сахар-фосфат». Нуклеотиды являются мономерными звеньями полимеров нуклеиновых кислот. Термин включает дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК) в форме информационной РНК, антисмысловой, плазмидной ДНК, частей плазмидной ДНК или генетического материала, полученного из вируса. Антисмысловая нуклеиновая кислота представляет собой полинуклеотид, который влияет на экспрессию ДНК и/или РНК-последовательности. Термин «нуклеиновые кислоты» относится к цепочке из по крайней мере двух комбинаций «основание-сахар-фосфат». Природные нуклеиновые кислоты имеют фосфатный остов. Искусственные нуклеиновые кислоты могут содержать другие типы остовов, но содержат те же основания, что и природные нуклеиновые кислоты. Термин также включает PNA (пептид-нуклеиновые кислоты), фосфоротиоаты и другие варианты фосфатного основа природных нуклеиновых кислот.

«Функциональный фрагмент» белка, полипептида или нуклеиновой кислоты представляет собой белок, полипептид или нуклеиновую кислоту, последовательность которых не идентична полноразмерному белку, полипептиду или нуклеиновой кислоте, при этом сохраняя по крайней мере одну функцию в качестве полноразмерного белка, полипептида или нуклеиновой кислоты. Функциональный фрагмент может обладать большим, меньшим или таким же количеством остатков, как и соответствующая природная молекула, и/или может содержать одну или несколько аминокислот или нуклеотидных замен. Способы определения функции нуклеиновой кислоты (например, кодирующей функции, способности к гибридизации с другой нуклеиновой кислоты) хорошо известны в данной области. Аналогично, способы определения функции белка хорошо известны. Например, связывание ДНК-связывающая функция полипептида, может быть определена, например, путем связывания фильтра, сдвига электрофоретической подвижности или иммунопреципитации. Расщепление ДНК может быть оценено с помощью гель-электрофореза. Способность белка взаимодействовать с другим белком может быть определена, например, путем со-иммунопреципитации, дигибридных анализов или комплементации, например, генетических или биохимических. Смотрите, например, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; патент США № 5585245 и PCT WO98/44350.

Как используется в настоящем описании, термин «линкер» относится к углеродной цепь, которая может содержать гетероатомы (например, азот, кислород, сера и тому подобное) и длина которых может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 атомов. Линкеры могут быть замещены различными заместителями, включая, но ими не ограничиваясь, атомы водорода, алкильную, алкенильную, алкинильную, амино, алкиламино, диалкиламино, триалкиламино, гидроксильную группу, алкоксигруппу, группу галогена, арильную, гетероциклическую группу, ароматическую гетероциклическую группу, циано, амидную, карбамоильную группу карбоновой кислоты, группу сложного эфира, группу тиоэфир, алкилтиоэфира, тиола и уреидо. Специалистам в данной области должно быть понятно, что каждая из этих групп может, в свою очередь быть замещена. Примеры линкеров включают, но ими не ограничиваются, рН-чувствительные линкеры, расщепляемые протеазами пептидные линкеры, чувствительные к нуклеазе линкеры из нуклеиновых кислот, чувствительные к липазе липидные линкеры, чувствительные к гликозидазе углеводные линкеры, чувствительные к гипоксии линкеры, фото- расщепляемые линкеры, термолабильные линкеры, расщепляемые ферментами линкеры (например, линкер, расщепляемый эстеразой), чувствительные к ультразвуку линкеры и линкеры, расщепляемые рентгеновскими лучами.

Термин «фармацевтически приемлемый противоион» относится к фармацевтически приемлемому аниону или катиону. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый противоион является фармацевтически приемлемым ионом. Например, фармацевтически приемлемый противоион выбран из цитрата, малата, ацетата, оксалата, хлорида, бромида, иодида, нитрата, сульфата, бисульфата, фосфата, кислого фосфата, изоникотината, ацетата, лактата, салицилата, тартрата, олеата, танната, пантотената, битартрата, аскорбата, сукцината, малеата, гентизината, фумарата, глюконата, глюкароната, сахарата, формиата, бензоата, глутамата, метансульфоната, этансульфоната, бензолсульфоната, п-толуолсульфоната и памоата (то есть, 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)). В некоторых вариантах осуществления, фармацевтически приемлемый противоион выбран из хлорида, бромида, иодида, нитрата, сульфата, бисульфата, фосфата, кислого фосфата, цитрата, малата, ацетата, оксалата, ацетата и лактата. В конкретных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый противоион выбран из хлорида, бромида, йодида, нитрата, сульфата, бисульфата и фосфата.

Термин «фармацевтически приемлемая соль(и)» относится к солям кислотных или основных групп, которые могут присутствовать в соединениях, используемых в композициях по настоящему изобретению. Соединения, включенные в композиции по настоящему изобретению, которые являются основными по своей природе, способны образовывать множество солей с различными неорганическими и органическими кислотами. Кислоты, которые могут быть использованы для получения фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей таких основных соединений, представляет собой кислоты, которые образуют нетоксичные кислотно-аддитивные соли, то есть соли, содержащие фармакологически приемлемые анионы, в том числе, но ими не ограничиваясь, сульфат, цитрат, малат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, ацетат, лактат, салицилат, цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкаронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат (то есть, 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)). Соединения, включенные в композиции по настоящему изобретению, которые включают аминогруппу, могут образовывать фармацевтически приемлемые соли с различными аминокислотами, в дополнение к кислотам, указанным выше. Соединения, включенные в композиции по настоящему изобретению, которые являются кислыми по своей природе, способны образовывать основные соли с различными фармакологически приемлемыми катионами. Примеры таких солей включают соли щелочных металлов или соли щелочноземельных металлов и, в частности, соли кальция, магния, натрия, лития, цинка, калия и железа.

Если соединения, описанные в настоящем документе, получают в виде кислотно-аддитивной соли, то свободное основание может быть получено путем подщелачивания раствора кислой соли. И наоборот, если продукт является свободным основанием, то аддитивная соль, в частности фармацевтически приемлемая аддитивная соль, может быть получена путем растворения свободного основания в подходящем органическом растворителе и обработкой раствора кислотой в соответствии с обычными методиками получения кислотно-аддитивных солей из основных соединений. Специалистам в данной области будет понятно, что различные методы синтеза могут быть использованы для получения нетоксичных фармацевтически приемлемых аддитивных солей.

Фармацевтически приемлемая соль может быть получена из кислоты, выбранной из 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты, 2,2-дихлоруксусной кислоты, 2-гидроксиэтансульфоновой кислоты, 2-оксоглутаровой кислоты, 4-ацетамидобензойной кислоты, 4-аминосалициловой кислоты, уксусной кислоты, адипиновой кислоты, аскорбиновой кислоты, аспарагиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, камфарной кислоты, камфор-10-сульфокислоты, капроновой кислоты (декановая кислота), капроновой кислоты (гексановая кислота), каприловой кислоты (октановая кислота), угольной кислоты, коричной кислоты, лимонной кислоты, цикламиновой кислоты, дедецилсернокислой кислоты, этан-1,2-дисульфокислоты, этансульфоновой кислоты, муравьиной кислоты, фумаровой кислоты, галактаровой кислоты, гентизиновая кислота, глюкогептоновой кислоты, глюконовой кислоты, глюкуроновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутаровой кислоты, глицерофосфорной кислоты, гликолевой кислоты, гиппуровой кислоты, бромистоводородной кислоты, хлористоводородной кислоты, изэтионовой, изомасляной кислоты, молочной кислоты, лактобионовой кислоты, лауриновой кислоты, малеиновой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, муциновой кислоты, нафталин-1,5-дисульфокислоты, нафталин-2-сульфоновой кислоты, никотиновой кислоты, азотной кислоты, олеиновой кислоты, щавелевой кислоты, пальмитиновой кислоты, памовой кислоты, пантотеновой, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, пироглутаминовой кислоты, салициловой кислоты, себациновой кислоты, стеариновой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, винной кислоты, тиоциановой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной и ундециловой кислоты.

Термин «биодоступной» является признанным в данной области и относится к одной из форм объекта изобретения, которая для этого подходит, или к части введенного для поглощения количества, включенных или иным образом физиологически доступных для индивида или пациента, которому их вводят.

II. Конъюгаты

Конъюгаты включают активное средство или его пролекарство, присоединенные к нацеливающей молекуле, например, молекуле, которая может связываться с SSTR, с помощью линкера. Конъюгаты могут быть конъюгатом одного активного средства и одной нацеливающей молекулы, например, конъюгатом, имеющим структуру XYZ, где Х означает нацеливающую молекулу, Y представляет собой линкер, а Z представляет собой активное средство.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит более одной нацеливающей молекулы, более одного линкера, более одного активного средства, или любую их комбинацию. Конъюгат может иметь любое количество нацеливающих молекул, линкеров и активных средств. Конъюгат может иметь структуру XYZYX, (XY)_N-Z, Х-(YZ)_N, XYZ_N(XYZ)_N(XYZY)_N-Z, где Х представляет собой нацеливающую молекулу, Y представляет собой линкер, Z является активным средством, а n равен целому числу от 1 до 50, от 2 до 20, например, от 1 до 5. В каждом случае Х, Y и Z могут быть одинаковыми или различными, например, конъюгат может содержать более одного типа нацеливающей молекулы, более одного типа линкера и/или более одного типа активного средства.

Конъюгат может содержать более одной нацеливающей молекулы, присоединенной к одному активному средству. Например, конъюгат может содержать активное средство вместе с несколькими нацеливающими молекулами, каждая из которых прикреплена с помощью отличающегося линкера. Конъюгат может иметь структуру XYZYX, где каждый Х представляет собой нацеливающую молекулу, которая может быть одинаковой или различной, каждый Y представляет собой линкер, который может быть одинаковым или различным, а Z представляет собой активное средство.

Конъюгат может содержать более одного активного средства, прикрепленного к одной нацеливающей молекуле. Например, конъюгат может включать нацеливающую молекулу вместе с несколькими активными средствами, каждый из которых прикреплен с помощью отличающегося линкера. Конъюгат может иметь структуру ZYXYZ, где Х представляет собой нацеливающую молекулу, каждый Y представляет собой линкер, который может быть одинаковым или различным, и каждый из Z представляет собой активное средство, которое может быть одинаковым или различным.

Биологически активные средства

Конъюгат, как описано в настоящем документе, содержит по крайней мере одно активное средство (первое активное средство). Конъюгат может содержать более одного активного средства, которые могут быть одинаковыми или отличаться от первого активного средства. Активное средство может быть терапевтическим, профилактики, диагностики или пищевым средством. Множество активных средств известны в данной области и могут быть использованы в конъюгатах, описанных в настоящем документе. Активное средство может быть белком или пептидом, низкомолекулярной молекулой, нуклеиновой кислотой или молекулой нуклеиновой кислоты, липидом, сахаром, гликолипидом, гликопротеином, липопротеином, или их комбинациями. В некоторых вариантах осуществления активное средство представляет собой антиген, адъювант, радиоактивный, визуализирующий агент (например, флуоресцентная молекула) или полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления активное средство представляет собой металлорганическое соединение.

Противораковые средства

Активное средство может представлять собой противораковое терапевтическое средство. Противораковые терапевтические средства включают, например, агонисты рецепторов смерти, такие как ФНО-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL) или лиганд FAS, или любой лиганд или антитело, которые связывают или активируют рецептор смерти или иным образом вызывают апоптоз. Подходящие рецепторы смерти включают, но ими не ограничиваются, TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, LTβR и их комбинации.

В качестве активных средств могут быть использованы противораковые терапевтические средства, такие как химиотерапевтические средства, цитокины, хемокины и средства лучевой терапии. Химиотерапевтические средства включают, например, алкилирующие агенты, антиметаболиты, антрациклины, растительные алкалоиды, ингибиторы топоизомеразы, а также другие противоопухолевые средства. Такие средства, как правило, влияют на деление клеток или на синтез и функции ДНК. Дополнительные примеры терапевтических средств, которые могут быть использованы в качестве активных средств, включают моноклональные антитела и ингибиторы тирозинкиназы, например, иматиниб мезилат, которые непосредственно нацелены на молекулярную аномальность при некоторых видах злокачественного новообразования (например, хронический миелолейкоз, желудочно-кишечные стромальные опухоли).

Химиотерапевтические средства включают, но ими не ограничиваются, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, мехлорэтамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин, таксол и его производные, иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид, этопозид фосфат, тенипозил, эпиподофиллотоксины, трастузумаб, цетуксимаб и ритуксимаб, бевацизумаб, а также их комбинации. Любое из указанных выше средств может быть использовано в качестве активного средства в конъюгате.

В некоторых вариантах осуществления активное средство может представлять собой 20-эпи-1,25 дигидроксивитамин D3, 4-ипомеанол, 5-этинилурацил, 9-дигидротаксол, абиратерон, ацивицин, акларубицин, акодазол гидрохлорид, акронин, ацилфулвен, адеципенол, адоцелезин, алдеслейкин, антагонисты ALL-TK, альтретамин, амбамустин, амбомицин, аметантрон ацетат, амидокс, амифостин, аминоглютетимид, аминолевулиновую кислоту, амрубицин, амсакрин, анагрелид, анастрозол, андрографолид, ингибиторы ангиогенеза, антагонист D, антагонист G, антареликс, антрамицин, антидорсализирующий морфогенетический белок-1, антиэстроген, антинеопластон, антисмысловые олигонуклеотиды, афидиколин глицинат, модуляторы гена апоптоза, регуляторы апоптоза, апуриновую кислоту, ara-CDP-DL-PTBA, аргинин деаминаза, аспарагиназу, асперлин, азулакрин, атаместан, атримустин, аксинастатин 1, аксинастатин 2, аксинастатин 3, азацитидин, азасетрон, азатоксин, азатирозин, азетепу, азотомицин, производные баккатина III, баланол, батимастат, бензохлорины, бензодепу, бензоилстауроспорин, производные бета лактама, бета-алетин, бетакламицин В, бетулиновую кислоту, ингибитор BFGF, бикалютамид, бизантрин, бизантрин гидрохлорид, бисазиридинспермин, биснафид, биснафид димезилат, бистратен А, бизелесин, блеомицин, блеомицин сульфат, BRC/ABL антагонисты, брефлат, брехинар натрий, бропиримин, будотитан, бусульфат, бутионин сульфоксимин, кабазитаксел, кактиномицил, кальципотриол, калфостин С, калюстерон, камптотецин, производные камптотецина, канарипокс IL-2, капецитабин, карацемид, карбетаймер, карбоплатин, карбоксамид-амино-триазол, карбоксиамидотриазол, CaRest M3, кармустин, CARN 700, ингибитор, полученный из хряща, карубицин гидрохлорид, карзелесин, ингибиторы казеин киназы, кастаноспермин цекропин В, цедефингол, цетрореликс, хлорамбуцил, хлорины, хлорхиноксалин сульфонамид, цикапрост, циролемицин, цисплатин, цис-порфирин, кладрибин, аналоги кломифена, клотримазол, коллисмицин А, коллисмицин В, комбретастатин А4, аналог комбретастатина, конагенин, крамбесцидин 816, криснатол, криснатол мезилат, криптофицин 8, производные криптофицина А, курацин А, циклопентантрахиноны, циклофосфамид, циклоплатам, ципемицин, цитарабин, цитарабин окфосфат, цитолитический фактор, цитостатин, дакарбазин, дакликсимаб, дактиномицин, даунорубицин гидрохлорид, децитабин, дегидродидемнин В, деслорелин, дексифосфамид, дексормаплатин, дексразоксан, дексверапамил, дезагуанин, дезагуанин мезилат, диазихон, дидемнин В, дидокс, диэтилнорспермин, дигидро-5-азацитидин, диоксамин, дифенил спиромустин, доцетаксел, докозанол, доласетрон, доксифлуридин, доксорубицин, доксорубицин гидрохлорид, дролоксифен, дролоксифен цитрат, дромостанолон пропионат, дронабинол, диазомицин, дуокармицин SA, эбселен, экомустин, эдатрексат, эделфосин, эдреколомаб, эфлорнитин, эфлорнитин гидрохлорид, элемен, элсамитруцин, эмитефур, энлоплантин, энпромат, эпипропидин, эпирубицин, эпирубицин гидрохлорид, эпристерид, эрбузолон, генотерапевтическую векторную систему на основе эритроцитов, эзорубицин гидрохлорид, эстрамустин, аналог эстрамустина, эстрамустин натрия фостат, агонисты эстрогена, антагонисты эстрогена, этанидазол, этопозид, этопозид фосфат, этоприн, экземестан, фадрозол, фадрозол гидрохлорид, фазарабин, фенретинид, филграстим, финастерид, флавопиридол, флезеластин, флоксуридин, флуастерон, флударабин, флударабин фосфат, фтордауноруницин гидрохлорид, фторурацил, фторцитабин, форфенимекс, форместан, фосквидон, фостриецин, фостриецин натрия, фотемустин, гадолиний тексафирин, галлия нитрат, галоцитабин, ганиреликс, ингибиторы желатиназы, гемцитабин, гемцитабин гидрохлорид, ингибиторы глютатиона, гепсульфам, герегулин, гексаметилен бисацетамид, гидроксимочевину, гиперицин, ибандроновую кислоту, идарубицин, идарубицин гидрохлорид, идоксифен, идрамантон, ифосфамид, илмофосин, иломастат, имидазоакридоны, имихимод, иммуностимулирующие пептиды, ингибитор рецептора инсулиноподобного фактора роста 1, агонисты интерферона, интерферон альфа-2A, интерферон альфа-2B, интерферон альфа-N1, интерферон альфа-N3, интерферон бета-IA, интерферон гамма-IB, интерфероны, интерлейкины, иобенгуан, йододоксорубицин, ипроплатин, иринотекан, иринотекан гидрохлорид, ироплакт, ирсогладин, изобенгазол, изогомогаликондрин В, итасетрон, ясплакинолид, кахалалид F, ламелларин-N триацетат, ланреотид, ларотаксел, ланреотид ацетат, лейнамицин, ленограстим, лентинан сульфат, лептолстатин, летрозол, лейкоз ингибирующий фактор, лейкоцитарный альфа интерферон, лейпролид ацетат, лейпролид/эстроген/прогестерон, лейпрорелин, левамизол, лиарозол, лиарозол гидрохлорид, аналог линейного полиамина, липофильный дисахаридный пептид, липофильные соединения платины, лиссоклинамид 7, лобаплатин, ломбрицин, лометрексол, лометрексол натрий, ломустин, лонидамин, лозоксантрон, лозоксантрон гидрохлорид, ловастатин, локсорибин, луртотекан, лутетий тексафирин, лизофиллин, лизирующие пептиды, майтанзин, манностатин А, маримастат, мазопрокол, маспин, ингибиторы матрилизина, матричные ингибиторы металлопротеиназы, майтанзин, майтанзиноид, мертанзин (DM1), мехлорэтамин гидрохлорид, мегестрол ацетат, меленгестрол ацетат, мелфалан, меногарил, мербарон, меркаптопурин, метерелин, метиониназа, метотрексат, метотрексат натрий, метоклопрамид, метоприн, метуредепу, ингибиторы протеинкиназы С микроводорослей, ингибитор MIF, мифепристон, милтефозин, миримостим, несогласованную двухцепочечную РНК, митиндомид, митокарцин, митокромин, митогиллин, митогуазон, митолактол, митомалцин, митомицин, аналоги митомицина, митонафид, митоспер, митотан, фактор роста митотоксин фибробласта-сапорин, митоксантрон, митоксантрон гидрохлорид, мофаротен, молграмостим, моноклональное антитело, человеческий хорионический гонадотропин, монофосфорил липид А/клеточная стенка миобактерии sk, мопидамол, ингибитор гена резистентности к нескольким лекарственным средствам, терапию на основе суппрессора множественных опухолей 1, горчичное противораковое средство, микапероксид В, экстракт клеточных стенок микобактерий, микофеноловую кислоту, мириапорон, N-ацетилдиналин, нафарелин, нагрестип, налоксон/пентазоцин, напавин, нафтерпин, нартограстим, недаплатин, неморубицин, неридроновую кислоту, нейтральную эндопептидазу, нилутамид, низамицин, модуляторы оксида азота, нитроксидный антиоксидант, нитруллин, нокодазол, ногаламицин, N-замещенные бензамиды, O6-бензилгуанин, октреотид, окиценон, олигонуклеотиды, онапристон, ондансетрон, орацин, пероральный индуктор цитокина, ормаплатин, осатерон, оксалиплатин, оксавуномицин, оксизуран, паклитаксел, аналоги паклитаксела, производные паклитаксела, палауамин, пальмитоилризоксин, памидроновую кислоту, панакситриол, паномифен, парабактин, пазеллиптин, пегаспаргаза, пелдесин, пелиомицин, пентамустин, пентосан полисульфат натрий, пентостатин, пентрозол, пепломицин сульфат, перфлуброн, перфосфамид, периллиловый спирт, феназиномицин, фенилацетат, ингибиторы фосфатазы, пицибанил, пилокарпин гидрохлорид, пипоброман, пипосульфан, пирарубицин, пиритрексим, пироксантрон гидрохлорид, плацетин А, плацетин В, ингибитор активатора плазминогена, платиновые(IV) комплексы, соединения платины, платина-триаминовый комплекс, пликамицин, пломестан, порфимер натрий, порфиромицин, преднимустин, прокарбазин гидрохлорид, пропил бис-акридон, простагландин J2, антиандроген при карциноме простаты, ингибиторы протеазомы, иммуномодулятор на основе белка А, ингибитор протеинкиназы С, ингибиторы протеинтирозинфосфатазы, ингибиторы пурин нуклеозид фосфорилазы, пуромицин, пуромицин гидрохлорид, пурпурины, пиразофурин, пиразолоакридин, конъюгат пиридоксилированного гемоглобина и полиоксиэтилена, антагонисты RAF, ралтитрексид, рамосетрон, ингибиторы RAS фарнесил протеинтрансферазы, ингибиторы RAS, ингибитор RAS-GAP, ретеллиптин деметилированный, рений Re 186 этидронат, ризоксин, рибоприн, рибозимы, ретинамид RII, RNAi, роглетимид, рогитукин, ромуртид, рохинимекс, рубигинон В1, рубоксил, сафингол, сафигнол гидрохлорид, саинтопин, SarCNU, саркофитол А, сарграмостим, миметики SDi 1, семустин, ингибитор старения 1, смысловые олигонуклеотиды, siRNA, ингибиторы передачи сигналов, модуляторы передачи сигналов, симтразин, одноцепочечный антиген-связывающий белок, сизофиран, собузоксан, натрия борокаптат, натрия фенилацетат, сольверол, соматомедин-связывающий белок, сонермин, спарфосат натрия, спарфосовую кислоту, спарсомицин, спикамицин D, спирогерманий гидрохлорид, спиромустин, спироплатин, спленопентин, спонгистатин 1, скаламин, ингибитор стволовых клеток, ингибиторы деления стволовых клеток, стипиамид, стрептонигрин, стрептозоцин, ингибиторы стромелизина, сульфинозин, сулофенур, суперактивный вазоактивный антагонист кишечного пептида, сурадиста, сурамин, свуейнсонин, синтетические гликозаминогликаны, тализомицин, таллимустин, тамоксифен метиодид, тауромустин, тазаротен, текогалан натрия, тегафур, теллурапирилиум, ингибиторы теломеразы, телоксантрон гидрохлорид, темопорфин, темозоломид, тенипозид, тероксирон, тестолактон, тетрахлордекаоксид, тетразомин, талибластин, талидомид, тиамиприн, тиокоралин, тиогуанин, тиотепа, тромбопоэтин, миметик тромбопоэтина, тималфасин, агонист рецептора тимопоэтина, тимотринан, тиреостимулирующий гормон, тиазофурин, олово этил этиопурпурин, тирапазамин, титаноцин дихлорид, топотекан гидрохлорид, топсентин, торемифен, торемифен цитрат, фактор тотипотентных стволовых клеток, ингибиторы трансляции, трестолон ацетат, третиноин, триацетилуридин, трицирибин, трицирибин фосфат, триметрексат, триметрексат глукуронат, трипторелин, трописетрон, тубулозол гидрохлорид, туростерид, ингибиторы тирозин киназы, тирфостины, ингибиторы UBC, убенимекс, урамустин, уредепу, ингибирующий фактор роста, производное мочеполового синуса, антагонисты рецептора урокиназы, вапреотид, вариолин В, веларезол, верамин, вердинс, вертепорфин, винбластин сульфат, винкристин сульфат, виндезин, виндезин сульфат, винепидин сульфат, винглицинат сульфат, винлейрозин сульфат, винорелбин, винорелбин тартрат, винрозидин сульфат, винксалтин, винзолидин сульфат, витаксин, ворозол, занотерон, зениплатин, зиласкорб, зиностатин, зиностатина стималамер или зорубицин гидрохлорид.

В некоторых вариантах осуществления активное средство представляет собой кабазитаксел или его аналог, производное, пролекарство или фармацевтически приемлемую соль.

Активное средство может быть неорганическим или металлорганическим соединением, содержащим один или несколько металлических центров. В некоторых примерах соединение содержит один металлический центр. Активным средством может являться, например, соединение платины, соединение рутения (например, транс-[RuCl₂(ДМСО)₄] или транс-[RuCl₄(имидазол)₂ и т.д.), соединение кобальта, соединение меди или соединения железа.

В некоторых вариантах осуществления активное средство в конъюгате содержится в заранее определенных мольных процентах, от приблизительно 1% до приблизительно 10%, или от приблизительно 10% до приблизительно 20%, или от приблизительно 20% до приблизительно 30%, или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, или от приблизительно 40% до приблизительно 50%, или от приблизительно 50% до приблизительно 60%, или от приблизительно 60% до приблизительно 70%, или от приблизительно 70% до приблизительно 80%, или от приблизительно 80% до приблизительно 90%, или приблизительно 90% до приблизительно 99%, так что сумма мольных процентов компонентов в конъюгате составляет 100%. Количество активного(ых) агента(ов) в конъюгате также может быть выражено в виде соотношения с целевым(ми) лигандом(ами). Например, в настоящем исследовании представлено соотношение активного средства к лиганду, равное приблизительно 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4; 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10.

B. Нацеливающие молекулы

Нацеливающие лиганды (также обозначены как нацеливающие молекулы), как описано в настоящем документе, включают любую молекулу, которая может связываться с одним или несколькими SSTR, например, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 или SSTR5 человека. Такие нацеливающие лиганды могут быть пептидами, миметиками антител, нуклеиновыми кислотами (например, аптамерами), полипептидами (например, антитела), гликопротеинами, низкомолекулярными молекулами, углеводами или липидами. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула представляет собой соматостатин или аналог соматостатина.

В цитотоксических или терапевтических конъюгатах по настоящему изобретению можно использовать любой аналог соматостатина, который связывает рецептор соматостатина. В некоторых вариантах осуществления, часть конъюгата, являющаяся аналогом соматостатина, содержит от 8 до 18 аминокислот и включает коровую последовательность: цикло[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys] (SEQ ID NO:1) или цикло[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys] (SEQ ID NO:2). Так, например, С-конец аналога представляет собой Thr-NH2.

В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула X может быть выбрана из соматостатина, октреотида, Tyr3-октеотата (TATE), вапреотида, цикло(AA-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Phe), где АА представляет собой α-N-Me лизина или N-Me глутаминовую кислоту, пасиреотид, ланреотид, сеглитид или любой другой лиганда, связывающего рецептор соматостатина. В некоторых вариантах осуществления, нацеливающая молекула представляет собой молекулу, связывающую рецептор соматостатина, которая связывается с рецепторами соматостатина 2 и/или 5. В некоторых вариантах осуществления X связывается с линкером Y на С-конце. В некоторых вариантах осуществления X связывается с линкером Y на N-конце. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула Х содержит по крайней мере один остаток D-Phe, и фенильное кольцо остатка D-Phe нацеливающей молекулы X заменено на молекулу, содержащую линкер.

В настоящем документы описаны примеры аналогов соматостатина, которые представляют собой пептиды, используемые в настоящем изобретении. Другие примеры используемых аналогов соматостатина раскрыты в публикациях, приведенных ниже, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме:

Заявка РСТ № WO 03/057214 (2003)

Заявка США № 20030191134 (2003)

Заявка США № 20030083241 (2003)

Патенте США № 6316414 (2001)

Заявка РСТ № WO 02/10215 (2002)

Заявка РСТ № WO 99/22735 (1999)

Заявка РСТ № WO 98/08100 (1998)

Заявка РСТ № WO 98/44921 (1998)

Заявка РСТ № WO 98/45285 (1998)

Заявка РСТ № WO 98/44922 (1998)

Заявка ЕР № P5164 EU (изобретатель: G.Keri);

Van Binst, G. et al., Peptide Research, 1992, 5:8;

Horvath, A. et al., Abstract, ʺConformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activityʺ, 22nd European peptide Symposium, Sep. 13-19, 1992, Interlaken, Швейцария;

Заявка РСТ № WO 91/09056 (1991);

Заявка ЕР № 0 363 589 A2 (1990);

Патент США № 4904642 (1990);

Патент США № 4871717 (1989);

Патент США № 4853371 (1989);

Патент США № 4725577 (1988);

Патент США № 4684620 (1987);

Патент США № 4650787 (1987);

Патент США № 4603120 (1986);

Патент США № 4585755 (1986);

Заявка ЕР № 0 203 031 A2 (1986);

Патент США № 4522813 (1985);

Патент США № 4486415 (1984);

Патент США № 4485101 (1984);

Патент США № 4435385 (1984);

Патент США № 4395403 (1983);

Патент США № 4369179 (1983);

Патент США № 4360516 (1982);

Патент США № 4358439 (1982);

Патент США № 4328214 (1982);

Патент США № 4316890 (1982);

Патент США № 4310518 (1982);

Патент США № 4291022 (1981);

Патент США № 4238481 (1980);

Патент США № 4235886 (1980);

Патент США № 4224199 (1980);

Патент США № 4211693 (1980);

Патент США № 4190648 (1980);

Патент США № 4146612 (1979);

Патент США № 4133782 (1979);

Патент США № 5506339 (1996);

Патент США № 4261885 (1981);

Патент США № 4728638 (1988);

Патент США № 4282143 (1981);

Патент США № 4215039 (1980);

Патент США № 4209426 (1980);

Патент США № 4190575 (1980);

Патент ЕР № 0 389 180 (1990);

Заявка ЕР № 0 505 680 (1982);

Заявка ЕР № 0 083 305 (1982);

Заявка ЕР № 0 030 920 (1980);

Заявка РСТ № WO 88/05052 (1988);

Заявка РСТ № WO 90/12811 (1990);

Заявка РСТ № WO 97/01579 (1997);

Заявка РСТ № WO 91/18016 (1991);

Заявка UK № GB 2095261 (1981);

Заявка Франции № FR 2522655 (1983); а также

Заявка РСТ № WO 04/093807 (2004).

Патент США № 5620955 (1997)

Патент США № 5723578 (1998)

Патент США № 5843903 (1998)

Патент США № 5877277 (1999)

Патент США № 6156725 (2000)

Патент США № 6307017 (2001)

Заявка РСТ № WO 90/03980 (1990)

Заявка РСТ № WO 91/06563 (1991)

Заявка РСТ № WO 91/17181 (1991)

Заявка РСТ № WO 94/02018 (1994)

Заявка РСТ № WO 94/21674 (1994)

Заявка PCT № WO 04/093807 (2004);

Способы синтеза пептидов соматостатина и аналогов хорошо задокументированы и находятся в пределах способности среднего специалиста в данной области, как проиллюстрировано в ссылках, перечисленных выше. Дальнейшие процедуры синтеза представлены в следующих далее примерах. Следующие примеры также иллюстрируют способы синтеза нацеленных цитотоксических соединений по настоящему изобретению. Специфическое нацеливание терапевтических или цитотоксических средств позволяет селективно разрушать опухоль, экспрессирующую рецептор, специфический в отношении биологически активного пептида. Например, опухоль, экспрессирующую рецептор соматостатина, включает новообразование легкого, молочной железы, предстательной железы, толстой кишки, головного мозга, желудочно-кишечного тракта, нейроэндокринного тракта, печени или почек (см. Schaer et al., Int. J. Cancer, 70:530-537, 1997; Chave et al., Br. J. Cancer 82(1):124-130, 2000; Evans et al., Br. J. Cancer 75(6):798-803, 1997).

В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула имеет терапевтические признаки, например, нацеливающая молекула является цитотоксической или антиангиогенной. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула имеет некоторое повышенное сродство к опухолевой сосудистой сети, или к ангиогенным кровеносным сосудам, например, к тем, которые сверхэкспрессируют рецепторов соматостатина (см. Denzler and Reubi, Cancer 85:188-198, 1999; Gulec et al., J. Surg. Res. 97(2):131-137, 2001; Woltering et al., J. Surg. Res. 50:245, 1991).

В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула, например, аналог соматостатина, используемый в настоящему изобретении, является гидрофильной, и, следовательно, растворимой в воде. В некоторых вариантах осуществления такие конъюгаты и частицы, содержащие такие конъюгаты, используют в стандартном способе лечения, когда такой признак является полезным, например, по сравнению с конъюгатами, содержащими гидрофобные аналоги. Гидрофильные аналоги, описанные в настоящем документе, могут быть растворимы в крови, спинномозговой жидкости и других жидкостях организма, а также в моче, что может способствовать экскреции почками. Этот признак может быть полезен, например, для композиции, которая может по каким-либо причинам проявлять нежелательную токсичность для печени. В изобретении также раскрыты специфические гидрофильные элементы (например, введение линкера PEG, а также другие примеры в данной области) для включения в пептидные аналоги, что позволяет модулировать гидрофильность аналогов и регулировать химическую и структурную природу различных конъюгированных цитотоксических средств, например, конъюгат 6 ниже.

В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула представляет собой антитело-миметик, такое как монотело, например, АДНЕКТИН™ (Bristol-Myers Squibb, Нью-Йорк, Нью-Йорк), Аффитело® (Аффитело AB, Стокгольм, Швеция), Аффилин, нанофитин (аффитин, как соединения, описанные в WO 2012/085861, Антикалин™, авимеры (мультимеры с авидностью), DARPin™, Финомер™, Центирин™ и пептидный домен Кунитца. В некоторых случаях такие миметики представляют собой искусственные пептиды или белки с молекулярной массой, равной приблизительно от 3 до 20 кДа. Нуклеиновые кислоты и низкомолекулярные молекулы могут быть антитело-миметиками.

В другом примере нацеливающая молекула может быть аптамером, который, как правило, представляет собой олигонуклеотид (например, ДНК, РНК, или его аналог или производное), который связывается с конкретной мишенью, такой как полипептид. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула представляет собой полипептид (например, антитело, которое может специфически связывать маркер опухоли). В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула представляет собой антитело или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула представляет собой Fc-фрагмент антитела.

В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула или молекулы конъюгата присутствуют в заданном проценте молярной массы от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%, или от приблизительно 1% до приблизительно 10%, или от приблизительно 10% до приблизительно 20%, или от приблизительно 20% до приблизительно 30%, или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, или от приблизительно 40% до приблизительно 50%, или от приблизительно 50% до приблизительно 60%, или от приблизительно 60% до приблизительно 70%, или от приблизительно 70% до приблизительно 80%, или от приблизительно 80% до приблизительно 90%, или от приблизительно 90% до приблизительно 99%, так что сумма процентов молекулярной массы компонентов конъюгата составляет 100%. Количество нацеливающих молекул конъюгата также может быть выражено в единицах пропорции активных(ого) средств(а), например, как соотношение лиганда к активному средство, равное приблизительно 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4; 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10.

С. Линкеры

Конъюгаты содержат один или несколько линкеров, соединяющих активные средства и нацеливающие молекулы. Линкер, Y, связан с одним или более активными средствами и с одним или более нацеливающими лигандами с образованием конъюгата. Линкер Y присоединен к нацеливающей молекуле X и активному средству Z с помощью функциональных групп, независимо выбранных из сложноэфирной связи, дисульфида, амида, ацилгидразона, простого эфира, карбамата, карбоната и мочевины. В качестве альтернативы линкер может быть присоединен либо к нацеливающему лиганду, либо к активному лекарственному средству с помощью нерасщепляемой группы, такой как предусмотрено конъюгатом, между тиолом и малеимидом, азидом и алкином. Линкер независимо выбран из группы, включающей алкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил, где каждая группа алкила, алкенила, циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила необязательно замещена одной или несколькими группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, циано, нитро, гидроксила, карбоксила, карбамоила, простого эфира, алкокси, арилокси, амино, амида, карбамата, алкила, алкенила, алкинила, арила, арилалкила, циклоалкила, гетероарила, гетероциклила, где каждый карбоксил, карбамоил, простой эфир, алкокси, арилокси, амино, амид, карбамат, алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил, циклоалкил, гетероарил или гетероциклил необязательно замещен одним или несколькими группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, циано, нитро, гидроксила, карбоксила, карбамоила, простого эфира, алкокси, арилокси, амино, амида, карбамата, алкила, алкенила, алкинила, арила, арилалкила, циклоалкила, гетероарила, гетероциклила.

В некоторых вариантах осуществления линкер содержит расщепляемую функциональную группу, которая расщепляется. Расщепляемая функциональная группа может быть гидролизована in vivo или может быть сделана так, чтобы подвергаться ферментативному гидролизу, например, под действием Катепсина В. «Расщепляемый» линкер, как используется в настоящем описании, относится к любому линкеру, который может быть расщеплен физически или химически. Примерами физического расщепления могут быть расщепление светом, радиоактивным излучением или теплом, тогда как примеры химического расщепления включают расщепление редокс-реакциями, гидролизом, рН-зависимое расщепление или расщепление ферментами.

В некоторых вариантах осуществления алкильная цепь линкера необязательно может быть прервана одним или несколькими атомами или группами, выбранными из -O-, -C(=O)-, -NR, -O-C(=O)-NR-, -S-, -S-S-. Линкер может быть выбран из дикарбоксилатных производных янтарной кислоты, глутаровой кислоты или дигликолевой кислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер Y может представляет собой Х'-R¹-Y'-R²-Z ', и конъюгат может представлять собой соединение, соответствующее Формуле Ia:

Ia

где Х представляет собой нацеливающую молекулу, как определено выше; Z представляет собой активное средство; Х', R¹, Y', R² и Z' такие, как определено в настоящем документе.

Х' либо отсутствует, либо независимо выбран из амида, карбонила, мочевины, амино, сложного эфира, арила, арилкарбонила, арилокси, ариламино, одного или нескольких природных или неприродных аминокислот, тио или сукцинимидо; R¹ и R² либо отсутствуют, либо включают алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, полиэтиленгликоль (2-30 единиц); Y' отсутствует, замещенный или незамещенный 1,2-диаминоэтан, полиэтиленгликоль (2-30 единиц) или амид; Z' либо отсутствует, либо независимо выбран из амида, карбонила, мочевины, амино, сложного эфира, арила, арилкарбонила, арилокси, ариламино, тио или сукцинимидо. В некоторых вариантах осуществления линкер может обеспечить одной активной молекуле средства быть связанной с двумя или более лигандами, или один лиганд может быть связан с двумя или более активными средствами.

В некоторых вариантах осуществления линкер Y может быть A_m и конъюгат может представлять собой соединение, соответствующее Формуле Ib:

Ib

где А определено в настоящем описании, m=0-20.

А в формуле Ia представляет собой спейсерную единицу, либо отсутствует, либо независимо выбран из следующих заместителей. Для каждого заместителя пунктирные линии означают участки замещения X, Z или другой независимо выбранной единицей А, где Х, Z или А могут быть присоединен по обе стороны от заместителя:

, , , , , ,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или , где z=0-40, R представляет собой Н или необязательно замещенную алкильную группу, и R' представляет собой любую боковую цепь природных или неприродных аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат может представляет собой соединение, соответствующее Формуле Iс:

Iс

где А определен выше, m=0-40, n=0-40, х=1-5, у=1-5, и С представляет собой элемент разветвления, определенный в настоящем документе.

С в формуле Ic представляет собой разветвленную единицу, содержащую от трех до шести функциональных групп для ковалентного присоединения спейсерных единиц, лигандов или активных лекарственных средств, выбранных из аминов, карбоновых кислот, тиолов или сукцинимидов, в том числе аминокислот, таких как лизин, 2,3-диаминопропановой кислоты, 2,4-диаминомасляной кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и цистеина.

Не ограничивающие примеры конъюгатов по настоящему изобретению включают следующие соединения:

1 2 3 4 5 6 7

В некоторых вариантах осуществления активное средство Z представляет собой DM1, а средство, связывающее рецептор соматостатина, Х выбрано из соматостатина, цикло(AA-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Phe), вапреотида или TATE. В некоторых вариантах осуществления DM1 соединен с С-концом X с помощью линкера Y. В некоторых вариантах осуществления DM1 соединен с N-концом X с помощью линкера Y. В некоторых вариантах осуществления DM1 соединен с X с помощью линкера Y, где нацеливающая молекула Х содержит по крайней мере один остаток D-Phe и фенильное кольцо остатка D-Phe заменено группой, содержащей линкер Y.

Неограничивающие примеры конъюгатов, содержащих DM1, называемые конъюгаты DM1 по настоящему изобретению, включают следующие соединения:

Конъюгаты DM1, основанные на цикло(AA-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Phe)

В некоторых вариантах осуществления цикло (AA-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Phe) используется в качестве нацеливающей на рецептор соматостина молекулы и конъюгаты имеют общую структуру:

8

В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула содержит аминокислоту, способную создавать амидную связь. В некоторых вариантах осуществления, линкер связан с нацеливающей молекулой посредством амидной связи, то есть, -NH-СО- или -СО-NH- (водород может быть замещен азотом). В некоторых вариантах осуществления линкер не связан с нацеливающей молекулой посредством амидной связи. В некоторых вариантах осуществления линкер включает амидную связь, то есть, -NH-СО- или -СО-NH- (водород может быть замещен азотом).

Неограничивающие примеры конъюгатов, содержащих цикло (АА-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Phe) и DM1, приведены в таблице 1:

Таблица 1. Конъюгаты на основе цикло (AA-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Phe) Линкер* Полная структура 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 * для того чтобы показать линкерные структуры, нацеливающая на рецептор соматостатина молекула указана как лиганд в структурах.

2) С-концевые конъюгаты DM1:

В некоторых вариантах осуществления молекула, нацеливающая на рецептор соматостатина, представляет собой пептид, а линкер связывается с С-концом нацеливающей на рецептор соматостатина молекулы. В некоторых вариантах осуществления молекула, нацеливающая на рецептор соматостатина, представляет собой TATE или производное TATE, а линкер связывается с С-концом TATE или производного TATE. С-концевые конъюгаты DM1 конъюгаты имеют общую структуру:

33

где R выбран из Н, алкила, арила, карбонила, амида, спирта или амина, необязательно замещенных одним или несколькими группами; и

Ar₁ и Ar₂ независимо выбраны из групп гетероциклила, арила и гетероарила, необязательно замещенных одним или несколькими группами.

В некоторых вариантах осуществления ковалентная связь, связывающая линкер и C-конец молекулы, нацеливающей на рецептор соматостатина, является амидной связью.

Неограничивающие примеры конъюгатов DM1, где линкер связывается с С-концом молекулы, нацеливающей на рецептор соматостатина, где молекула, нацеливающая на рецептор соматостатина, представляет собой TATE, приведены в Таблице 2:

Таблица 2. С-концевые конъюгаты DM1-TATE R Ar1 Ar2 Линкер* Полная структура H 34 35 H 36 37 H 38 39 H 40 41 H 42 43 H 44 45 H 46 47 H 48 49 H 50 51 H 52 53 54 55 H 56 57 H 58 59 H 60 61 H 62 63 64 65 * Для того чтобы показать линкерные структуры, нацеливающая на рецептор соматостатина молекула указана как лиганд в структурах.

3) N-концевые конъюгаты DM1

В некоторых вариантах осуществления молекула, нацеливающая на рецептор соматостатина, представляет собой пептид, а линкер связывается с N-концом нацеливающей на рецептор соматостатина молекулы. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула выбрана из октреотида, вапреотида и TATE. В некоторых вариантах осуществления ковалентная связь, связывающая линкер и N-конец молекулы, нацеливающей на рецептор соматостатина, является амидной связью, то есть -NH-CO-. В некоторых вариантах осуществления, линкер связывается с N-концом молекулы, нацеливающей на рецептор соматостатина, с помощью аминной связи, то есть, -NH-CH₂- (водород может быть замещен углеродом). В некоторых вариантах осуществления линкер связывается с N-концом молекулы, нацеливающей на рецептор соматостатина, с помощью связи мочевины, т.е. -NH-CO-NH-. N-концевой конъюгат DM1 имеет общую структуру:

66

где R₁ и R₂ независимо выбраны из Н, ОН, алкила, арила, карбонила, сложного эфира, амида, эфира, спирта или амина, необязательно замещенных одной или несколькими группами; и

Ar₁ выбран из групп гетероциклила, арила и гетероарила, необязательно замещенных одной или несколькими группами. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере один из R1 или R2 содержит DM1.

Неограничивающие примеры конъюгатов DM1, где линкер связывается с N-концом молекулы, нацеливающей на рецептор соматостатина, приведены в Таблице 3:

Таблица 3. N-концевые конъюгаты DM1 R1 R2 Ar1 Линкер* Полная структура -OH 67 68 -Me 69 70 -OH 71 72 -OH 73 74 -OH 75 76 -Me 77 78 -OH 79 80 -OH 81 82 -OH 83 84 -OH 85 86 -OH 87 88 -OH 89 90 -OH 91 92 -OH 93 94 -OH 95 96 -OH 97 98 -OH 99 100 -Me 101 102 -OH 103 104 -OH 105 106 -OH 107 108 * Для того чтобы показать линкерные структуры, нацеливающая на рецептор соматостатина молекула указана как лиганд в структурах.

4) Конъюгаты DM1 с заменой D-Phe

В некоторых вариантах осуществления нацеливающая на рецептор соматостатина молекула представляет собой нацеливающий лиганд, такой как октреотид или TATE, где фенильное кольцо остатка D-Phe нацеливающего лиганда замещено линкер-содержащей молекулой. Конъюгат DM1 с замещенным D-Phe имеет общую структуру:

109

где R выбран из Н, ОН, алкила, арила, карбонила, сложного эфира, амида, простого эфира, спирта или амина, необязательно замещенных одним или несколькими группами. В некоторых вариантах осуществления R содержит DM1.

Неограничивающие примеры конъюгатов DM1, где фенильное кольцо остатка D-Phe нацеливающего лиганда замещено линкером, содержащим молекулу, приведены в Таблице 4:

Таблица 4. Конъюгаты с заменой D-Phe R Линкер* Полная структура H 110 111 H 112 113 H 114 115 116 117 H 118 119 * Для того чтобы показать линкерные структуры, нацеливающая на рецептор соматостатина молекула указана как лиганд в структурах.

III. Частицы

Частицы, содержащие один или более конъюгатов могут быть полимерными частицами, липидными частицами, твердыми липидными частицами, неорганическими частицами или их комбинациями (например, полимерные частицы, стабилизированные липидом). В некоторых вариантах осуществления частицы являются полимерными частицами или содержат полимерную матрицу. Частицы могут содержать любой полимер, описанный в настоящем документе, или их производные или сополимеры. Частицы обычно содержат один или более биосовместимых полимеров. Полимеры могут быть биодеградируемыми полимерами. Полимеры могут быть гидрофобными полимерами, гидрофильными полимерами или амфифильными полимерами. В некоторых вариантах осуществления частицы содержат один или более полимеров, имеющих дополнительную нацеливающую молекулу, присоединенную к нему.

Размер частиц может быть скорректирован с учетом предполагаемого применения. Частицы могут быть наночастицами или микрочастицами. Частица может иметь диаметр от приблизительно 10 нм до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 10 нм до приблизительно 1 мкм, от приблизительно 10 нм до приблизительно 500 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 500 нм или от приблизительно 25 нм до приблизительно 250 нм. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой наночастицу с диаметром от приблизительно 25 нм до приблизительно 250 нм. Как понятно специалисту в данной области, множество частиц будет иметь диапазон размеров, и под диаметром понимают средний диаметр распределения частиц по размерам.

В различных вариантах осуществления частица может быть наночастицей, то есть частица имеет характерный размер, равный менее приблизительно 1 мкм, где характерный размер частицы представляет собой диаметр идеальной сферы, имеющей такой же объем, что и частица. Множество частиц может характеризоваться средним диаметром (например, средним диаметром для множества частиц). В некоторых вариантах осуществления диаметр частиц может иметь распределение по типу Гауссова. В некоторых вариантах осуществления множество частиц имеет средний диаметр менее приблизительно 300 нм, менее приблизительно 250 нм, менее приблизительно 200 нм, менее приблизительно 150 нм, менее приблизительно 100 нм, менее приблизительно 50 нм, менее приблизительно 30 нм, менее приблизительно 10 нм, менее приблизительно 3 нм или менее приблизительно 1 нм. В некоторых вариантах осуществления, частицы имеют средний диаметр по крайней мере приблизительно 5 нм, по крайней мере приблизительно 10 нм, по крайней мере приблизительно 30 нм, по крайней мере приблизительно 50 нм, по крайней мере приблизительно 100 нм, по крайней мере приблизительно 150 нм или больше. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения множество частиц имеет средний диаметр приблизительно 10 нм, приблизительно 25 нм, 50 нм, приблизительно 100 нм, приблизительно 150 нм, приблизительно 200 нм, приблизительно 250 нм, приблизительно 300 нм, приблизительно 500 нм, или тому подобное. В некоторых вариантах осуществления множество частиц имеет средний диаметр от приблизительно 10 нм до приблизительно 500 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 400 нм, от приблизительно 100 нм до приблизительно 300 нм, от приблизительно 150 нм до приблизительно 250 нм, от приблизительно 175 нм до приблизительно 225 нм, или тому подобное. В некоторых вариантах осуществления множество частиц имеет средний диаметр от приблизительно 10 нм до приблизительно 500 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 400 нм, от приблизительно 30 нм до приблизительно 300 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 175 нм, от приблизительно 60 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 70 нм до приблизительно 130 нм, или тому подобное. Например, средний диаметр может составлять от приблизительно 70 нм до 130 нм. В некоторых вариантах осуществления, множество частиц имеет средний диаметр от приблизительно 20 нм до приблизительно 220 нм, от приблизительно 30 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 180 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 170 нм, от приблизительно 60 нм до приблизительно 150 нм или от приблизительно 70 нм до приблизительно 130 нм. В одном из вариантов осуществления частицы имеют размер от 40 до 120 нм с дзета-потенциалом, близким к 0 мВ при низких или нулевой ионной силе (от 1 до 10 мМ), с дзета-потенциалом значений от+5 до - 5 мВ, и ноль/нейтральным или небольшим -ve поверхностным зарядом.

Конъюгаты

Частицы содержат один или более конъюгатов, как описано выше. Конъюгаты могут присутствовать на внутренней поверхности частицы, на внешней поверхности частицы, или на обоих поверхностях. Частицы могут содержать комплексы пар гидрофобных ионов или пары гидрофобных ионов, образованные одним или более конъюгатами, описанными выше, и противоионы.

Пары гидрофобных ионов (HIP) представляет собой взаимодействие между парой противоположно заряженных ионов, удерживаемых вместе Кулоновским притяжением. HIP, как используется в настоящем описании, относится к взаимодействию между конъюгатом по настоящему изобретению и его противоионами, где противоион не является ионом Н или HO^-. Комплексы пар гидрофобных ионов или пары гидрофобных ионов, как используется в настоящем описании, относятся к комплексу, образованному с помощью конъюгата по настоящему изобретению и его противоионами. В некоторых вариантах осуществления противоионы являются гидрофобными. В некоторых вариантах осуществления противоионы предоставляют гидрофобная кислота или солью гидрофобной кислоты. В некоторых вариантах осуществления противоионы предоставляют желчные кислоты или их соли, жирные кислоты или их соли, липиды или аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления противоионы заряжены отрицательно (анионные). Неограничивающие примеры отрицательно заряженных противоионов включают противоионы сульфосукцината натрия (АОТ), олеата натрия, додецилсульфата натрия (SDS), сывороточного альбумина человека (HSA), сульфата декстрана, дезоксихолата натрия, холата натрия, анионные липиды, аминокислоты, или любую их комбинацию. Не желая быть связанными какой-либо теорией, в некоторых вариантах осуществления HIP может увеличивать гидрофобность и/или липофильности конъюгата по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления увеличение гидрофобности и/или липофильности конъюгата по настоящему изобретению может быть полезным для составов частиц и может обеспечить более высокую растворимость конъюгата по настоящему изобретению в органических растворителях. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что составы частиц, которые включают пары HIP обладают улучшенными свойствами состава, например, содержанием лекарственного средства и/или профилем высвобождения. Не желая быть связанными какой-либо теорией, в некоторых вариантах осуществления медленное высвобождение конъюгата по изобретению от частиц может возникать из-за уменьшения растворимости конъюгата в водном растворе. Кроме того, не желая быть связанными какой-либо теорией, образование комплексов конъюгатов с высокомолекулярными гидрофобными противоионами может замедлить диффузию конъюгата внутри полимерной матрицы. В некоторых вариантах осуществления HIP возникают без ковалентного связывания противоиона и конъюгата по настоящему изобретению.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, сила HIP может оказывать влияние на содержание лекарственного средства и скорость высвобождения частиц по изобретению. В некоторых вариантах осуществления сила HIP может быть увеличена за счет увеличения величины разности между рКа конъюгата по настоящему изобретению и рКа средства, предоставляющего противоион. Кроме того, не желая быть связанными какой-либо теорией, условия для формирования ионной пары могут влиять на содержание лекарственного средства и скорость высвобождения частиц по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления любая подходящая гидрофобная кислота или ее комбинация может образовывать пару HIP с конъюгатом по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления гидрофобная кислота может представлять собой карбоновую кислоту (например, но ими не ограничиваясь, монокарбоновая кислота, дикарбоновая кислота, трикарбоновая кислота), сульфиновая кислота, сульфеновая кислота или сульфокислоты. В некоторых вариантах осуществления соль подходящей гидрофобной кислоты или ее комбинация могут быть использованы для образования пары HIP с конъюгатом по настоящему изобретению. Примеры гидрофобных кислот, насыщенных жирных кислот, ненасыщенных жирных кислот, ароматических кислот, желчных кислот, полиэлектролита, их константа диссоциации в воде (рКа) и значения logP раскрыты в WO2014/043625, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Сила гидрофобной кислоты, разница между рКа гидрофобной кислоты и рКа конъюгата по настоящему изобретению, logP гидрофобной кислоты, температуры фазового перехода гидрофобной кислоты, мольное отношение гидрофобной кислоты и конъюгата по настоящему изобретению, а также концентрация гидрофобной кислоты также раскрыты в WO2014/043,625, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

В некоторых вариантах осуществления частицы по настоящему изобретению, содержащие комплекс HIP и/или полученные способом, который предоставляет противоион для образования комплекса HIP и конъюгата, может иметь более высокое содержание лекарственного вещества, чем частицы без комплекса HIP или полученные способом, который не предоставляет противоионы для образования комплекса HIP и конъюгата. В некоторых вариантах осуществления содержание лекарственное средства может увеличиться на 50%, 100%, в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, в 8 раз, 9 раз или в 10 раз.

В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению могут удерживать конъюгат по крайней мере приблизительно 1 минуты, по крайней мере приблизительно 15 минут, по крайней мере, приблизительно 1 час, при помещении в фосфатный буферный раствор при 37^оC.

В некоторых вариантах осуществления, массовый процент конъюгата в частицах составляет по крайней мере приблизительно 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50%, так, что сумма массовых процентов компонентов частиц составляет 100%. В некоторых вариантах осуществления, массовый процент конъюгата в частицах составляет от приблизительно 0,5% до приблизительно 10%, или от приблизительно 10% до приблизительно 20%, или от приблизительно 20% до приблизительно 30%, или от приблизительно 30% до приблизительно 40%, или приблизительно 40% до приблизительно 50%, или от приблизительно 50% до приблизительно 60%, или от приблизительно 60% до приблизительно 70%, или от приблизительно 70% до приблизительно 80%, или от приблизительно 80% до приблизительно 90%, или приблизительно 90% до приблизительно 99%, так, что сумма массовых процентов компонентов частиц составляет 100%.

В некоторых случаях конъюгат может иметь молекулярную массу менее приблизительно 50000 дальтон, менее приблизительно 40000 дальтон, менее приблизительно 30000 дальтон, менее приблизительно 20000 дальтон, менее приблизительно 15000 дальтон, менее приблизительно 10000 дальтон, менее приблизительно 8000 Да, менее приблизительно 5000 Да или менее приблизительно 3000 Да. В некоторых случаях, конъюгат может иметь молекулярную массу от приблизительно 1000 дальтон до приблизительно 50000 Да, от приблизительно 1000 Да до приблизительно 40000 Да, в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1000 дальтон до приблизительно 30000 дальтон, в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1000 Да до приблизительно 50000 Да, от приблизительно 1000 Да до приблизительно 20000 Да, в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1000 Да до приблизительно 15000 Да, в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1000 Да и 10000 Да, в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1000 Да до приблизительно 8000 Да, в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1000 Да до приблизительно 5000 Да, и в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1000 Да до приблизительно 3000 Да. Молекулярная масса конъюгата может быть вычислена как сумма атомного веса каждого атома в формуле конъюгата, умноженная на число каждого атома. Она также может быть измерена с помощью масс-спектрометрии, ЯМР, хроматографии, светорассеяния, вязкости и/или любым другим способом, известными в данной области. В данной области известно, что единица молекулярной массы может выражена в г/моль, в Дальтонах (Да) или единице атомной массы (а.е.м.), где 1 г/моль=1 Да=1 а.е.м..

B. Полимеры

Частицы могут содержать один или несколько полимеров. Полимеры могут содержать более одного из следующих сложных полиэфиров: гомополимеры, включая единицы гликолевой кислоты, называемые в настоящем описании «PGA», и единицы молочной кислоты, такие как поли-L-молочная кислота, поли-D-молочная кислота, поли-D,L -молочная кислота, поли-L-лактид, поли-D-лактид и поли-D,L-лактид, вместе называемые в настоящем описании «PLA», и единицы капролактона, такие как поли (ε-капролактон), вместе называемые в настоящем описании «PCL»; и сополимеры, включающие единицы молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как различные формы поли (молочная кислота-со-гликолевая кислота) и поли (лактид-со-гликолид), характеризованные соотношением молочной кислоты:гликолевой кислоты, вместе называемые в настоящем описании «PLGA»; и полиакрилаты, а также их производные. Примеры таких полимеров включают также сополимеры полиэтиленгликоля (PEG) и указанных сложных полиэфиров, такие как различные формы PLGA-PEG или PLA-PEG-сополимеры, вместе называемые в настоящем описании «PEGилированными полимерами». В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения часть PEG может быть ковалентно связана с полимером с образованием «ПЭГилированных полимеров» с помощью расщепляемого линкера.

Частицы могут содержать один или несколько гидрофильных полимеров. Гидрофильные полимеры включают целлюлозные полимеры, такие как крахмал и полисахариды; гидрофильные полипептиды; поли(аминокислоты), такие как поли-L-глутаминовая кислота (PGS), гамма-полиглутаминовая кислота, поли-L-аспарагиновая кислота, поли-L-серин или поли-L-лизин; полиалкиленгликоли и полиалкиленоксиды, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропилен (PPG) и поли(этиленоксид) (PEO); поли(оксиэтилированный полиол); поли(олефиновый спирт); поли(винилпирролидон); поли(гидроксиалкилметакриламид); поли(гидроксиалкилметакрилат); поли(сахариды); поли(гидроксикислоты); поли(виниловый спирт); полиоксазолин; и их сополимеры.

Частицы могут содержать один или несколько гидрофобных полимеров. Примеры подходящих гидрофобных полимеров включают полигидроксикислоты, такие как поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) и поли(молочная кислота-со-гликолевая кислота); полигидроксиалканоаты, такие как поли3-гидроксибутират или поли4-гидроксибутират; поликапролактоны; поли(ортоэфиры); полиангидриды; поли(фосфазенов); поли(лактид-со-капролактоны); поликарбонаты, такие как тирозин поликарбонаты; полиамиды (в том числе синтетические и природные полиамиды), полипептиды, и поли(аминокислоты); полиэфирамиды; полиэфиры; поли(диоксаноны); поли(алкилен алкилаты); гидрофобные полиэфиры; полиуретаны; простые полиэфиры; полиацетали; полицианоакрилаты; полиакрилаты; полиметилметакрилаты; полисилоксаны; сополимеры поли(оксиэтилен)/поли(оксипропилен); поликетали; полифосфаты; полигидроксивалераты; полиалкилен оксалаты; полиалкилен сукцинаты; поли(малеиновые кислоты), а также их сополимеры.

В некоторых вариантах осуществления гидрофобный полимер представляет собой алифатический полиэфир. В некоторых вариантах осуществления, гидрофобный полимер представляет собой поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) или поли(молочная кислота-со-гликолевая кислота).

Частицы могут содержать один или более биодеградируемых полимеров. Биодеградируемые полимеры могут включать полимеры, которые нерастворимы или плохо растворимы в воде, которые преобразуются химически или ферментативно в организме в растворимые в воде вещества. Биодеградируемые полимеры могут включать растворимые полимеры, перекрестно сшитые с помощью гидролизуемых перекрестно-связывающих групп, делая перекрестно сшитый полимер нерастворим или умеренно растворим в воде.

Биоразлагаемые полимеры в частице могут включать полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерфталаты, поливиниловые спирты, поливиниловые простые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливиниловые галогенангидриды, поливинилпирролидон, полигликолиды, полисилоксаны, полиуретаны и их сополимеры, алкилцеллюлозу, такую как метилцеллюлозу и этилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза, гидрокси-пропилметилцеллюлоза и гидроксибутилметилцеллюлоза, целлюлозные простые эфиры, целлюлозные сложные эфиры, нитроцеллюлозы, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетатбутират целлюлозы, ацетатфталат целлюлозы, карбоксилэтилцеллюлоза, триацетат целлюлозы, натриевая соль суфлата целлюлозы, полимеры акриловых и метакриловых эфиров, такие как поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат), поли(октадецилакрилат), полиэтилен, полипропилен поли(этиленгликоль), поли(этиленоксид), поли(этилентерфталат), поли(виниловые спирты), поли(винилацетат, поливинил хлорид полистирол и поливинилпирролидон, их производные, линейные и разветвленные сополимеры и их блок сополимеры, и их смеси. Примеры биодеградируемых полимеров включают полиэфиры, поли(орто эфиры), поли(этиленимины), поли(капролактонаты), поли(гидроксиалканоаты), поли(гидроксивалераты), полиангидриды, поли(акриловые кислоты), полигликолиды, поли(уретаны), поликарбонаты, полифосфатные эфиры, полифосфазены, их производные, линейные и разветвленные сополимеры и их блок сополимеры, и их смеси. В некоторых вариантах осуществления частица содержит биодеградируемые полиэфиры или полиангидриды, такие как поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) и поли(молочная-со-гликолевая кислота).

Частицы могут содержать один или более амфифильные полимеры. Амфифильные полимеры могут быть полимерами, содержащими гидрофобный блок полимер и гидрофильный блок полимер. Гидрофобный блок полимер может содержать один или более гидрофобных полимеров выше или их производное или сополимер. Гидрофильный блок полимер может содержать один или более гидрофильных полимеров выше или их производное или сополимер. В некоторых вариантах осуществления амфифильный полимер представляет собой ди-блок полимер, содержащий гидрофобный конец, образованный из гидрофобного полимера и гидрофильный коней, образованный из гидрофильного полимера. В некоторых вариантах осуществления молекула может быть присоединена к гидрофобному концу, к гидрофильному концу, или к ним обоим. Частица может содержать два или более амфилфильных полимера.

С. Липиды

Частицы могут содержать один или более липидов или амфифильных соединений. Например, частицы могут быть липосомами, липидными мицеллами, твердыми липидными частицами или полимерными частицами, стабилизированными липидами. Липидная частица может быть получена из одного или смеси различных липидов. Липидные частицы образуются из одного или более липидов, которые могут быть нейтральными, анионными или катионными при физиологическом рН. Липидная частица, в некоторых вариантах осуществления, включает один или несколько биосовместимых липидов. Липидные частицы могут быть образованы с использованием комбинации более одного липида. Например, заряженный липид может быть комбинирован с липидом, который является неионным или незаряженным при физиологическом значении рН.

Частица может быть липидной мицеллой. Липидные мицеллы для доставки лекарственных средств известны в данной области. Липидные мицеллы могут быть образованы, например, в виде эмульсии вода-в-масле с липидным поверхностно-активным веществом. Эмульсия представляет собой смесь двух несмешивающихся фаз, при этом поверхностно-активное вещество добавляют для стабилизации дисперсных капель. В некоторых вариантах осуществления липидная мицелла представляет собой микроэмульсию. Микроэмульсия представляет собой термодинамически стабильную систему, состоящую по крайней мере из воды, масла и липидного поверхностно-активного вещества, давая прозрачную и термодинамически стабильную систему, размер капель которой составляет менее 1 мкм, от приблизительно 10 нм до приблизительно 500 нм, или от приблизительно 10 нм до приблизительно 250 нм. Липидные мицеллы, как правило, могут использоваться для инкапсуляции гидрофобных активных средств, в том числе гидрофобных терапевтических средств, гидрофобных профилактических средств или гидрофобных диагностических средств.

Частица может быть липосомой. Липосомы представляют собой низкомолекулярные везикулы, состоящие из водной среды, окруженной липидами, расположенными в сферических бислоях. Липосомы могут быть классифицированы как низкомолекулярные однослойные везикулы, высокомолекулярные однослойные везикулы или многослойные везикулы. Многослойные липосомы содержат множество концентрических липидных бислоев. Липосомы могут быть использованы для инкапсулирования средств, путем захвата гидрофильных агентов в водном внутреннем пространстве или между бислоев, или путем улавливания гидрофобных агентов в бислой.

Липидные мицеллы и липосомы, как правило, имеют водный центр. Водный центр может содержать воду или смесь воды и спирта. Подходящие спирты включают, но ими не ограничиваются, метанол, этанол, пропанол, (такой как изопропанол), бутанол (такой как н-бутанол, изобутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, пентанол (такой как амиловый спирт, изобутил карбинол), гексанол (такой как 1-гексанол, 2-гексанол, 3-гексанол), гептанол (такой как 1-гептанол, 2-гептанол, 3-гептанол и 4-гептанол) или октанол (такой как 1-октанол) или их комбинации.

Частица может представлять собой твердую липидную частицу. Твердые липидные частицы представляют собой альтернативу коллоидных мицелл и липосом. Твердые липидные частицы, как правило, имеют субмикронный размер, то есть от приблизительно 10 нм до приблизительно 1 мкм, от 10 нм до приблизительно 500 нм или от 10 нм до приблизительно 250 нм. Твердые липидные частицы образуются из липидов, которые являются твердыми при комнатной температуре. Их получают из эмульсий масло-в-воде, заменяя жидкое масло на твердый липид.

Подходящие нейтральные и анионные липиды включают, но ими не ограничиваются, стеролы и липиды, такие как холестерин, фосфолипиды, лизолипиды, лизофосфолипиды, сфинголипиды или пегилированные липиды. Нейтральные и анионные липиды включают, но ими не ограничиваются, фосфатидилхолин (PC) (например, яичный PC, соевый PC), включая 1,2-диацилглицеро-3-фосфохолины; фосфатидилсерин (PS), фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол (PI); гликолипиды; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин и сфингогликолипиды (также известны как 1-церамидил глюкозиды), такие как церамид галактопиранозид, ганглиозиды и цереброзиды; жирные кислоты, стерины, содержащие группу карбоновой кислоты, например, холестерин; 1, 2-диацил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, в том числе, но ими не ограничиваясь, 1,2-диолеилфосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-дигексадецилфосфоэтаноламин (DHPE), 1,2-дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), 1,2-дипалмитоил фосфатидилхолин (DPPC) и 1,2-димиристоилфосфатидилхолин (DMPC). Липиды могут также включать различные природные производные липидов (например, L-альфа-фосфатидил из ткани: яичный желток, сердце, мозг, печень, соя) и/или синтетические производные липидов (например, насыщенные и ненасыщенные 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфолхолины, 1-ацил-2-ацил-sn-глицеро-3-фосфохолины, 1,2-дигептаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин).

Подходящие катионные липиды включают, но не ограничиваются ими, N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметил соль аммония, также называемые липидами TAP, например, соль метилсульфат. Подходящие липиды TAP включают, но не ограничиваются ими, DOTAP (диолеоил-), DMTAP (димиристоил-), DPTAP (дипальмитоил-) и DSTAP (дистеароил-). Подходящие катионные липиды в липосома включают, но ими не ограничивают, диметилдиоктадецил бромид аммония (DDAB), 1,2-диацилокси-3-триметиламмония пропаны, N-[1-(2,3-диолоилокси)пропил]-Ν,Ν-диметиламин (DODAP), пропаны 1,2-диацилокси-3-диметиламмония, N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA), 1,2-диалкилокси-3-диметиламмония пропаны, диоктадециламидоглицилспермин (DOGS), 3 -[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (DC-Chol); 2,3-диолеилокси-N-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметил-1-пропанаминия трифторацетат (DOSPA), β-аланил холестерин, цетил триметил аммония бромид (CTAB), диC₁₄-амидин, N-трет-бутил-N'-тетрадецил-3-тетрадециламинопропионамидин, N-(альфа-триметиламмониoацетил)дидодецил-D-глютамат хлорид (TMAG), дитетрадеканоил-N-(триметиламмоний-ацетил)диэтаноламин хлорид, 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламид (DOSPER) и N,N,N',N'-тетраметил-, N'-бис(2-гидроксилэтил)-2,3-диолеоилокси-1,4-бутандиаммоний йодид. В одном из вариантов осуществления катионные липиды могут быть производными 1-[2-(ацилокси)этил]2-алкил(алкенил)-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиний хлорида, например, 1-[2-(9(Z)-октадеценоилокси)этил]-2-(8(Z)-гептадеценил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиния хлорид (DOTIM) и 1-[2-(гексадеканоилокси)этил]-2-пентадецил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиний хлорид (DPTIM). В одном из вариантов осуществления катионные липиды могут представлять собой 2,3-диалкилоксипропил производные четвертичного аммонийное соединения, содержащие гидроксиалкильную молкулу на четвертичном амине, например, 1,2-диолеоил-3-диметил-гидроксиэтил аммоний бромид (DORI), 1,2-диолеолилоксипропил-3-диметил-гидроксиэтил аммоний бромид (DORIE), 1,2-диолеоилоксипропил-3-диметил-гидроксипропил аммоний бромид (DORIE-HP), 1,2-диолеоил-окси-пропил-3-диметил-гидроксибутил аммоний бромид (DORIE-HB), 1,2-диолеоилоксипропил-3-диметил-гидроксипентил аммоний бромид (DORIE-Hpe), 1,2-димиристилоксипропил-3-диметил-гидроксилэтил аммоний бромид (DMRIE), 1,2-дипальмитоксипропил-3-диметил-гидроксиэтил аммоний бромид (DPRIE) и 1,2-дистерилоксипропил-3-диметил-гидроксиэтил аммоний бромид (DSRIE).

Подходящие твердые липиды включают, но ими не ограничиваются, высоко насыщенные спирты, высшие жирные кислоты, сфинголипиды, синтетические сложные эфиры и моно-, ди- и триглицериды высших насыщенных жирных кислот. Твердые липиды могут включать алифатические спирты, имеющие 10-40, например, 12-30 атомов углерода, такие как цетостеариловый спирт. Твердые липиды могут включать высшие жирные кислоты из 10-40, например, 12-30 атомов углерода, такие как стеариновая кислота, пальмитиновая кислота, декановая кислота и бегеновая кислота. Твердые липиды могут включать глицериды, в том числе моноглицериды, диглицериды и триглицериды, высшие насыщенные жирные кислоты, имеющие 10-40, например, 12-30 атомов углерода, такие как моностеарат глицерина, бегенат, пальмитостеарат глицерина, глицерина, трилаурат трикаприн, трилаурин, тримиристин, трипальмитин, тристеарин и гидрогенизированное касторовое масло. Подходящие твердые липиды могут включать цетилпальмитат, пчелиный воск или циклодекстрин.

Амфифильные соединения включают, но ими не ограничиваются, фосфолипиды, такие как 1,2 дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диарахидоилфосфатидилхолин (DAPC), дибехеноилфосфатидилхолин (DBPC), дитрикозаноилфосфатидилхолин (DTPC) и дилигноцероилфатидилхолин (DLPC), включенные при соотношении от 0,01 до 60 (масса липида /масс. полимера), например, от 0,1 до 30 (масса липида/масс. полимера). Фосфолипиды, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ими, фосфатидные кислоты, фосфатидилхолины с насыщенными и ненасыщенными липидами, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилглицерины, фосфатидилсерины, фосфатидилинозитолы, производные лизофосфатидила, кардиолипин и β-ацил-Y-алкилфосфолипиды. Примеры фосфолипидов включают, но ими не ограничиваются, фосфатидилхолины, такие как диолеоилфосфатидилхолин, димиристоилфосфатидилхолин, дипентадеканоилфосфатидилхолин лилауроилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диарахидоилфосфатидилхолин (DAPC), дибегеноилфосфатидилхолин (DBPC), дитрикозаноилфосфатидилхолин (DTPC), дилигноцероилфатидилхолин (DLPC); и фосфатидилэтаноламины, такие как диолеоилфосфатидилэтаноламин или 1-гексадецил-2-пальмитоилглицерофосфоэтаноламин. Также могут быть использованы синтетические фосфолипиды с асимметричными ацильными цепями (например, с одной ацильной цепью из 6 атомов углерода и другой ацильной цепи из 12 атомов углерода).

D. Дополнительные активные средства

Частицы могут содержать один или несколько дополнительных активных средств, кроме тех, которые присутствуют в конъюгатах. Дополнительные активные вещества быть терапевтическими, профилактическими, диагностическими или питательными средствами, перечисленными выше. Дополнительные активные средства присутствовать в любом количестве, например, от приблизительно 0,5% до приблизительно 90%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 50%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 25%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 20%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 10%, или от приблизительно 5% до приблизительно 10% (масс./масс.) в расчете на массу частицы. В одном из вариантов осуществления средства включены в количестве от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% нагруженной масс./масс.

Е. Дополнительные нацеливающие молекулы

Частицы могут содержать одну или более нацеливающих молекул, нацеливающих частицы на конкретный орган, ткань, клеточный тип или субклеточный компартмент, кроме нацеливающей молекулы конъюгата. Дополнительные нацеливающие молекулы могут присутствовать на поверхности частицы, на внутренней поверхности частицы, или на обоих поверхностях. Дополнительные нацеливающие молекулы могут быть иммобилизованы на поверхности частицы, например, могут быть ковалентно присоединены к полимеру или липиду в частице. В некоторых вариантах осуществления дополнительные нацеливающие молекулы ковалентно присоединены к амфифильному полимеру или липиду, так, чтобы нацеливающие молекулы ориентированы на поверхности частицы.

IV. Составы

В некоторых вариантах осуществления композиции вводят людям, пациентам-людям или индивидуумам. Для целей настоящего описания фраза «активный ингредиент» как правило относится к конъюгату или частицам, содержащим конъюгаты, которые доставляют, как описано в настоящем документе.

Хотя описания фармацевтических композиций, представленные в настоящем описании, главным образом относятся к фармацевтическим композициям, которые пригодны для введения человеку, как будет понятно специалисту в данной области, такие композиции, как правило, пригодны для введения любому животному, например, млекопитающим. Модификации фармацевтических композиций, подходящих для введения человеку, для того, чтобы сделать композиции подходящими для введения различным животным, хорошо известны, и и специалист в области ветеринарной фармакологии сможет создать и/или осуществить такую модификацию в пределах обычного, если требуется, экспериментирования. Индивидуумы, для которых рассматривается введение фармацевтических композициях, включают, но ими не ограничиваются, людей и/или других приматов; млекопитающих, в том числе коммерчески значимых млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, собаки, кошки, мыши и/или крысы; и/или птицы, в том числе коммерчески значимые птицы, такие как домашняя птица, куры, утки, гуси и/или индейки.

Составы фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, могут быть получены любым способом, известным или в будущем разработанным в области фармакологии. В целом, такие способы получения включают стадию приведения активного ингредиента в ассоциацию со вспомогательным веществом и/или одним или несколькими другими вспомогательными ингредиентами, а затем, если необходимо и/или желательно, разделения, формирования и/или упаковки продукта в желаемую единичную стандартную дозу или в мультидозу.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена, упакована и/или продаваться партией, в виде единичной стандартной дозы и/или в виде множества единичных стандартных доз. Как используется в настоящем описании, «стандартная доза» является дискретным количеством фармацевтической композиции, содержащим заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента, как правило, равно дозе активного ингредиента, которую можно вводить индивиду и/или подходящей фракции такой дозировки, например, половине или одной третей такой дозировки.

Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества и/или каких-либо дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с изобретением, будет изменяться в зависимости от идентичности, размер и/или состояние субъекта лечат, и в дальнейшем в зависимости от пути, по которому композицию необходимо вводить. Например, композиция может содержать от 0,1% до 100%, например, от5 до 50%, от 1 до 30%, от 5 до 80%, по крайней мере 80% (масс./масс.) активного ингредиента.

Конъюгаты или частицы по настоящему изобретению могут быть получены, используя один или более вспомогательных веществ, для: (1) повышения стабильности; (2) обеспечения замедленного или пролонгированного высвобождения (например, из депо-состава наномалеимида); (3) изменения биораспределения (например, нацеливание мономалеимидных соединений в конкретные ткани или типы клеток); (4) изменения профиля высвобождения мономалеимидных соединений in vivo. Неограничивающие примеры вспомогательных веществ включают любой растворитель, дисперсионную среду, разбавитель или другой жидкий носитель, агент диспергирования или суспендирования, поверхностно-активный агент, изотонический агент, загуститель или эмульгатор, и консервант. Вспомогательные вещества по настоящему изобретению могут также включать, без ограничения, липидоиды, липосомы, липидные наночастицы, полимеры, липоплексы, наночастицы «ядро-оболочка», пептиды, белки, гиалуронидазу, имитацию наночастиц и их комбинации. Соответственно, составы по настоящему изобретению могут включать один или более вспомогательных веществ, каждый в количестве, которое совместно повышает стабильность мономалеимидных соединений.

Вспомогательные вещества

Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое, как используется в настоящем описании, включает любой растворитель, дисперсионную среду, разбавитель или другой жидкий носитель, агент диспергирования или суспендирования, поверхностно-активный агент, изотонический агент, загуститель или эмульгатор, консервант, твердый связующий агент, лубрикант и тому подобное, подходящие для конкретной желаемой лекарственной формы. В Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21-ое издание, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; включенные в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) раскрыты различные вспомогательные вещества, используемые для получения фармацевтических композиций, и известные способы их получения. За исключением случаев, когда любое обычное вспомогательное вещество несовместимо с веществом или его производным, например, за счет создания какого-либо нежелательного биологического эффекта или другого вредного взаимодействия с любым другим компонентом(ами) фармацевтической композиции, его использование предусмотрено в объеме настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество имеет по крайней мере 95%, по крайней мере, 96%, по крайней мере, 97%, по крайней мере, 98%, по крайней мере, 99% или 100% чистоту. В некоторых вариантах осуществления, вспомогательное вещество одобрено для применения в организме человека и для ветеринарного применения. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество одобрено the United States Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, США). В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество имеет фармацевтическую степень чистоты. В некоторых вариантах осуществления, вспомогательное вещество отвечает стандартам Фармакопеи США (USP), Европейской фармакопеи (EP), Британской фармакопеи и/или Международной Фармакопеи.

Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, используемые для получения фармацевтических композиций, включают, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, диспергирующие и/или гранулирующие агенты, поверхностно-активные вещества и/или эмульгаторы, разрыхлители, связующие вещества, консерванты, буферные агенты, смазывающие агенты и/или масла. Такие вспомогательные вещества могут необязательно быть включены в фармацевтические композиции.

Характерные разбавители включают, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, дикальция фосфат, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, фосфат натрия, лактозу, сахарозу, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, инозит, хлорид натрия, сухой крахмал, кукурузный крахмал, сахарную пудру и тому подобное и/или их комбинации.

Характерные агенты гранулирования и/или диспергирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, картофельный крахмал, кукурузный крахмал, крахмал из тапиоки, натрия гликолят крахмала, глины, альгиновую кислоту, гуаровую камедь, мякоть цитрусовых, агар, бентонит, целлюлозу и продукты древесины, натуральную губку, катионообменные смолы, карбонат кальция, силикаты, карбонат натрия, поперечно-сшитый поли(винилпирролидон) (кросповидон), натрия карбоксиметил крахмала (натрия гликолят крахмала), карбоксиметил целлюлозу, поперечно-сшитую карбоксиметилцеллюлозу натрия (кроскармеллоза), метилцеллюлоуа, прежелатинизированный крахмал (крахмал 1500), микрокристаллический крахмал, нерастворимый в воде крахмал, карбоксиметилцеллюлозу кальция, алюмосиликат магния (VEEGUM®), лаурилсульфат натрия, четвертичные аммониевые соединения и тому подобное и/или их комбинации.

Характерные поверхностно-активные агенты и/или эмульгаторы включают, но не ограничиваются ими, природные эмульгаторы (например, гуммиарабик, агар, альгиновая кислота, альгинат натрия, трагакант, ирландский мох, холестерин, ксантан, пектин, желатин, яичный желток, казеин, ланолин, холестерин, воск и лецитин), коллоидные глины, (например, бентонит [силикат алюминия] и VEEGUM® [алюмосиликат магния]), длиноцепочечные производные аминокислот, высокомолекулярные спирты (например, стеариловый спирт, цетиловый спирт, олеиловый спирт, триацетин моностеарат, этиленгликоль дистеарат, глицерил моностеарат и пропиленгликоль моностеарат, поливиниловый спирт), карбомеры (например, карбоксиполиметилен, полиакриловая кислота, полимер акриловой кислоты и карбоксивиниловый полимер), каррагинан, производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза натрия, порошообразная целлюлоза, гидроксиметил целлюлоза, гидроксипропил целлюлоза, гидроксипропил метилцеллюлоза, метилцеллюлоза), сложные эфиры сорбита и жирных кислот (например, полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат [TWEEN®20], полиоксиэтиленсорбитан [TWEEN®60], полиоксиэтиленсорбит [TWEEN®80], сорбитанмонопальмитат [SPAN®40], сорбитанмоностеарат [SPAN®60], сорбитантристеарат [SPAN®65], глицерилмоноолеат, сорбитанмоноолеоат [SPAN®80]), полиоксиэтиленовые эфиры (например, полиоксиэтиленмоностеарат [MYRJ®45], полиэтоксилированное касторовое масло, полиоксиметиленстеарат и Solutol®), сложные эфиры сахарозы и жирных кислот, сложные эфиры полиэтиленгликоля и жирных кислот (например, Cremophor®), полиоксиэтиленовые эфиры, (например, лауриловый эфир полиоксиэтилена [BRIJ®30]), поли(винилпирролидон), диэтиленмонолаурат, триэтаноламинолеат, олеат натрия, олеат калия, этилолеат, олеиновая кислота, этиловый эфир лаурата, лаурилсульфат натрия, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, цетримония бромид, хлорид цетилпиридиния, хлорид бензалкония, докузат натрия, и тому подобное и/или их комбинации.

Характерные связующие агенты включают, но не ограничиваются ими, крахмал (например, кукурузный крахмал и крахмальный клейстер); желатин; сахара (например, сахароза, глюкоза, декстроза, декстрин, патока, лактозу, лактит, маннит); природные и синтетические смолы (например, аравийская камедь, альгинат натрия, экстракт ирландского мха, камедь Panwar, камедь гхатти, слизь из шелухи isapol, карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, ацетат целлюлозы, поли(винилпирролидон), алюмосиликат магния (Veegum®), и арабогалактан лиственницы); альгинаты; полэтиленоксид; полиэтиленгликоль; неорганические соли кальция; кремниевую кислоту; полиметакрилаты; воски; воду; спирт; и тому подобное; и их комбинации.

Характерные консерванты могут включать, но не ограничиваются ими, антиоксиданты, хелатирующие агенты, консерванты, антимикробные консерванты, противогрибковые консерванты, спиртовые консерванты, кислотные консерванты и/или другие консерванты. Характерные антиоксиданты включают, но ими не ограничиваются, альфа-токоферол, аскорбиновую кислоту, акорбил пальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, монотиоглицерин, метабисульфит калия, пропионовую кислоту, пропилгаллат, аскорбат натрия, бисульфит натрия, метабисульфит натрия и/или сульфит натрия. Характерные хелатирующие агенты включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), моногидрат лимонной кислоты, динатрий эдетат, дикалий эдетат, этилендиаминтетрауксусную кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту, фосфорную кислоту, эдетат натрия, винную кислоту и/или тринатрийфосфат эдетат. Характерные антимикробные консерванты включают, но ими не ограничиваются, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, бензиловый спирт, бронопол, цетримид, хлорид цетилпиридиния, хлоргексидин, хлорбутанол, хлоркрезол, хлорксиленол, крезол, этиловый спирт, глицерин, гексетидин, имидмочевину, фенол, феноксиэтанол, фенилэтиловый спирт, фенил-ртути нитрат, пропиленгликоль и/или тимеросал. Характерые противогрибковые консерванты включают, но не ограничиваются ими, бутил парабен, метил парабен, этил парабен, пропил парабен, бензойную кислоту, гидроксибензойную кислоту, бензоат калия, сорбат калия, бензоат натрия, пропионат натрия и/или сорбиновую кислоту. Характерные спиртовые консерванты включают, но не ограничиваются ими, этанол, полиэтиленгликоль, фенол, фенольные соединения, бисфенол, хлорбутанол, гидроксибензоат и/или фенилэтиловый спирт. Характерные кислотные консерванты включают, но ими не ограничиваются, витамин А, витамин С, витамин Е, бета-каротин, лимонную кислоту, уксусную кислоту, дегидроуксусную кислоту, аскорбиновую кислоту, сорбиновую кислоту и/или фитиновую кислоту. Другие консерванты включают, но ими не ограничиваются, токоферол, токоферол ацетат, детероксим мезилат, цетримид, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), этилендиамин, натрия лаурилсульфат (SLS), натрия лауриловый эфир сульфат (SLES), натрия бисульфит, натрия метабисульфит, калия сульфит, калия метабисульфит, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, метилпарабен, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ и/или EUXYL®.

Примеры буферных агентов включают, но ими не ограничиваются, раствор цитратного буфера, растворы ацетатного буфера, растворы фосфатного буфера, аммоний хлорид, кальция карбонат, кальция хлорид, кальция цитрат, кальция глюбионат, кальция глюцептат, кальция глюконат, D-глюконовую кислоту, кальция глицерофосфат, кальция лактат, пропановую кислоту, кальция левулинат, пентановую кислоту, двухосновный кальция фосфат, фосфорную кислоту, трехосновный кальция фосфат, кальция гидроксид фосфат, калия ацетат, калия хлорид, калия глюконат, смеси калия, двухосновый калия фосфат, моноосновный калия фосфат, смеси калия фосфата, натрия ацетат, натрия бикарбонат, натрия хлорид, натрия цитрат, натрия лактат, двухосновный натрия фосфат, моноосновный натрия фосфат, смеси натрия фосфата, трометанамин, магния гидрохлорид, алюминия гидроксид, альгиновую кислоту, апирогенную воду, изотонический солевой раствор, раствор Рингера, этиловый спирт, и тому подобное и/или их комбинации.

Примеры смазывающих агентов включают, но ими не ограничиваются ими, стеарат магния, стеарат кальция, стеариновую кислоту, диоксид кремния, тальк, солод, глицерилбегенат, гидрированные растительные масла, полиэтиленгликоль, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, лейцин, лаурилсульфат магния, лаурилсульфат натрия и тому подобное, а также их комбинации.

Характерные масла включают, но не ограничиваются ими, миндальное, масло абрикосовых косточек, авокадо, бабассу, бергамот, семян черной смородины, огуречника аптечного, можжевельника, ромашки, рапсовое масло, тмина, карнаубское, касторовое, корицы, какао-масла, кокосовое, рыбий жир, кофе, кукурузное, хлопковое, эму, эвкалиптовое, примулы вечерней, из рыбы, льняного семени, гераниола, тыквенное, виноградных косточек, фундука, иссопа, изопропил миристат, жожоба, кукуй ореха, масло лавандин, лаванды, лимона, литсеи кубеба, ореха макадамия, мальвы, семян манго, семян пенника лугового, жир норки, масло мускатного ореха, оливковое, апельсиновое, хоплостета, пальмовое, ядер кокосового ореха, ядер персика, арахиса, семян мака, семян тыквы, рапсовое, рисовых отрубей, розмарина, сафлоровое, масло сандалового дерева, сасанквы, чабера, облепиховое, кунжутное масло, масло ши, силикон, соевое, подсолнечное масло, масло чайного дерева, чертополоха, цубаки, ветивера, грецкого ореха и масло зародышей пшеницы. Характерные масла включают, но не ограничиваются ими, бутил стеарат, каприловой триглицерид, каприновый триглицерид, циклометикон, диэтилсебацинат, диметикон 360, изопропил миристат, минеральное масло, октилдодеканол, олеиловый спирт, силиконовое масло и/или их комбинации.

Вспомогательные вещества, такие как масло какао и воска для суппозиториев, окрашивающие агенты, агенты для нанесения покрытий, подсластители, вкусовые добавки и/или ароматизаторы могут присутствовать в композиции в соответствии с решением составителя рецептуры.

Введение

Конъюгаты или частицы по настоящему изобретению могут быть введены любым путем, который приводит к терапевтически эффективному результату. К ним относятся, но не ограничиваются ими, энтеральный, гастроэнтеральный, эпидуральной, пероральный, трансдермальный, эпидуральный (перидуральный), внутрицеребральный (в головной мозг), интрацеребровентрикулярный (в желудочки мозга), накожный (нанесение на кожу), внутрикожный (в кожу), подкожный (под кожу) пути введения, назальное введение (через нос), внутривенное (в вену), внутриартериальное (в артерию), внутримышечное (в мышцу), внутрисердечное (в сердце), внутрикостная инфузия (в костный мозг), интратекальное (в спинномозговой канал), внутрибрюшинное (инфузии или инъекции в брюшину) введение, внутрипузырная инфузия, интравитреальное (через глаз) введение, интракавернозная инъекция (в основание полового члена), интравагинальное введение, внутриматочные, экстра-амниотическое введение, чрезкожное (диффузия через неповрежденную кожу для системного распределения) введение, введение через слизистую оболочку (диффузия через слизистую оболочку), вдувание (вдыхание носом), сублингвальное введение, сублабиальное введение, клизмы, глазные капли (на конъюнктиву) или ушные капели. В конкретных вариантах осуществления композиции могут быть введены таким образом, что пересекать гематоэнцефалический барьер, сосудистый барьер или другой эпителиальный барьер.

Композиции, описанные в настоящем документе, содержат эффективное количество конъюгатов или частиц в фармацевтическом носителе, подходящем для введения индивидууму, при необходимости. Препараты могут быть введены парентерально (например, путем инъекции или инфузии). Составы или их вариации могут быть введены любым способом, включая энтеральный, местный (например, в глаз) или посредством пульмонарного введения. В некоторых вариантах осуществления композиции применяют местно.

Парентеральные составы

Частицы могут быть получены для парентеральной доставки, такой как инъекции или инфузии, в форме раствора, суспензии или эмульсии. Препарат можно вводить системно, регионально или непосредственно в орган или ткань, в отношении которых проводится лечение.

Парентеральные композиции могут быть получены в виде водных композиций, используя методики, известные в данной области. Как правило, такие композиции могут быть получены в виде инъецируемых составов, например, растворов или суспензий; твердых форм, подходящих для использования для получения растворов или суспензий при добавлении восстанавливающей среды перед инъекцией; эмульсий, таких как вода в масле (в/м), масло в воде (м/в), и их микроэмульсий, липосом или эмульсом.

Носителем может быть растворителем или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, один или более полиолов (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), масла, такие как растительные масла (например, арахисовое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и тому подобное), а также их комбинации. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, за счет использования агента покрытия, такого как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсий и/или используя поверхностно-активные вещества. В некоторых случаях изотонический агент включает, например, один или более сахаров, хлорид натрия или другой подходящий агент, известный в данной области.

Растворы и дисперсии частиц могут быть получены в воде или другом растворителе или дисперсионной среде, подходящим образом смешанной с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, включая, но не ограничиваясь ими, поверхностно-активные вещества, диспергаторы, эмульгаторы, рН модифицирующие агенты и их комбинации.

Подходящие поверхностно-активные агенты могут быть анионными, катионными, амфотерными или неионными поверхностно-активными агентами. Подходящие анионные поверхностно-активные агенты включают, но не ограничиваются ими, агенты, которые содержат ионы карбоксилата, сульфоната и сульфата. Примеры анионных поверхностно-активных агентов включают натрий, калий, аммоний, алкилсульфонаты с длинной цепью и алкил арил сульфонаты, такие как натрий додецилбензол сульфонат; диалкил натрия сульфосукцинаты, такие как натрий дедецилбензол сульфонат; диалкил натрий сульфосукцинаты, такие как натрий бис-(2-этилтиоксил)сульфосукцинат; и алкил сульфаты, такие как лаурилсульфат натрия. Катионные поверхностно-активные агенты включают, но не ограничиваются ими, соединения четвертичного аммония, такие как хлорид бензалкония, хлорид бензетония, цетримониум бромид, стеарил диметилбензил аммоний хлорид, полиоксиэтилен и кокосовый амин. Примеры неионных поверхностно-активных агентов включают этиленгликоль моностеарат, пропиленгликоль миристат, глицерил моностеарат, глицерил стеарат, полиглицерил-4-олеат, сорбитан ацилат, сахароза ацилат, ПЭГ-150 лаурат, ПЭГ-400 монолаурат, полиоксиэтилен монолаурат, полисорбаты, полиоксиэтилен октилфениловый эфир, ПЭГ -1000 цетиловый эфир, полиоксиэтилен тридециловый эфир, полипропленгликоль бутиловый эфир, Poloxamer® 401, стеароил моноизопропаноламид и полиоксиэтилен гидрированные жирный амид. Примеры амфотерных поверхностно-активных агентов включают натрий N-додецил-β-аланин, натрий N-лаурил-β-иминодипропионат, миристоамфоацетат, лаурил бетаин и лаурил сульфобетаин.

Состав может содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Подходящие консерванты включают, но не ограничиваются ими, парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту и тимеросал. Состав может также содержать антиоксидант для предотвращения деградации активного агента (ов) или частиц.

Состав, как правило, буферизован до рН 3-8 для парентерального введения при восстановлении. Подходящие буферы включают, но не ограничиваются ими, фосфатные буферы, ацетатные буферы и цитратные буферы. При использовании 10% сахарозы или 5% декстрозы буфер может не требоваться.

В композициях для парентерального введения часто используют растворимые в воде полимеры. Подходящие водорастворимые полимеры включают, но ими не ограничиваются, поливинилпирролидон, декстран, карбоксиметилцеллюлозу и полиэтиленгликоль.

Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем введения частиц в требуемом количестве в соответствующем растворителе или в диспергирующей среде с одним или несколькими вспомогательными веществами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают путем введения различных стерилизованных частиц в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций, примеры способов получения включают сушку вакуумом или вымораживанием, которые дают порошок частиц плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Порошки могут быть получены таким образом, что частицы являются пористыми по своей природе, что может повысить растворение частиц. Способы получения пористых частиц известны в данной области.

Фармацевтические композиции для парентерального введения могут быть в форме стерильного водного раствора или суспензии частиц, образованной из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство. Подходящие растворители включают, например, воду, раствор Рингера, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и изотонический раствор хлорида натрия. Состав также может быть стерильным раствором, суспензией или эмульсией в нетоксичном, приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, таком как 1,3-бутандиол.

В некоторых случаях состав распространяется или упаковывается в жидкой форме. Альтернативно, составы для парентерального введения могут быть упакованы в виде твердого вещества, полученного, например, путем лиофилизации подходящей жидкой композиции. Твердое вещество может быть восстановлено с подходящим носителем или разбавителем перед введением.

Растворы, суспензии или эмульсии для парентерального введения могут быть забуферены эффективным количеством буфера, необходимым для поддержания рН, подходящего для глазного введения. Подходящие буферы хорошо известны специалистам в этой области и некоторые примеры используемых буферов представляет собой ацетат, борат, карбонат, цитрат и фосфатные буферы.

Растворы, суспензии или эмульсии для парентерального введения также могут содержать один или несколько тонизирующих агентов для регулирования изотонического диапазона состава. Подходящие тонизирующие агенты хорошо известны в данной области, и некоторые примеры включают глицерин, сахарозу, декстрозу, маннит, сорбит, хлорид натрия и другие электролиты.

Растворы, суспензии или эмульсии для парентерального введения также могут содержать один или несколько консервантов для предотвращения бактериального загрязнения офтальмологических препаратов. Подходящие консерванты известны в данной области и включают полигексаметиленбигуанидин (PHMB), хлорид бензалкония (BAK), стабилизированный оксихлоркомплексы (иначе известные как Purite®), фенил-ртуть-ацетат, хлорбутанол, сорбиновую кислоту, хлоргексидин, бензиловый спирт, парабены, тимеросал и их смеси.

Растворы, суспензии или эмульсии для парентерального введения могут также содержать один или более вспомогательных веществ, известных в данной области, таких как диспергирующие агенты, смачивающие агенты и суспендирующие агенты.

B. Составы для местного нанесения на слизистую

Частицы могут быть входить в состав для местного нанесения на поверхность слизистой оболочки. Подходящие лекарственные формы для местного применения включают кремы, мази, бальзамы, спреи, гели, лосьоны, эмульсии, жидкости и трансдермальные пластыри. Состав может быть получен для трансмукозального, трансэпителиального или трансэндотелиального введения. Композиции содержат один или несколько химических усилителей проникновения, агентов для проницаемости мембран, агентов мембранного транспорта, смягчающих агентов, поверхностно-активные веществ, стабилизаторов и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления частицы могут быть введены в виде жидкого препарата, такого как раствор или суспензия, полутвердого состава, например, лосьон или мазь, или твердого состава. В некоторых вариантах осуществления частицы получают в виде жидкостей, в том числе растворов и суспензий, таких как глазные капли, или полутвердых составов, для слизистой оболочки, например, глаз или для вагинального или ректального применения.

«Поверхностно-активные агенты» являются поверхностно-активными агентами, которые снижают поверхностное натяжение и тем самым увеличивают эмульгирующие, вспенивающие, диспергирующие, распространяющие и смачивающие свойства продукта. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают эмульгирующий воск, глицерил моноолеат, полиоксиэтиленовые произодные касторового масла, полисорбат, сложные эфиры сорбита, бензиловый спирт, бензил бензоат, циклодекстрины, глицерина моностеарат, полоксамер, повидон и их комбинации. В одном из вариантов осуществления неионное поверхностно-активное вещество представляет собой стеариловый спирт.

«Эмульгаторы» представляет собой поверхностно-активные вещества, которые способствуют суспендированию одной жидкости в другой и способствуют образованию стабильной смеси или эмульсии масло в воде. Обычными эмульгаторами являются: металлические мыла, некоторые животные и растительные масла, а также различные полярные соединения. Подходящие эмульгаторы включают акацию, анионный эмульгирующий воск, кальция стеарат, карбомеры, цетостеариловый спирт, цетиловый спирт, холестерин, диэтаноламин, этиленгликоль пальмитостеарат, глицерина моностеарат, глицерил моноолеат, гидроксипропил целлюлозу, гипромеллозу, ланолин, гидратированный, ланолиновые спирты, лецитин, триглицериды со средней цепью, метилцеллюлозу, минеральное масло и ланолиновые спирты, одноосновной фосфат натрия, моноэтаноламин, неионный эмульгирующий воск, олеиновую кислоту, полоксамер, полоксамеры, алкиловые эфиры полиоксиэтилена, полиоксиэтиленовые производные касторового масла, полиоксиэтиленовые сорбитановые эфиры жирных кислот, полиоксиэтилен стеараты, пропилен альгинат, самоэмульгирующийся глицерилмоностеарат, натрия цитрата дигидрат, лаурилсульфат натрия, сложные эфиры сорбита, стеариновая кислота, подсолнечное масло, трагакант, триэтаноламин, ксантановую камедь и их комбинации. В одном из вариантов осуществления эмульгатор представляет собой стеарат глицерина.

Подходящие классы усилителей проникновения известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, жирные спирты, эфиры жирных кислот, жирные кислоты, эфиры жирных спиртов, аминокислоты, фосфолипиды, лецитины, холатные соли, ферменты, амины и амиды, комплексообразующие агенты (липосомы, циклодекстрины, модифицированные целлюлозы и диимиды), макроциклические вещества, такие как макроциклические лактоны, кетоны и ангидриды и циклические мочевины, поверхностно-активные вещества, N-метил пирролидон и их производные, DMSO и родственные соединения, ионные соединения, азон и родственные соединения, и растворители, такие как спирты, кетоны, амиды, полиолы (например, гликоли). Примеры таких классов известны в данной области.

Дозирование

Настоящее изобретение относится к способам, включающим введение конъюгатов или частицы, содержащим конъюгат, как описано в настоящем описании, индивидууму, при необходимости. Конъюгаты или частицы, содержащие конъюгаты, как описано в настоящем документе, могут быть введены индивидууму, используя любое количество и любой путь введения, эффективный для профилактики или лечения или визуализации заболевания, расстройства и/или состояния (например, заболевания, расстройства и/или состояния, связанного с дефицитом кратковременной памяти). Точное требуемое количество будет изменяться в зависимости от индивидуума, в зависимости от вида, возраста и общего состояния индивидуума, тяжести заболевания, конкретной композиции, способа ее введения, режима активности, и тому подобного.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением, как правило, находятся в единичной дозированной форме для простоты введения и однородности дозы. Следует понимать, однако, что общее ежедневное применение композиций по настоящему изобретению, может быть определено лечащим врачом в рамках врачебного мнения. Конкретный уровень терапевтически эффективной, профилактически эффективной или соответствующей визуализирующая дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая расстройство, на которое направлено лечение, и тяжесть заболевания; активность конкретного используемого соединения; конкретного используемого соединения; возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и режим питания пациента; времени введения, пути введения и скорости экскреции конкретного используемого соединения; продолжительности лечения; лекарственных средств, используемых в комбинации или совместно с конкретным используемым соединением; и другим факторам, хорошо известным в медицине.

В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению, можно вводить в дозах, достаточных для доставки от приблизительно 0,0001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,005 мг/кг до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 0,005 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, или от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг, массы тела индивидуума в сутки, один или несколько раз в день, для получения желаемого терапевтического, диагностического, профилактического эффекта или для получения изображения. Требуемая доза может быть доставлена три раза в день, два раза в день, один раз в день, каждый день, каждый третий день, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели или через каждые четыре недели. В некоторых вариантах осуществления требуемая доза может быть доставлена, используя множественное введение (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или более введений). Если используется множественное введение, то могут быть использованы разделенные режимы дозирования, такие, как описано в настоящем документе.

Как используется в настоящем описании, «разделенная доза» представляет собой деление единичной стандартной дозы или общей суточной дозы на две или более доз, например, на два или более введений единичной стандартной дозы. Как используется в настоящем описании, «единичная стандартная доза» представляет собой дозу любого терапевтического средства, вводимого в одной дозе/в одно время/одним путем/ в единственной точке контакта, то есть путем единственного события введения. Как используется в настоящем описании «суммарная суточная доза» означает количество, вводимое или прописанное для введения в течение 24 ч. Его можно вводить единичной стандартной дозой. В одном из вариантов осуществления мономалеимидные соединения по настоящему изобретению вводят индивиду разделенными дозами. Эти мономалеимидные соединения могут быть получены только в буфере или введены в составы, как описано выше.

Лекарственные формы

Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, может быть получена в виде лекарственной формы, описанной в настоящем документе, такой как местная, интраназальная, трахеальная или инъекционная (например, внутривенная, внутриглазная, интравитреальная, внутримышечная, внутрисердечная, внутрибрюшинная, подкожная).

Жидкие лекарственные формы

Жидкие лекарственные формы для парентерального введения включают, но ими не ограничиваются, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и/или эликсиры. Кроме активных ингредиентов, жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, воду или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этил карбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензил бензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное), глицерин, спирт тетрагидрофурфурил, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот сорбитана и их смеси. В некоторых вариантах осуществления для парентерального введения композиции могут быть смешаны с солюбилизирующими агентами, такими как Cremophor®, спирты, масла, модифицированные масла, гликоли, полисорбаты, циклодекстрины, полимеры и/или их комбинации.

Препараты для инъекций

Препараты для инъекций, например, стерильные водные или маслянистые суспензии для инъекций, могут быть получены в соответствии с известными в данной области, и могут включать подходящие диспергирующие агенты, смачивающие агенты и/или суспендирующие агенты. Стерильные препараты для инъекций могут представлять собой стерильные растворы, суспензии и/или эмульсии для инъекций в нетоксичных парентерально приемлемых разбавителях и/или растворителях, например, раствор в 1,3-бутандиоле. В числе приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, находятся, но ими не ограничиваются, вода, раствор Рингера, USP и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. С этой целью может быть использовано любое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, могут быть использованы для получения препаратов для инъекций.

Составы для инъекций могут быть стерилизованы, например, фильтрацией сквозь задерживающий бактерии фильтр и/или путем введения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекций перед применением.

Для пролонгации эффект активного ингредиента, может быть желательным замедлить всасывание активного ингредиента из подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть достигнуто за счет использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества с плохой растворимостью в воде. Скорость абсорбции мономалеимидных соединений также зависит от скорости его растворения, что, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, замедление абсорбции парентерально введенного мономалеимидного соединения может быть достигнуто посредством растворения или суспендирования мономалеимида в масляном носителе. Инъекционные депо-формы получают путем образования микроинкапсулированных матриц мономалеимидных соединений в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения мономалеимидных соединений и полимера, а также природы конкретного применяемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения мономалеимидного соединения. Примеры других биодеградируемых полимеров включают, но ими не ограничиваются, поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Составы инъецируемых депо могут быть получены путем захвата мономалеимидных соединений в липосомы, микроэмульсии или наноэмульсии, которые совместимы с тканями организма.

Введение в легкие

Составы, описанные в настоящем документе как используемые для легочной доставки, могут быть также использованы для интраназальной доставки фармацевтической композиции. Еще один состав, подходящий для интраназального введения, может быть порошком крупного помола, содержащим активный ингредиент и имеющий средний размер частиц от приблизительно 0,2 мкм до 500 мкм. Такой состав может быть введен способом, при котором происходит вдыхание носом, то есть путем быстрого вдоха через носовой проход из контейнера с порошком, подносимого близко к носу.

Составы, подходящие для назального введения, могут, например, содержать от приблизительно только 0,1% (масс./масс.) до вплоть до 100% (масс./масс.) активного ингредиента, и могут содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем документе. Фармацевтическая композиция может быть получена, упакована и/или продана в составе, подходящем для буккального введения. Такие составы могут, например, быть в виде таблеток и/или лепешек, полученных с использованием обычных способов, и могут, например, содержать от приблизительно 0,1% до 20% (масс./масс.) активного ингредиента, где остаток может содержать композицию, растворимую и/или разлагаемую во рту, необязательно, один или более дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем документе. С другой стороны, составы, подходящие для буккального введения, могут включать порошок и/или раствор и/или суспензию в виде аэрозоля и/или для распыления. Такие составы в виде порошков, аэрозолей и/или аэрозолированные составы при распылении могут иметь средний размер частиц и/или размер капель в диапазоне от приблизительно 0,1 нм до приблизительно 200 нм, и могут дополнительно включать один или несколько из любых дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем документе.

Общую информацию по составам и/или производству фармацевтических средств можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21-ое издание, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме).

Покрытия или оболочки

Твердые лекарственные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут быть получены с покрытием и оболочками, такими как кишечнорастворимые покрытия и другие виды покрытий, хорошо известные из уровня техники в области фармацевтических препаратов. Они могут необязательно содержать замутнители и могут представлять собой композиции, которые высвобождают активный(е) ингредиент(ы) только или предпочтительно в определенной части желудочно-кишечного тракта, необязательно, замедленным образом. Примеры инкапсулированных композиций, которые могут использоваться, включают полимерные вещества и воски. Кроме того, твердые композиции подобного типа могут использоваться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, используя такие вспомогательные вещества как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и тому подобное.

V. Способы получения частиц

В различных вариантах осуществления способ получения частиц включает предоставление конъюгата; представление основного компонента, такого как PLA-ПЭГ или PLGA-ПЭГ для образования частиц; объединение конъюгата и основного компонента в органическом растворе с образованием первой органической фазы; и объединение первой органической фазы и первого водного раствора с образованием второй фазы; эмульгирование второй фазы с образованием эмульсионной фазы; и выделение частиц. В различных вариантах осуществления эмульсионная фаза дополнительно гомогенизирована. В некоторых вариантах осуществления первая фаза содержит от приблизительно 5 до приблизительно 50% вес, например, от приблизительно 1 до приблизительно 40% сухого вещества, или приблизительно от 5 до приблизительно 30% твердых веществ, например, приблизительно 5%, 10%, 15% и 20%, конъюгата и основного компонента. В некоторых вариантах осуществления первая фаза содержит приблизительно 5% масса конъюгата и основного компонента. В различных вариантах осуществления органическая фаза содержит ацетонитрил, тетрагидрофуран, этилацетат, изопропиловый спирт, ацетат, изопропилдиметилформамид, метиленхлорид, дихлорметан, хлороформ, ацетон, бензиловый спирт, Tween® 80, SPAN® 80, или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления органическая фаза включает бензиловый спирт, этилацетат, или их комбинацию.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения водный раствор включает воду, холат натрия, этилацетат или бензиловый спирт. В различных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество добавляют в первую фазу, вторую фазу, или в обои фазы. Поверхностно-активное вещество, в некоторых случаях, может выступать в качестве эмульгатора или стабилизатора для композиции, описанной в настоящем документе. Подходящее поверхностно-активное вещество может быть катионным поверхностно-активным веществом, анионным поверхностно-активным веществом или неионных поверхностно-активных веществом. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество, подходящее для получения композиции, описанной в настоящем изобретении, включает сложные эфиры жирных кислот, эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирных кислот и полиоксиэтиленстеараты. Примеры таких эфиров жирных кислот, являющихся неионными поверхностно-активными веществами, представляют собой поверхностно-активные вещества TWEEN® 80, SPAN® 80 и MYJ® от ICI. Поверхностно-активные вещества SPAN® включают моноэфиры C₁₂-С₁₈ сорбита. Поверхностно-активные вещества TWEEN® включают моноэфиры поли(этиленоксид)C₁₂-С₁₈ сорбита. Поверхносно-активные вещества MYJ® включают поли(этиленоксид)стеараты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения водный раствор также содержит поверхностно-активное вещество (например, эмульгатор), в том числе полисорбат. Например, водный раствор может включать полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления подходящее поверхностно-активное вещество включает поверхностно-активное вещество на основе липида. Например, композиция может включать 1,2-дигксаноил-sn-глицеро-3-фосфоoхолин, 1,2-дигептаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин, ПЭГилированный 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфофоэтаноламин (в том числе PEG5000-DSPE), ПЭГилированный 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (в том числе 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси(полиэтиленгликоль)-5000] (соль аммония)).

Эмульгирование второй фазы с образованием эмульсионной фаза может быть осуществлена в одну или две стадии эмульгирования. Например, первичная эмульсия может быть получена, а затем эмульгирована с образованием тонкой эмульсии. Первичная эмульсия может быть образована, например, используя простое смешивание, гомогенизатор высокого давления, ультразвуковой зонд, мешалку или роторно-статорный гомогенизатор. Первичная эмульсия может быть преобразована в тонкую эмульсию посредством использования, например, ультразвукового зонда или гомогенизатора высокого давления, например, пропуская один или несколько раз через гомогенизатор. Например, при использовании гомогенизатора высокого давления используемое давление может составлять от приблизительно 4000 до приблизительно 8000 фунтов на квадратный дюйм, приблизительно 4000 до приблизительно 5000 фунтов на квадратный дюйм, или 4000 или 5000 фунтов на квадратный дюйм.

Может потребоваться либо выпаривание растворителя, либо разбавление для завершения экстракции растворителя и затвердевания частиц. Для лучшего контроля кинетики экстракции и более масштабного процесса может быть использовано разбавление растворителя посредством гашения водой. Например, эмульсия может быть разведена в холодной воде до концентрации, достаточной для растворения всего органического растворителя с образованием фазы гашения. Гашение может быть выполнено, по крайней мере частично, при температуре приблизительно 5°С или ниже. Например, вода, используемая для гашения, может быть при температуре, которая меньше чем комнатная температура (например, от приблизительно от 0 до приблизительно 10°С или от приблизительно 0 до приблизительно 5°С).

В различных вариантах осуществления частицы выделяют путем фильтрации. Например, могут быть использованы мембраны для ультрафильтрации. Характерная фильтрация может быть осуществлена, используя систему фильтрации с тангенциальным потоком. Например, при использовании мембраны с размером пор, подходящим для удержания частиц и обеспечивая пропускание раствора, мицелл и органического растворителя, частицы могут быть селективно разделены. Могут быть использованы характерные мембраны с ограничителем молекулярной массы, равной приблизительно 300-500 кДа (-5-25 нм).

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения частицы являются сублимированными или лиофилизированными, в некоторых случаях, для увеличения срока их годности при хранении. В некоторых вариантах осуществления композиция также включает лиопротектор. В некоторых вариантах осуществления лиопротектор выбран из сахара, полиола или их производного. В некоторых вариантах осуществления липопротектор выбран из моносахарида, дисахарида или их смеси. Например, лиопротектор может быть сахарозой, лактулозой, трегалозой, лактозой, глюкозой, мальтозой, маннитом, целлобиозой или их смесью.

Предложены способы получения частиц, содержащих один или более конъюгатов. Частицы могут быть полимерными частицами, липидными частицами или их комбинациями. Различные способы, описанные в настоящем документе, могут быть скорректированы для контроля размера и состава частиц, например, некоторые способы лучше всего подходят для получения микрочастицы, в то время как другие лучше подходят для получения частиц. Выбор способа получения частиц с описанными характеристиками может быть осуществлен специалистом в данной области без излишнего экспериментирования.

Полимерные частицы

Способы получения полимерных частиц известны в данной области техники. Полимерные частицы могут быть получены с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. Общие способы микрокапсулирования включают, но ими не ограничиваются, сушку распылением, межфазную полимеризацию, инкапсуляцию расплава полимера, инкапсулирование с разделением фаз (спонтанная эмульсионная микрокапсуляция, микрокапсуляция с выпариванием растворителя и микрокапсуляция с удалением растворителя), коацервацию, образование микросфер при низкой температуре и наноинкапсуляцию с инверсией фаз (PIN). Краткое изложение этих способов приведено ниже.

Сушка распылением

Способы образования полимерных частиц с использованием способов сушки распылением, описаны в патенте США № 6620617. В этом способе полимер растворяют в органическом растворителе, таком как метилен хлорид, или в воде. Известное количество одного или более конъюгатов или дополнительных активных веществ, которые должны быть включены в частицы, суспендируют (в случае нерастворимого активного вещества) или растворяют (в случае растворимого активного вещества) в растворе полимера. Раствор или дисперсию прокачивают через насадку для микронизации под воздействием потока сжатого газа, и полученный аэрозоль суспендируют в подогретом циклоне воздуха, что позволяет растворителю выпариваться из микрокапель, образуя частицы. С помощью этого способа могут быть получены микросферы/наносферы в диапазоне от 0,1 до 10 мкм.

Межфазная полимеризация

Для инкапсуляции одного или нескольких конъюгатов и/или активных веществ также может быть использована межфазная полимеризация. С помощью этого способа мономер и конъюгаты или активное вещество(а) растворяются в растворителе. Второй мономер растворяется во втором растворителе (обычно воде), который не смешивается с первым. Эмульсия образуется путем суспендирования первого раствора посредством перемешивания во втором растворе. После стабилизации эмульсии к водной фазе добавляют инициатор, что приводит к межфазной полимеризации на границе раздела каждой капли эмульсии.

Микроинкапсуляция расплава

Микросферы могут быть получены из полимеров, таких как полиэфиры и полиангидриды, используя способы микроинкапсуляции расплава полимера, как описано в Matiowitz et al., Reactive Polymers, 6:275 (1987). В некоторых вариантах осуществления с использованием этого способы используются полимеры с молекулярной массой от 3000 до 75000 Дальтон. В этом способе полимер сначала расплавляют, а затем смешивают с твердыми частицами одного или более активных веществ, которые должны быть включены, которые были сортированы по размеру менее 50 микрон. Смесь суспендируют в несмешивающемся растворителе (например, силиконовом масле) и при непрерывном перемешивании нагревают до температуры на 5°С выше точки плавления полимера. После того, как эмульсия стабилизируется, ее охлаждают до затвердевания частиц полимера. Полученные микросферы промывали декантацией с петролейным эфиром с получением свободного сыпучего порошка.

Микроинкапсуляция с разделением фаз

В методиках микроинкапсуляции с разделением фаз раствор полимера перемешивали, необязательно в присутствии одного или более активных веществ, которые должны быть инкапсулированы. Продолжая равномерно суспендировать вещество путем перемешивания, к раствору медленно добавляют осадитель полимера для уменьшения растворимости полимера. В зависимости от растворимости полимера в растворителе и осадителе, полимеру либо осаждается, либо происходит разделение фаз на фазу богатую полимер и фазу с низким содержанием полимера. При надлежащих условиях полимер в фазе богатой полимерам будет мигрировать к границе раздела с диспергирующей фазой, инкапсулируя активное вещество(а) в капли с внешней полимерной оболочкой.

Спонтанная эмульсионная микрокапсуляция

Спонтанное эмульгирование включает затвердевание эмульгированных капель жидкого полимера, образованных выше, за счет изменения температуры, испарения растворителя или добавления химических сшивающих агентов. Физические и химические свойства инкапсулята, а также свойства одного или более активных веществ, необязательно, включенных в возникающие частицы, требуют соответствующие способы инкапсулирования. Такие факторы, как гидрофобность, молекулярная масса, химическая стабильность и термостабильность, влияют на инкапсуляцию.

Микроинкапсуляция с выпариванием растворителя

Способы образования микросфер с использованием методик выпаривания растворителя описаны в Matiowitz et al., J. Scanning Microscopy, 4:329 (1990); Beck et al., Fertil. Steril., 31:545 (1979); Beck et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 135(3) (1979); Benita et al., J. Pharm. Sci., 73:1721 (1984); и в патенте США № 3960757. Полимер растворяют в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Один или более активных веществ, которые должны быть включены, необязательно добавляют в раствор, и смесь суспендируют в водном растворе, который содержит поверхностно-активное вещество, такое как поли(виниловый спирт). Полученную эмульсию перемешивают до тех пор, пока большая часть органического растворителя не выпаривается, получая твердые микрочастицы/наночастицы. Этот способ может использоваться для относительно стабильных полимеров, таких как сложные полиэфиры и полистирол.

Микроинкапсуляция с удалением растворителя

Методика микроинкапсуляции с удалением растворителя в основном предназначена для полиангидридов и описана, например, в публикации WO 93/21906. В этом способе вещество, которое должно быть включено, диспергируют или растворяют в растворе выбранного полимера в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Эту смесь суспендируют при перемешивании в органическом масле, таком как силиконовое масло, с образованием эмульсии. С помощью этой методики могут быть получены микросферы, с размером, изменяющимся от 1 до 300 мкм. Вещества, которые могут быть включены в микросферы, включают лекарственные средства, пестициды, питательные вещества, визуализирующие агенты и соединения металлов.

5. Коацервация

Процедуры инкапсуляции различных веществ, используя методики коацервации, известны в данной области, например, из GB-B-929 406; GB-B-929 40 1; и патента США № 3266987, 4794000 и 4460563. Коацервация включает разделение высокомолекулярного раствора на две несмешивающиеся жидкие фазы. Одна фаза представляет собой плотную коацерватную фазу, которая содержит высокую концентрацию инкапсулированного полимера (и необязательно один или более активных веществ), тогда как вторая фаза содержит низкую концентрацию полимера. В плотной коацерватной фазе инкапсулированный полимер образует капли с нано или микроразмером. Коацервация может быть вызвана изменением температуры, добавлением осадителя или добавлением микро-соли (простая коацервация), либо путем добавления другого полимера, в результате чего образуется интерполимерный комплекс (комплекс коацервации).

6. Отливка микросфер при низкой температуре

Методы отливки при очень низкой температуре частиц с контролируемым высвобождением описаны в патенте США № 5019400. В этом способе полимер растворяют в растворителе, необязательно вместе с одним или более растворенными или диспергированными активными веществами. Смесь затем распыляют в сосуд, содержащий жидкий осадитель, при температуре ниже точки замерзания раствора полимерного вещества, что замораживает полимерные капли. По мере того как капли и осадатель полимера нагревают, растворитель в каплях оттаивает и его экстрагируют в осадителе, что приводит к получению более прочных микросфер.

7. Наноинкапсулирование с фазовой инверсией (PIN)

Частицы также могут быть образованы с использованием метода наноинкапсулирования с фазой инверсией (PIN), где полимер растворяется в «хорошем» растворителе, частицы вещества мелкого помола, которые должны быть включены, например, лекарственного средства, смешивают или растворенной в растворе полимера, и смесь выливают в сильный осадитель полимера, при этом самопроизвольно образуются, при благоприятных условиях, полимерные микросферы, где полимер либо покрыт частицами, либо частицы диспергированы в полимере. См., например, патент США № 6143211. Способ может быть использован для получения монодисперсных популяций наночастиц и микрочастиц в широком диапазоне размеров, в том числе, например, от приблизительно 100 нм до приблизительно 10 микрон.

Предпочтительно, эмульсия не должна быть получена до осаждения. Способ может быть использован для формирования микросфер из термопластичных полимеров.

8. Эмульсионные способы

В некоторых вариантах осуществления, частицу получают с использованием способа выпаривания растворителя эмульсии. Например, полимерное вещество растворяют в органическом растворителе, не смешивающемся с водой, и смешивают с раствором лекарственного средства или с комбинацией растворов лекарственных средств. В некоторых вариантах осуществления раствор терапевтического, профилактического или диагностического средства, который должен быть инкапсулирован, смешивают с раствором полимера. Полимер может быть, но ими не ограничиваясь, один или более из следующих: PLA, PGA, PCL, их сополимерами, полиакрилатами, вышеуказанными ПЭГилированными полимерами. Молекулы лекарственного средства могут включать один или более конъюгатов, как описано выше, и один или более дополнительных активных средств. Органический растворитель, не смешивающийся с водой, может быть, но ими не ограничиваясь, один или более из следующих: хлороформ, дихлорметан и ацилацетат. Лекарственное средство может быть растворено в, но ими не ограничиваясь, одном или нескольких растворителей из следующих: ацетон, этанол, метанол, изопропиловый спирт, ацетонитрил и диметилсульфоксид (DMSO).

Водный раствор добавляют в полученному раствору полимера с образованием эмульсионного раствора эмульгированием. Методика эмульгирования может быть, но ими не ограничиваясь, с ультразвуковым зондом или гомогенизацией через гомогенизатор.

9. Нанопреципитация

В другом варианте осуществления конъюгат, содержащий наночастицы, получают с использованием способов нанопреципитации или микрофлюидных устройств. Конъюгат, содержащий полимерное вещество, смешивают с лекарственным средством или комбинацией лекарственных средств в органическом растворителе, смешивающемся с водой, необязательно содержащем дополнительные полимеры. Дополнительный полимер может быть, но ими не ограничиваясь, один или более из следующих: PLA, PGA, PCL, их сополимерами, полиакрилатами, вышеуказанными ПЭГилированными полимерами. Органический растворитель, смешивающийся с водой, может быть, но ими не ограничиваясь, одном или несколькими растворителями из следующих: ацетон, этанол, метанол, изопропиловый спирт, ацетонитрил и диметилсульфоксид (DMSO). Полученную в результате смесь в виде раствора добавляют к полимерному осадителю, такому как водный раствор, с получением раствора в виде наночастиц.

10. Микрофлюидика

Способы получения частиц с использованием микрофлюидики известны в данной области. Подходящие способы включают способы, описанные в публикации патентной заявки США № 2010/0022680 А1. В целом, микрофлюидное устройство содержит по крайней мере два канала, которые сходятся воедино в смесительное устройство. Каналы, как правило, образованы с помощью литографии, травления, чеканки или формованием полимерной поверхности. Источник жидкости присоединен к каждому каналу, и приложение давления к источнику вызывает поток жидкости в канале. Давление может быть приложено с помощью шприца, насоса и/или силы тяжести. Входные потоки растворов с полимером, нацеливающими молекулами, липидами, лекарственным средством, полезной нагрузкой и тому подобное сходятся и смешиваются, и полученную смесь смешивают с раствором полимерного осадителя с получением частиц, имеющих желаемый размер и плотность молекул на поверхности. Изменяя давление и скорость потока во впускных каналах и природу и состав источников жидкости могут быть получены частицы, имеющие воспроизводимый размер и структуру.

II. Липидные частицы

Способы получения липидных частиц известны в данной области. Липидные частицы могут быть липидными мицеллами, липосомами или твердыми липидными частицами, полученными с помощью любого подходящего способа, известного в данной области. Обычные методики созданных липидных частиц, инкапсулирующих активное вещество, включают, но ими не ограничиваются, методики гомогенизации с высоким давлением, способы сверхкритической жидкости, эмульсионные способы, способы диффузии растворителей и сушку распылением. Краткое изложение этих способов приведено ниже.

Способы гомогенизации с высоким давлением (HPH)

Гомогенизация с высоким давлением представляет собой надежный и мощный метод, который используется для получения низкомолекулярных липидных частиц с узким распределением по размеру, в том числе липидных мицелл, липосом и твердых липидных частиц. Гомогенизаторы с высоким давлением толкать жидкость под высоким давлением (100-2000 бар) через узкое отверстие (в диапазоне нескольких микрон). Жидкость может содержать липиды, которые находятся в жидком состоянии при комнатной температуре, или расплав липидов, которые являются твердыми при комнатной температуре. Жидкость ускоряется на очень коротком расстоянии до очень высокой скорости (более 1000 км/ч). Это создает большие сдвиги напряжений и кавитационные силы, которые разрушают частицы, как правило, вплоть до субмикронного диапазона. Как правило, используется 5-10% содержание липидов, но также могут быть исследовано 40% содержание липидов.

Два подхода HPH представляют собой горячую и холодную гомогенизацию, работающих на единой концепции смешивания лекарственного средства в объеме липидного раствора или расплава.

Горячая гомогенизация:

Горячую гомогенизацию проводят при температуре выше температуры плавления липида и, следовательно, ее можно рассматривать как гомогенизацию эмульсии. Предварительную эмульсию лекарственного средства загруженного липидного расплава и водной фазы эмульгатора получают путем смешивания с высокой скоростью сдвига. HPH предварительной эмульсии проводят при температуре выше температуры плавления липида. Ряд параметров, в том числе температура, давление и число циклов, можно регулировать для получения липидных частиц с желаемым размером. В общем случае, более высокие температуры приводят к уменьшению размеров частиц из-за пониженной вязкости внутренней фазы. Тем не менее, высокие температуры увеличивают скорость деградации лекарственного средства и носителя. Повышение давления гомогенизации или числа циклов часто приводит к увеличению размера частиц из-за высокой кинетической энергии частиц.

b. Холодная гомогенизация

Холодная гомогенизация была разработана в качестве альтернативы горячей гомогенизации. Холодная гомогенизация лишена таких проблем, как температура, вызывающая деструкцию лекарственного средства, или внесение лекарственных средств в водную фазу в процессе гомогенизации. Холодная гомогенизация особенно эффективна для твердых липидных частиц, но может быть использована с незначительными изменениями для получения липосом и липидных мицелл. В этой методике липидный расплав, содержащий лекарственное средство, охлаждают, твердый липид измельчают до липидных микрочастиц и эти липидные микрочастицы диспергируют в холодном растворе поверхностно-активного вещества, что дает предварительную суспензию. Предварительную суспензию гомогенизируют при комнатной температуре или ниже, когда сила тяжести достаточно высока для того, чтобы разорвать микрочастицы липидов непосредственно до твердых липидных наночастиц.

2. Способы ультразвуковой обработки/гомогенизации при высокой скорости

Липидные частицы, в том числе липидные мицеллы, липосомы и твердые липидные частицы, могут быть получены путем ультразвуковой обработки/гомогенизации при высокой скорости. Сочетание обработки ультразвуком и гомогенизации с высокой скоростью особенно эффективно для получения низкомолекулярных липидных частиц. С помощью этого процесса образуются липосомы с размером в диапазоне от 10 нм до 200 нм, например, от 50 нм до 100 нм.

3. Способы выпаривания растворителя

Липидные частицы могут быть получены с помощью подходов с выпариванием растворителя. Липофильное вещество растворяют в органическом растворителе, не смешивающемся с водой, (например, в циклогексане), который эмульгирует в водной фазе. После выпаривания растворителя образуется дисперсия частиц путем осаждения липидов в водной среде. Такие параметры, как температура, давление, выбор растворителей, могут быть использованы для контроля размера и распределения частиц. Скорость выпаривания растворителя можно регулировать за повышенного/пониженного давления или повышенной/пониженной температуры.

4. Способы эмульгирования-диффузии растворителя

Липидные частицы могут быть получены с помощью способов эмульгирования-диффузии растворителя. Липидный сначала растворяют в органической фазе, такой как этанол и ацетон. Кислую водную фазу используют для регулирования дзета-потенциала, чтобы вызвать коацервацию липидов. Режим непрерывного потока обеспечивает непрерывную диффузию воды и спирта, что снижает растворимость липидов и приводит к термодинамической неустойчивости и продукции липосом.

5. Способы сверхкритической жидкости

Липидные частицы, в том числе липосомы и твердые липидные частицы, могут быть получены способами сверхкритической жидкости. Походы со сверхкритической жидкостью имеют преимущество замены или уменьшения количества органических растворителей, используемых в других способах получения. Липиды, активные вещества, которые должны быть инкапсулированы, и вспомогательные вещества могут быть растворены при высоком давлении в сверхкритическом растворителе. Сверхкритическим растворителем как правило является СО₂, хотя в данной области известны и другие сверхкритические растворители. Для повышения растворимости липидов, можно использовать небольшое количество сорастворителя. Этанол является обычным сорастворителем, хотя могут быть использованы и другие низкомолекулярные органические растворители, которые обычно считаются безопасными для составов. Липидные частицы, липидные мицеллы, липосомы или твердые липидные частицы могут быть получены путем расширения сверхкритического раствора или путем инъекции в водную фазу осадителя. Образование частиц и распределение по размерам можно контролировать путем изменения сверхкритического растворителя, сорастворитель, осадителя, температуры, давления и тому подобное.

6. Способы, основанные на микроэмульсии

Способы, основанные на микроэмульсии, для получения липидных частиц известны в данной области. Эти способы основаны на разведении многофазной, как правило, двухфазной системы. Способы с эмульсиями для получения липидных частиц обычно включают образование эмульсии вода-в-масле посредством добавления небольшого количества водной среды в большой объем органического раствора, не смешивающегося с водой, содержащего липиды. Смесь перемешивают для диспергирования водной среды в виде крошечных капель по всему органическому растворителю и липиды выстраиваются в монослой на границе раздела органической и водной фаз. Размер капель контролируется давлением, температурой, прикладываемым перемешиванием и присутствующим количеством липидов.

Эмульсия вода-в-масле может быть преобразована в липосомальную суспензию посредством образования двойной эмульсии. В двойной эмульсии органический раствор, содержащий капельки воды, добавляют в большой объем водной среды и перемешивают, что дает эмульсию вода-в-масле-в-воде. Размер и тип образованной липидной частицы можно регулировать путем выбора липида, температуры, давления, совместных поверхностно-активных веществ, растворителей и тому подобное и их количества.

7. Способы сушки распылением

Способы сушки распылением, аналогично способам, которые описаны выше, для получения полимерных частиц, могут быть использованы для создания твердых липидных частиц. Как правило, в этом способе используются липиды с температурой плавления выше 70^оC.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты по настоящему изобретению могут быть инкапсулированы в полимерные частицы, используя одно масло в способе с водной эмульсией. В качестве не ограничивающего примера, конъюгат и подходящий полимер или блок-сополимер или смесь полимеров/блок-сополимеров, растворяют в органических растворителях, таких как, но ими не ограничиваясь, дихлорметан (DCM), этилацетат (EtAc) или хлороформ с образованием масляной фазы. Сорастворители, такие как, но ими не ограничиваясь, диметил формамид (DMF), ацетонитрил (CAN) или бензиловый спирт (BA), могут быть использованы для контроля размера частиц и/или для солюбилизации конъюгата. Полимеры, используемые в составе, могут включать, но ими не ограничиваясь, сополимеры PLA97-b-PEG5, PLA35-b-PEG5 и PLA16-b-PEG5.

В некоторых вариантах осуществления составы частиц могут быть получены путем изменения липофильности конъюгатов по настоящему изобретению. Липофильность может быть изменена, используя гидрофобные ионные пары или гидрофобные ионные пары (HIP) конъюгатов с различными противоионами. HIP изменяет растворимость конъюгатов по настоящему изобретению. Растворимость в воде может резко снизиться, а растворимость в органических фазах может увеличиться.

Любое подходящее средство может быть использовано для получения противоионов для формирования комплекса HIP вместе с конъюгатом по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления комплекс HIP может быть получен перед получением состава частиц.

VI. Способы применения конъюгатов и частиц

Конъюгаты или частицы, как описано в настоящем документе, могут быть введены для лечения любого гиперпролиферативного заболевания, метаболического заболевания, инфекционного заболевания или злокачественного новообразования, если требуется. Составы могут быть использованы для иммунизации. Композиции могут быть введены путем инъекции, перорально или местно, как правило, на поверхность слизистой (легкого, назально, перорально, буккально, сублингвально, вагинально, ректально) или в глаз (внутриглазным путем или трансокулярно).

В различных вариантах осуществления предсмотрые способы лечения индивидуума, страдающего злокачественным новообразованием, где способ включает введение терапевтически эффективного количества конъюгатов или частиц, как описано в настоящем документе, индивидууму, страдающему злокачественным новообразованием, с подозрением на его наличие или имеющим предрасположенности к нему. В соответствии с настоящим изобретением злокачественное новообразование включает любое заболевание или болезнь, характеризующуюся безконтрольной пролиферацией клеток, например, гиперпролиферацией. Злокачественные новообразования могут быть охарактеризованы опухолями, например, солидными опухолями, или любыми неоплазмами.

В некоторых вариантах осуществления индивидуум может быть свободен от показаний для лечения конъюгатом или частицами. В некоторых вариантах осуществления способы включают применение раковых клеток, в том числе, но ими не ограничиваясь, раковых клеток млекопитающих. В некоторых случаях раковые клетки млекопитающих являются раковыми клетками человека.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты или частицы по настоящему изобретению, как было установлено, ингибируют злокачественное новообразование и/или опухолевый рост. Они также могут уменьшать, в том числе клеточную пролиферацию, инвазивность и/или метастазирование, что делает их эффективными для лечения злокачественного новообразования.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты или частицы по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики роста опухоли или злокачественного новообразования и/или для профилактики метастазирования опухоли или злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для уменьшения или уничтожения злокачественного новообразования.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты или частицы, представленные в настоящем описании, могут быть использованы для ингибирования пролиферации раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты или частицы, представленные в настоящем описании, являются эффективными для ингибирования клеточной пролиферации, например, ингибирования скорости пролиферации клеток, предотвращения клеточной пролиферации и/или для индукции гибели клеток. В целом, конъюгаты или частицы, как описано в настоящем документе, могут ингибировать клеточную пролиферацию раковой клетки или одновременно ингибировать пролиферацию и/или индуцировать клеточную гибель раковой клетки.

Злокачественные новообразования, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, как правило, находятся в организме млекопитающих. Млекопитающие включают, например, людей, нечеловеческих приматов, собак, кошек, крыс, мышей, кроликов, хорьков, морских свинок лошадей, свиней, овец, коз и крупный рогатый скот. В различных вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой рак легкого, рак молочной железы, например, рак молочной железы с мутантным BRCA1 и/или мутантным BRCA2, рак молочной железы, не связанный с BRCA, колоректальный рак, рак яичников, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак почки, лейкоз, опухоли центральной нервной системы, миелому и меланому. В некоторых вариантах осуществления злокачественным новообразованием является рак легких. В некоторых вариантах осуществления злокачественным новообразованием является рак легких, рак яичников, рак поджелудочной железы или рак ободочной и прямой кишки человека.

Конъюгаты или частицы, как описано в настоящем документе, или составы, содержащие конъюгаты, или частицы, как описано в настоящем документе, могут быть использованы для селективной доставки в ткани терапевтического, профилактического или диагностического средства индивидууму или пациенту, при необходимости. Режимы дозирования можно регулировать для получения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, один болюс может быть введен, несколько разделенных доз могут быть введены в течение определенного времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, на что указывает острота терапевтической ситуации. Дозированная лекарственная форма, как используется в настоящем описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для млекопитающих, в отношении которых проводится лечение; причем каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта.

В различных вариантах осуществления конъюгат, содержащийся внутри частицы, высвобождается контролируемым образом. Освобождение может быть in vivo или in vitro. Например, частицы могут быть подвергнуты тесту на высвобождение при определенных условиях, в том числе при условиях, которые указаны в Фармакопеи США и ее вариантах.

В различных вариантах осуществления менее чем приблизительно 90%, менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20% конъюгата, содержащегося внутри частиц, высвобождается в течение первого часа после того, как частицы подвергаются воздействию условий теста на высвобождение. В некоторых вариантах осуществления менее приблизительно 90%, менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 60%, или менее чем приблизительно 50% конъюгата, содержащегося внутри частиц, высвобождается в течение первого часа после того, как частицы подвергаются условиях теста на высвобождение. В некоторых вариантах осуществления менее чем приблизительно 50% конъюгата, содержащегося внутри частиц, высвобождается в течение первого часа после того, как частицы подвергаются воздействию условий теста на высвобождение.

Что касается конъюгата, высвобождающегося in vivio, например, конъюгата, содержащегося внутри частицы, вводимой индивидууму, то от может быть защищен от организма индивидуума, а организм также может быть изолирован от конъюгата, пока конъюгат не высвободится из частицы.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, конъюгат может, по существу, содержатся внутри частицы до тех пор, пока частице не поступит в организм индивидуума. Например, менее чем приблизительно 90%, менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 1% от общего содержания конъюгата высвобождается из частицы до того как частица доставляется в организм, например, в сайт лечения, индивидуума. В некоторых вариантах осуществления конъюгат может высвобождаться в течение длительного периода времени или импульсно (например, количество конъюгата высвобождается в течение короткого периода времени, за которым следует период времени, когда, по существу, конъюгат не высвобождается). Например, конъюгат может высвобождаться в течение 6 часов, 12 часов, 24 часа или 48 часов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат высвобождается в течение одной недели или одного месяца.

VII. Наборы и устройства

Изобретение относится к различным наборам и устройствам для удобного и/или эффективного осуществления способов по настоящему изобретению. Обычно наборы включают достаточное количество и/или число компонентов, чтобы позволить пользователю осуществить лечение индивидуума(ов) несколько раз и/или выполнение нескольких экспериментов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к наборам для ингибирования опухолевого роста in vitro или in vivo, содержащим конъюгат и/или частицу по настоящему изобретению, или комбинацию конъюгатов и/или частиц по настоящему изобретению, возможно, в комбинации с любым другим активным средством.

Набор может дополнительно содержать упаковку и инструкции и/или агент доставки для получения состава композиции. Агент доставки может включать физиологический раствор, буферный раствор или любой агент доставки, описанный в настоящем документе. Количество каждого компонента может изменяться с тем, чтобы обеспечить однородный, воспроизводимый физиологический раствор высокой концентрации или буфер простого состава. Компоненты также могут изменяться для повышения стабильности конъюгатов и/или частиц в буферном растворе в течение определенного периода времени и/или при различных условиях.

Настоящее изобретение относится к устройствам, которые могут включать конъюгаты и или частицы по настоящему изобретению. Эти устройства содержат стабильный состав, доступный для немедленной доставки индивидууму, при необходимости, например, пациенту-человеку. В некоторых вариантах осуществления индивид страдает злокачественным новообразованием.

Не ограничивающие примеры устройств включают насос, катетер, иглу, трансдермальный пластырь, средству для назальной доставки под давлением, устройству для ионофореза, многослойные микрофлюидальные устройства. Устройства могут быть использованы для доставки конъюгатов и/или частицы по настоящему изобретению в соответствии с одно-, много- или сплит-дозирующими режимами. Устройства могут быть использованы для доставки конъюгатов и/или частицы по настоящему изобретению через биологическую ткань, внутрикожно, подкожно или внутримышечно.

Следует понимать, что следующие примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения. Различные другие примеры и модификации приведенного выше описания и примеры будут очевидны для специалиста в данной области после прочтения описания, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения, и подразумевается, что все такие примеры и модификации должны быть включены в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации и патенты, указанные в настоящем документе, включены в качестве ссылки в полном объеме.

ПРИМЕРЫ

Пример A: Аналитические способы ВЭЖХ: анализ продукта с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой C18 (Способ 1)

Анализ ВЭЖХ соединений, описанных в настоящем документе, проводили на колонке с обращенной фазой Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6×100 мм, 3,5 мкм, Agilent PN: 961967-902) с мобильной фазой, состоящей из воды+0,1% TFA (растворитель A) и ацетонитрил+0,1% TFA (растворитель B со скоростью потока 1,5 мл/мин и температурой колонки 35°С. Объем инъекции составлял 10 мкл и аналит детектировали, используя УФ при 220 и 254 нм. Градиент показан в Таблице 5.

ПРИМЕР 1: Синтез конъюгата 1

К раствору кабазитакселя (2,00 г, 2,40 ммоль) и 2-(2-пиридинилдитио)этанол p-нитрофенил карбоната (915 мг, 2,60 ммоль) в дихлорметане (48 мл) добавляли DMAP (439 мг, 3,60 ммоль). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем промывали 0,1н HCl (3×20 мл), насыщенным водным раствором NaCl (50 мл) и сушили сульфатом натрия. Растворитель удаляли в вакууме, остальной остаток очищали хроматографией на силикагеле (2:1 петролейный эфир:этилацетат) с получением кабазитакселя 2-(2-пиридилдитио)этилкарбонат (2,50 г, 2,38 ммоль, 99%-ый выход). LCMS m/z: 1049 (M+H).

К раствору октереотида ацетата (2,08 г, 1,93 ммоль) в DMF (20 мл) и диизопропилэтиламин (2,0 мл), охлажденный до -40°C, добавляли раствор BocOSu (419 мг, 1,95 ммоль) в DMF (5 мл) по каплям. Реакционную смесь постепенно нагревали до комнатной температуры в течение 3 часов. Большую часть DMF удаляли, и реакционную смесь нагружали на колонку C18, элюируя 15%-60% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH, с получением продукта в виде ацетатной соли (1,53 г, 1,30 ммоль, 67%-ый выход). LCMS m/z: 510,3 (M-Boc+2H)/2.

К раствору Lys-Boc октреотида ацетата (545 мг, 0,462 ммоль) в DMF (10 мл) и диизопропилэтиламина (1 мл) добавляли раствор NHS эфира 3-тритилмеркаптопропионовой кислоты (308 мг, 0,676 ммоль) в DMF (4 мл). Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 2 часов, после чего ВЭЖХ показала полное исчезновение исходного вещества. Все растворители удаляли в вакууме, и оставшееся вещество очищали хроматографией с обращенной фазой с получением продукта (623 мг, 0,430 ммоль, 93%-ый выход).

1

Сосуд наполняли Lys-Boc октреотид 3-тритилмеркаптопропионамидом (443 мг, 0,306 ммоль) и добавляли воду (0,25 мл), трифторуксусную кислоту (10 мл) и триизопропилсилан (0,25 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, и все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток растворяли в DMF (7 мл) и диизопропилэтиламине (0,50 мл). К раствору добавляли раствор кабазитакселя 2-(2-пиридилдитио)этилкарбоната (407 мг, 0,388 ммоль) в DMF (3 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь нагружали на колонку C18, элюируя 30%-70% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH, с получением желаемого продукта, конъюгата 1, в виде ацетатной соли (288 мг, 0,137 ммоль, 45%-ый выход). LCMS m/z: 1023,0 (M+2H)/2.

ПРИМЕР 2: Синтез конъюгата 2

Октреотид ацетат (515 мг, 0,477 ммоль) растворяли в DMF (6 мл) и диизопропилэтиламине (1,0 мл). Раствор охлаждали до -40°C, и по каплям добавляли раствор FMocOSu (182 мг, 0,539 ммоль) в DMF (4 мл). Реакционную смесь постепенно нагревали до комнатной температуры в течение 2 часов. Добавляли pH 8,0 фосфатный буфер (1 мл), и реакционную смесь нагружали на 50 г колонку C18. Элюирование 15%-85% ацетонитрилом в воде давало Lys-Fmoc октреотид (419 мг, 0,337 ммоль, 71%-ый выход). LCMS m/z: 621,3 (M+2H)/2.

Колбу наполняли доксорубицином (1,39 г, 2,40 ммоль) и FMocOSu (1,69 г, 5,00 ммоль). Добавляли DMF (10 мл) и диизопропилэтиламин (875 мкл, 5,00 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Все растворители удаляли в вакууме, и остальной остаток нагружали на 80 г колонку с силикагелем, элюируя 0%-8% метанол в дихлорметане с получением доксорубицина FMoc (1,84 г, 2,40 ммоль, 100%-ый выход). LCMS m/z: 397,1 (FMoc даунозамин), 352,2 (M-даунозамин).

Колбу наполняли доксорубицином Fmoc (1,84 г, 2,40 ммоль) и глутаровым ангидридом (1,09 г, 9,60 ммоль). Добавляли DMF (10 мл) и диизопропилэтиламин (875 мкл, 5,00 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Большую часть растворителя удаляли в вакууме, до тех пор, пока общий объем не становился ~5 мл. Этот раствор добавляли по каплям в быстро перемешиваемый 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты (100 мл), охлажденный до 0°C. Оставшуюся суспензию фильтровали, оставшееся твердое вещество промывали водой (20 мл), и твердое вещество сушили в вакууме. Твердое вещество помещали в 2% метанол в дихлорметане и нагружали на 80 г колонку с силикагелем. Элюирование 0%-15% метанолом в 99,5/0,5 дихлорметан/диизопропилэтиламин давало доксорубицин гемиглютарат Fmoc (1,10 г, 1,25 ммоль, 52%-ый выход). LCMS m/z: 493,1 (M-даунозамин), 397,1 (даунозамин FMoc).

Сосуд наполняли доксорубицин гемиглютаратом Fmoc (104 мг, 0,103 ммоль), и к нему добавляли раствор Lys-FMoc октреотида (134 ммоль, 0,107 ммоль) в DMF (3 мл), а затем раствор TBTU (66,1 мг, 0,206 ммоль) в DMF (3 мл). Добавляли диизопропилэтиламин (50 мкл, 0,287 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Все растворители удаляли в вакууме, и оставшееся вещество нагружали на 24 г колонку с силикагелем. Элюирование 0%-15% метанолом в дихлорметане давало Lys-Fmoc октреотид гемиглютарат FMoc доксорубицин (208 мг, 0,0989 ммоль, 96%-ый выход).

2

Lys-Fmoc октреотид гемиглютарат Fmoc доксорубицин (208 мг, 0,0989 ммоль) растворяли в 5 мл DMF и 1 мл пиперидина. После перемешивания в течение 30 минут все растворители удаляли в вакууме, и остальной остаток растворяли в DMF (1 мл), и этот раствор добавляли по каплям в быстро перемешиваемый этилацетат (100 мл). Эту суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, фильтровали, оставшееся твердое вещество промывали этилацетатом (20 мл), и сушили в вакууме. Оставшееся твердое вещество очищали хроматографией с обращенной фазой (5%-50% ацетонитрил в воде, с 0,1% TFA) с получением желаемого продукта в виде соли бис-TFA (55,8 мг, 0,0296 ммоль, 28%-ый выход). LCMS m/z: 829,9 (M+2H)/2.

ПРИМЕР 3: Синтез конъюгата 3

A

К раствору октреотид ацетата (540 мг, 0,501 ммоль) в DMF (8 мл) и N,N-диизопропилэтиламина (175 мкл, 1,00 ммоль), охлажденному до 0°C, добавляли раствор ди-трет-бутил дикарбоната (109 мг, 0,499 ммоль) в DMF (7 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа, затем при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем добавляли N-гидроксисукцинимидный эфир S-тритил-3-меркаптопропионовой кислоты (668 мг, 1,50 ммоль) в виде твердого вещества, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворители удаляли в вакууме, и оставшееся вещество очищали хроматографией на силикагеле (0%-8% метанол в дихлорметане) с получением A (560 мг, 0,386 ммоль, 77%-ый выход).

B

К раствору 2,2'-дипиридил дисульфида (1,51 г, 6,85 ммоль) в метаноле (20 мл) добавляли 2-(бутиламино)этантиол (500 мкл, 3,38 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов, затем растворители удаляли в вакууме. Оставшееся вещество очищали хроматографией на силикагеле с получением дисульфида B (189 мг, 0,780 ммоль, 23%-ый выход), который хранили при -18°C перед применением.

К раствору кабазитакселя (410 мг, 0,490 ммоль) в дихлорметане (10 мл) и пиридине (0,50 мл), охлажденному до -40°C, добавляли раствор p-нитрофенил хлорформиата (600 мг, 2,98 ммоль) в дихлорметане (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при -40°C в течение 2 часов, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и промывали 0,1 н HCl (20 мл). Водный слой экстрагировали дихлорметаном (2×20 мл), и объединенные органические слои сушили MgSO₄, и растворитель удаляли в вакууме. Оставшееся вещество очищали хроматографией на силикагеле с получением кабазитаксел-2'-p-нитрофенилкарбоната (390 мг, 0,390 ммоль, 80%-ый выход.)

Раствор кабазитаксел-2'-p-нитрофенилкарбоната (390 мг, 0,390 ммоль) в дихлорметане (15 мл) добавляли в B (190 мг, 0,784 ммоль). Добавляли N,N-диизопропилэтиламин (1,0 мл, 5,74 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 18 часов, затем растворители удаляли в вакууме и оставшееся вещество очищали хроматографией на силикагеле с получением кабазитакселя дисульфида (326 мг, 0,295 ммоль, 78%-ый выход). ESI MS: вычислено 1103,4, найдено 1103,9 [M+1].

3

Сосуд наполняли A (10,0 мг, 0,00690 ммоль) и добавляли воду (25 мкл), трифторуксусную кислоту (500 мкл) и триизопропилсилан (10 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин до тех пор, пока она не становилась бесцветной, затем все растворители удаляли в вакууме. К этому осадку добавляли кабазитакселя дисульфид (10,4 мг, 0,00942 ммоль), pH 8,0 фосфатный буфер (1,0 мл) и THF (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли DMSO (1,0 мл) для солюбилизации любого оставшегося твердого остатка, и полученный раствор очищали препаративной ВЭЖХ (30%-85% ацетонитрил в воде с 0,2% уксусной кислотой) с получением продукта в виде ацетатной соли (10,3 мг, 0,00477 ммоль, 69%-ый выход). ESI MS: вычислено 2098,9, найдено 1050,6 [(M+2)/2].

ПРИМЕР 4: Синтез конъюгата 4

Сосуд наполняли производным тритилтиооктреотида (20,9 мг, 0,0144 ммоль), и добавляли воду (25 мкл), трифторуксусную кислоту (1,0 мл) и триизопропилсилан (10 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до тех пор, пока она не становилась бесцветной (5 мин), затем все растворители удаляли в вакууме. К этому осадку добавляли 2,2'-дипиридил дисульфид (10,5 мг, 0,0477 ммоль), воду (1,0 мл) и метанол (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем добавляли DMSO (1,0 мл) добавляли для солюбилизации любого оставшегося твердого вещества. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (5%-50% ацетонитрил в воде с 0,2% уксусной кислотой) с получением дисульфида в виде ацетатной соли (12,6 мг, 0,00987 ммоль, 69%-ый выход). ESI MS: вычислено 1215,4, найдено 608,8 [(M+2)/2].

4

Сосуд наполняли дисульфидом (10,0 мг, 0,00783 ммоль) и DM-1 (6,00 мг, 0,00813). Добавляли фосфатный буфер (pH 8, 2,0 мл) и метанол (3,0 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Добавляли DMSO (3,0 мл) для солюбилизации любого оставшегося твердого вещества в реакционную смесь, и реакционный раствор очищали препаративной ВЭЖХ (25%-75% ацетонитрил в воде с 0,2% уксусной кислотой) с получением продукта в виде ацетатной соли (9,32 мг, 0,00490 ммоль, 63%-ый выход). ESI MS: вычислено 1841,7, найдено 912,9 [(M+2-H₂O)/2].

ПРИМЕР 5: Синтез конъюгата 5

5

Сосуд наполняли производным тритилтиооктреотида (5,2 мг, 0,0036 ммоль) и добавляли воду (25 мкл), трифторуксусную кислоту (500 мкл) и триизопропилсилан (10 мкл). Реакционную смесь перемешивали до тех пор, пока она не становилась бесцветной (5 мин), затем все растворители удаляли в вакууме. К ней добавляли раствор MC-Val-Cit-PABC-MMAE (4,8 мг, 0,0036 ммоль) в DMF (1,0 мл). Добавляли насыщенный бикарбонат натрия (100 мкл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли дополнительное количество воды (1 мл), и полученный раствор очищали препаративной ВЭЖХ (30%-75% ацетонитрил в воде с 0,2% уксусной кислотой) с выходом продукта в виде ацетатной соли (4,9 мг, 0,0020 ммоль, 56%-ый выход). ESI MS: вычислено 2422,2, найдено 1212,9 [(M+2)/2].

ПРИМЕР 6: Синтез конъюгата 6

Сосуд наполняли амино-PEG8-кислотой (221 мг, 0,501 ммоль) и NHS эфиром тритил 3-меркаптопропионовой кислоты (223 мг, 0,501 ммоль). Добавляли DMF (5 мл) и диизопропилэтиламин (500 мкл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Через 24 часа добавляли DCC (206 мг, 1,00 ммоль) и N-гидроксисукцинимид (115 мг, 1,00 ммоль), и реакционную смесь перемешивали еще 24 часа. Реакционную смесь фильтровали, промывая твердое вещество 3 мл DMF, и собранный фильтрат концентрировали в вакууме. Оставшееся вещество очищали хроматографией на силикагеле с получением продукта (406 мг, 0,467 ммоль, 93%-ый выход).

Октреотид ацетат (335 мг, 0,311 ммоль) растворяли в DMF (5 мл), раствор охлаждали до 0°C, добавляли диизопропилэтиламин (150 мкл), и по каплям добавляли раствор Boc₂O (67,9 мг, 0,311 ммоль) в DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин, затем нагревали до комнатной температуры в течение 30 мин. Затем добавляли раствор NHS эфира в 5 мл DMF, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Все растворители удаляли в вакууме, и остальной остаток очищали хроматографией на силикагеле с получением продукта (249 мг, 0,133 ммоль, 43%-ый выход).

6

Исходное вещество (21,2 мг, 0,0113 ммоль) растворяли в TFA (1 мл), воде (25 мкл) и триизопропилсилане (25 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток растворяли в DMF (1 мл), и добавляли раствор 2,2'-дипиридилдисульфида (15,0 мг, 0,0681 ммоль) в DMF (1 мл), а затем диизопропилэтиламин (200 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин и очищали препаративной ВЭЖХ. Промежуточный продукт 2-пиридилдисульфид растворяли в DMF (1 мл), и добавляли раствор DM-1 (6,0 мг, 0,0081 ммоль) в DMF (1 мл), а затем диизопропилэтиламин (200 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин, и реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ с получением продукта (10,1 мг, 0,00445 ммоль, 39%-ый выход).

ПРИМЕР 7: Синтез конъюгата 7

Смесь Lys-Boc октреотида, свободное основание, (50,0 мг, 0,0447 ммоль), (Boc)HNCys(Trt)-[Lys(Boc)]₄-OH (80,0 мг, 0,0581 ммоль) и EDC (19,1 мг, 0,100 ммоль) в дихлорметане (3,0 мл) и диизопропилэтиламине (0,20 мл) перемешивали в течение 24 часов. Реакционную смесь нагружали на колонку с силикагелем, и элюирование 0%-15% метанолом в дихлорметане давало BocHN-Cys(Trt)-[Lys(Boc)]₄-октреотид(Lys-Boc) (24,0 мг, 0,00968 ммоль, 22%-ый выход).

7

BocHN-Cys(Trt)-[Lys(Boc)]₄-октреотид(Lys-Boc) (24,0 мг, 0,00968 ммоль) растворяли в воде (25 мкл), TFA (1 мл) и триизопропилсилане (25 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток растворяли в DMF (1 мл) и добавляли раствор 2,2'-дипиридилдисульфид (15,0 мг, 0,0681 ммоль) в DMF (1 мл), а затем диизопропилэтиламин (100 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин и очищали препаративной ВЭЖХ. Выделенный пиридил дисульфид растворяли в DMF (1 мл) и добавляли раствор DM-1 (5,2 мг, 0,070 ммоль) в DMF (1 мл), а затем диизопропилэтиламин (100 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем очищали препаративной ВЭЖХ с получением продукта (3,0 мг, 0,0013 ммоль, 13%-ый выход).

ПРИМЕР 8: Ингибирование клеточной пролиферации с помощью конъюгатов

Конъюгаты анализировали в анализе in vitro, оценивающем ингибирование клеточной пролиферации. Клетки рака легких человека NCI-H524 (АТСС) высевали в 96-луночные планшеты с V-образным дном (Costar) при концентрации 5000 клеток/лунку и через 24 часа обрабатывали соединением в течение 2 часов и дополнительно инкубировали 70 часов. Начальная доза соединения составляла 20 μM и проводили трех-кратные серийные разведения, всего десять точек. Через 2 часа обработки клетки осаждали центрифугированием, лекарственное средство, содержащее среду, удаляли и добавляли свежую полную среду и использовали для ресуспендирования клеток, которые снова центрифугировали. После удаления среды для промывки клетки ресуспендировали в полной среде, затем переносили в 96-луночные планшеты с белыми стенками и плоским дном. Клетки дополнительно инкубировали в течение еще 70 часов для того, чтобы измерить ингибирование клеточной пролиферации. Только октреотид не оказывал существенного влияния на клеточную пролиферацию. Пролиферацию измеряли, используя реагент CellTiter Glo и стандартный протокол (Promega) и Glomax multi+система детекции (Promega). Процент ингибирования пролиферации вычисляли, используя следующую формулу: % ингибирования=(контроль-обработка)/контроль×100. Контроль определял только носитель. Кривые IC₅₀ получали с помощью нелинейного регрессионного анализа (четыре параметра) с помощью GraphPad Prism 6. Данные для характерных соединений (Конъюгаты 1-7) показаны в таблице 6. Также измеряли IC₅₀ значения для характерных соединений с конкуренцией октреотида и они показаны в Таблице 6.

Эти данные свидетельствуют о том, что конъюгаты сохраняют способность связываться с соматостатином и интернализировать рецептор. В некоторых случаях это также указывает на то, что линкер эффективно расщепляется для активации цитотоксической нагрузкидля уничтожения опухолевых клеток.

ПРИМЕР 9: Ki конъюгатов для рецептора соматостатина

Два конъюгаты оценивали в анализе in vitro, оценивающем связывание с рецептором соматостатина 2 (SSTR2). Анализе связывания радиолиганда-рецептора проводили при Eurofins Panlabs (Тайвань) для того, чтобы определить сродство конъюгатов, описанных в настоящем документе, к SSTR2. Анализ измеряет связывание радиоактивного лиганда, [¹²⁵I]- меченого соматостатина, с SSTR2 человека, используя препараты мембран клеток CHO-K1, экспрессирующих SSTR2. Мембраны инкубировали с радиоактивно-меченным соматостатином (0,03 нМ) в присутствии конъюгата/соединения, начиная с дозы 10 мкМ, используя 6× серийные разведения, для получения кривой из 10 точек. Через четыре часа инкубации мембраны фильтровали и промывали 3× и подсчитывали для определения оставшегося [¹²⁵ I] соматостатина, связанного с рецептором. Значения IC50 определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа метода наименьших квадратов, используя MathIQTM (ID Business Solutions Ltd., UK). Значения Ki рассчитывали, используя уравнение Cheng и Prusoff (Cheng и Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, 1973), используя наблюдаемое значение IC50 тестируемого конъюгата/соединения, концентрацию радиолиганда, используемого в анализе, и исторические значения KD лиганда, полученные Eurofins.

Эти данные свидетельствуют о том, что высокое сродство пептида к рецептору сохраняется после добавления линкера и лекарственного средства к пептиду.

ПРИМЕР 10: Интернализация конъюгатов в рецептор соматостатина

Два конъюгаты оценивали в анализе in vitro, оценивающем SSTR2. Стадии, описанные ниже, обеспечивают аналитические объемы и порядок проведения анализов с агонистами, используя активированные GPCR клетки для интернализации PathHunter eXpress и реагенты детекции PathHunter, в основном, в соответствии с рекомендациями изготовителя. GraphPad Prism® использовали для построения кривой доза агониста ответ.

Эти данные свидетельствуют о том, что конъюгаты эффективно индуцируют интернализацию рецепторов как механизм для селективной доставки конъюгата в цитоплазму клеток, экспрессирующих SSTR2.

ПРИМЕР 11: Состав с наночастицами конъюгата 1

Состав с наночастицами конъюгата 1. Конъюгат октреотид-кабазитакселя 1 был успешно инкапсулирован в полимерные наночастицы, используя способ с эмульсией одного масла в воде (см. Таблица 9А и 9B, ниже). В характерном водоэмульсионном способе лекарственное средство и подходящий полимер или блок-сополимер или смесь полимеров/блок-сополимеров, растворяли в органических растворителях, таких как дихлорметан (DCM), этилацетат (EtAc) или хлороформ с образованием масляной фазы. Сорастворители, такие как диметилформамид (DMF) или ацетонитрил (ACN) или диметилсульфоксид (DMSO) или бензиловый спирт (BA) иногда использовали для контроля размера наночастиц и/или солюбилизации лекарственных средств. В составах использовали ряд полимеров, включая сополимеры PLA97-b-PEG5, PLA35-b-PEG5 и PLA16-b-PEG5. Составы наночастиц получали, изменяя липофильность конъюгата 1. Липофильность изменяли с помощью гидрофобных ионных пар конъюгата 1 с различными противоионами. Поверхностно-активные вещества, такие как Tween® 80, холат натрия, Solutol®HS или фосфолипиды, использовали в водной фазе для содействия в образовании тонкодисперсной эмульсии. Масляную фазу медленно добавляли к непрерывно перемешиваемой водной фазе, содержащую эмульгатор (такой как Tween®80) при характерном соотношении 10%/90% об./об. масло/вода и получали грубодисперсную эмульсию, используя роторнр-статорный гомогенизатор или ультразвуковую баню. Грубодисперсную эмульсию затем пропускали через гомогенизатор высокого давления (при 10000 фунтов на квадратный дюйм) в течение N=4 проходов с образованием наноэмульсии. Наноэмульсию был затем гасили 10-и кратно разбавленной холодной (0-5^оC) водой с качеством для инъекций для удаления основной части растворителя этилацетата, что приводило к затвердеванию капель эмульсии и образованию суспензии наночастиц. В некоторых случаях летучие органические растворители, такие как дихлорметан, могут быть удалены на роторном испарителе. Использовали фильтрование тангенциальным потоком (500 кДа MWCO, мембраны mPES) для концентрирования и промывки суспензии наночастиц водой с качеством для инъекций (вместе или без поверхностно-активных веществ/солей). Криопротектор, служащий также в качестве изотонического агента (например, 10% сахароза) добавляли к суспензии наночастиц и состав стерильно фильтровали через 0,22 мкм фильтр. Состав хранят в замороженном состоянии при ≤ -20^оC. Размер частиц (Z-ave) и индекс полидисперсности (PDI), определенный способом динамического рассеяния света наночастицами, были охарактеризованы способом динамического рассеяния света, как суммировано в таблице ниже. Фактическое содержание лекарственного средства определяли, используя ВЭЖХ и оптическую плотности в видимом спектре и УФ. Это было достигнуто за счет испарения воды из раствора наночастиц с известным объем и путем растворения твердых веществ в соответствующем растворителе, таком как DMF. Концентрацию лекарственного средства нормировали с общим количеством твердых веществ, извлеченных после выпаривания. Эффективность инкапсулирования рассчитывали как соотношение между фактической и теоретической лекарственной нагрузкой.

Составы с использованием свободного коньюгата 1 .

Было отмечено, что конъюгат 1 имеет высокую растворимость в водной среде, содержащей поверхностно-активные вещества, такие как Tween®80 и образует смешанные мицеллы. В некоторых составах конъюгат 1 использовали без каких-либо изменений его природной липофильности (свободный конъюгат). Неожиданно, но даже при высокой растворимости конъюгата 1 в водном растворе Tween®80 свободный конъюгат демонстрировал высокую степень инкапсулирования в наночастицах. Без привязки к какой-либо конкретной теории, тенденция конъюгата 1 сохраняться в наночастицах, несмотря на высокую растворимость в Tween®/воде может быть связана с высокой липофильностью кабазитакселя и его совместимостью/смешиваемостью с полимерной матрицей. Наличие двух аминокислот фенилаланинов в пептиде октреотида также может способствовать взаимодействию конъюгата с полимерной матрицей.

Составы с использованием пар гидрофобных ионов (HIP) конъюгата 1

Методики HIP использовали для повышения липофильности конъюгата 1. Конъюгат имеет одну положительно заряженную молекулу на аминокислоте лизин. Отрицательно заряженные молекулы диоксил натрия сульфосукцината (АОТ) использовали для каждой молекулы конъюгата с образованием HIP. Конъюгат и АОТ добавляли в смесь метанола, дихлорметана и воды и оставляли встряхиваться в течение 1 часа. После дополнительного добавления воды и дихлорметана в эту смесь HIP конъюгата 1/ АОТ экстрагировали из фазы дихлорметана и сушили. Иногда, для солюбилизации комплекса HIP использовали DMF. Результаты составов суммированы в Таблице 9A и 9B.

TDL: Теоретическая нагрузка лекарственного средства

ADL: Фактическая нагрузка лекарственного средства

д.о.: данные отсутствуют

EE: Эффективность инкапсулирования

Промывку оптимизировали для каждого состава наночастиц.

Эти данные показывают, что конъюгаты, нацеленные на рецептор соматостатина, могут быть успешно и эффективно инкапсулированы в наночастицы.

ПРИМЕР 12: Наночастицы, содержащие конъюгат 2

Конъюгат 2 был успешно инкапсулирован в полимерные наночастицы, используя способ с эмульсией одного масла в воде (см. Таблицу 6А и 6B ниже). В характерном водоэмульсионном способе лекарственное средство и подходящий полимер или блок-сополимер или смесь полимеров/блок-сополимеров, растворяли в органических растворителях, таких как дихлорметан (DCM), этилацетат (EtAc) или хлороформ с образованием масляной фазы. Сорастворители, такие как диметилформамид (DMF) или ацетонитрил (ACN) или диметилсульфоксид (DMSO) или бензиловый спирт (BA) иногда использовали для контроля размера наночастиц и/или солюбилизации лекарственных средств. В составах использовали ряд полимеров, включая сополимеры PLA97-b-PEG5, PLA74-b-PEG5, PLA35-b-PEG5 и PLA16-b-PEG5. Составы наночастиц получали изменяя липофильность конъюгата 2. Липофильность конъюгата 2 изменяли с помощью пар гидрофобных ионов конъюгата2 с различными противоионами. Поверхностно-активные вещества, такие как Tween® 80, холат натрия, Solutol®HS или липиды, использовали в водной фазе для содействия в образовании тонкодисперсной эмульсии. Масляную фазу медленно добавляли к непрерывно перемешиваемой водной фазе, содержащую эмульгатор (такой как Tween®80) при характерном соотношении 10/90% об./об. масло/вода и получали грубодисперсную эмульсию, используя роторнр-статорный гомогенизатор или ультразвуковую баню. Грубодисперсную эмульсию затем пропускали через гомогенизатор высокого давления (при 10000 фунтов на квадратный дюйм) в течение N=4 проходов с образованием наноэмульсии. Наноэмульсию был затем гасили 10-и кратно разбавленной холодной (0-5^оC) водой с качеством для инъекций для удаления основной части растворителя этилацетата, что приводило к затвердеванию капель эмульсии и образованию суспензии наночастиц. В некоторых случаях летучие органические растворители, такие как дихлорметан, могут быть удалены на роторном испарителе. Использовали фильтрование тангенциальным потоком (500 кДа MWCO, мембраны mPES) для концентририрования и промывки суспензии наночастиц водой с качеством для инъекций (вместе или без поверхностно-активных веществ/солей). Лиопротектор (например, 10% сахароза) добавляли к суспензии наночастиц и состав стерильно фильтровали через 0,22 мкм фильтр. Состав хранят в замороженном состоянии при ≤ -20^оC. Размер частиц (Z-сред.) и индекс полидисперсности (PDI) наночастиц были охарактеризованы способом динамического рассеяния света, как суммировано в таблице ниже. Фактическое содержание лекарственного средства определяли, используя ВЭЖХ и оптическую плотности в видимом спектре и УФ. Это было достигнуто за счет испарения воды из раствора наночастиц с известным объем и путем растворения твердых веществ в соответствующем растворителе, таком как DMF. Концентрацию лекарственного средства нормировали с общим количеством твердых веществ, извлеченных после выпаривания. Эффективность инкапсулирования рассчитывали как соотношение между фактической и теоретической лекарственной нагрузкой.

В некоторых составах конъюгат 2 использовали без каких-либо изменений его природной липофильности (свободный конъюгат). Неожиданно, но даже при высокой растворимости конъюгата 2 в водном растворе Tween®80, и гидрофильной природе октреотида, свободный конъюгат демонстрировал высокую степень инкапсулирования в наночастицах. Тенденция конъюгата 2 сохраняться в наночастицах была снижена по сравнению с конъюгатом 1.

Составы с использованием HIP конъюгата 2

Методики с парами гидрофобных ионов (HIP) использовали для повышения липофильности конъюгата 2. Конъюгат имеет две основные молекулы, на лизине и на доксорубицине. Отрицательно заряженные молекулы диоксил натрия сульфосукцината (АОТ) использовали для каждой молекулы конъюгата с образованием HIP. Конъюгат и АОТ добавляли в смесь метанола, дихлорметана и воды и оставляли встряхиваться в течение 1 часа. После дополнительного добавления воды и дихлорметана в эту смесь HIP конъюгата 2/ АОТ экстрагировали из фазы дихлорметана и сушили. В некоторых случаях, ДМФ использовали для солюбилизации тазобедренном комплекса. Описание и данные приведены в Таблице 10A и 10B.

Пример получения комплекса HIP конъюгата 2 вместе АОТ

# Положительных зарядов на конъюгате 2=2; MW=1658,9 г/моль

Масса конъюгата 2=34,5 мг.

# молей конъюгата 2=0,0208 ммоль

Количество молей АОТ, требуемых для покрытия конъюгата 2 положительными зарядами=0,0416 ммоль.

Масса АОТ (мг) [MW=445 г/моль]=18,5 мг

Конъюгат 2 и АОТ добавляли к раствору 1 мл воды и 2,1 мл метанола. к этой смеси добавляли 1 мл дихлорметана. Получали прозрачный красный гомогенный раствор. Этот раствор встряхивали в течение приблизительно 30 мин. К раствору добавляли 1 мл воды и 1 мл дихлорметана, и смесь быстро встряхивали. Оставляли для разделения двух фаз. Иногда для ускорения разделение двух фаз, смесь можно центрифугировать. Нижняя фаза состояла в основном из дихлорметана, тогда как верхняя фаза (водная фаза) была главным образом из воды и метанола. После образования комплекса HIP конъюгат 2:АОТ липофильность на соединении увеличивала свою растворимость в фазе дихлорметана. Комплекс HIP затем выделяли из нижней фазы, а дихлорметан выпаривали. Иногда в оставшуюся водную фазу добавляли дополнительное количество дихлорметана для экстракции оставшегося комплекса HIP конъюгат 2: АОТ.

Промывку оптимизировали для каждого состава наночастиц.

Эти данные также показывают, что конъюгаты, нацеленные на рецептор соматостатина, могут быть успешно и эффективно инкапсулированны в наночастицы.

ПРИМЕР 13: Фармакокинетика составов наночастиц 1 и 2 .

Составы наночастиц, как правило, получают для доставки in vivo в 10% сахарозе и изменяют составы свободного лекарственного средства, но, как правило, дозируют в 10% Солютоле®/10% сахарозе или физиологическом солевом растворе. В этом примере был дозирован конъюгат 1 без состава с наночастицами в виде раствора в 20% пропиленгликоле/80% водном растворе сахарозы (10%).

Для исследования фармакокинетики у крыс, используя наночастицы, как описано в настоящем документе, 0,1 мг/мл раствора дозировали при 10 мл/кг так, чтобы ввести 1 мг/кг болюсной дозы внутривенно путем инъекции в хвостовую вену крысам. После введения соединения в вакуумные пробирки, покрытые литий гепарином, собирали кровь через 0,083 часа, 0,25 часа, 0,5 часа, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов и 24 часа после введения дозы. Пробирки переворачивали в течение 5 мин и затем помещали на мокрый лед перед центрифугирование в течение 5 мин при 4°C при 6000 оборотов в минуту. Собирали плазму, замораживали при -80 ° C и погружали для биоанализа на сухой лед.

50 мкл плазмы крови крыс осаждали с помощью 300 мкл DMF и в полученном супернатанте измеряли содержание соединения с помощью ЖХ-МС/МС электрораспылением ионизацией в положительном режиме.

Нормированные фармакокинетические кривые характерных дозы у крыс для конъюгата 1 и составов наночастиц конъюгата 1 показаны на Фигуре 1. В Таблице 11 показаны вычисления нормированной площади под кривой (AUC) для конъюгата 1 и наночастиц, содержащих конъюгат 1, на Фигуре 1.

Нормированные фармакокинетические кривые характерных дозы у крыс для конъюгата 2 и составов наночастиц конъюгата 2 показаны на Фигуре 2. В Таблице 12 показаны расчеты для нормированной площади под кривой (AUC) для конъюгата 2 и наночастиц, содержащих конъюгат 2 на Фигуре 2.

Эти данные свидетельствуют о том, что наночастицы увеличивают AUC конъюгатов, тем самым демонстрируя, что нацеленные наночастицы могут быть синтезированы с использованием способов, описанных в настоящем документе, с желаемыми свойствами, указывающими на улучшенное применение для доставки лекарственных средств, например, для доставки химиотерапевтического средства к опухоли.

ПРИМЕР 14: Синтез конъюгатов DM1

Конъюгаты, содержащие DM1, были синтезированы в соответствии со следующими методиками:

Синтез промежуточных соединений

Nα-Me-Nα-Fmoc-Nε-Boc-лизин (640 мг, 1,31 ммоль) растворяли в диоксане (5 мл) и 4н HCl (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до тем пор, пока LCMS не показала окончательное снятие защиты. Реакционную смесь очищали хроматографией с обращенной фазой с получением Nα-Me-Nα-Fmoc-лизина (2', 500 мг, 1,31 ммоль, 100%-ый выход). Это вещество растворяли в DMF (5 мл) и диизопропилэтиламине (0,50 мл) и добавляли NHS эфир дотритил 3-меркаптопропионовой кислоты (875 мг, 1,98 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре и очищали хроматографией с обращенной фазой с получением Nα-Me-Nα-Fmoc-Nε-(STrt-пропионат)лизина (3', 600 мг, 0,843 ммоль, 64%-ый выход).

Fmoc-треонин(tBu)-OH нагружали на 2-хлортритиловый полимер (3,0 г полимера, 1,5 ммоль/г нагрузки). Многократное снятие защиты с помощью 4:1 DMF:пиперидин и соединение затем с Nα-Fmoc-Nε-Boc-лизином, Nα-Fmoc-Nⁱⁿ-Boc-D-трипотофан, Fmoc-тирозин(tBu), Nα-Me-Nα-Fmoc-Nε-(3STrt-пропионат)лизином и Fmoc-фенилаланином, используя стандартные условия SPPS, давало линейный пептид, присоединенный к полимеру. Расщепляли полимер с помощью 1% TFA в дихлорметане, а затем проводили циклизацию путем добавления по каплям раствора линейного пептида в 10 мл DMF в колбу с HATU (1,71 г, 4,5 ммоль) и HOAt (0,6M раствор, 7,5 мл, 4,5 ммоль) в DMF (45 мл) и диизопропилэтиламине (3,0 мл). После перемешивания в течение 3 ч при комнатной температуре все количество DMF удаляли в вакууме, а оставшееся вещество обрабатывали 95:2,5:2,5 TFA:EDT:вода в течение 30 мин, растворитель удаляли в вакууме, и оставшееся вещество очищали хроматографией с обращенной фазой с получением цикло[Phe-Nα-Me-Nε-(3STrt-пропионат)-Lys-Tyr-DTrp-Lys-Thr] (4', 427 мг, 0,447 ммоль, 10%-ый общий выход). LCMS M/Z: 956,5 [M+1].

Соединение 5' получали аналогично получению соединения 4'.

К раствору 5' трифторацетатной соли (380 мг, 0,387 ммоль) в DMF (5 мл) и диизопропилэтиламине (0,50 мл) добавляли раствор BocOSu (91,5 мг, 0,425 ммоль) в DMF (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, затем реакционную смесь нагружали на 50 г колонки C18 Isco. Элюирование 5%-75% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH давало соединение 6' (338 мг, 0,349 ммоль, 90%-ый выход).

Сосуд наполняли цикло[Phe-NMeGlu-Tyr-DTrp-Lys(Boc)-Thr] (6', 41,8 мг, 0,0431 ммоль), 3-малеимидопропиламином HCl (32,9 мг, 0,172 ммоль) и COMU (73,7 мг, 0,172 ммоль). Добавляли DMF (1 мл) и диизопропилэтиламин (0,10 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин добавляли дополнительное количество 3-малеимидопропиламина HCl (32,9 мг, 0,172 ммоль) и диизопропилэтиламина (0,10 мл), и реакционную смесь перемешивали еще 3 ч. Реакционную смесь подкисляли, добавляя уксусную кислоту (0,30 мл), добавляли воду (1 мл) для солюбилизации любого вещества, которое вышло из раствора. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (5%-75% ацетонитрил в воде с 0,1% AcOH) с получением соединения 7' (25,7 мг, 0,0233 ммоль, 54%-ый выход).

Сосуд наполняли цикло[Phe-NMeGlu-Tyr-DTrp-Lys(Boc)-Thr] (6', 39,0 мг, 0,0402 ммоль), S-Trt цистеамином (38,6 мг, 0,121 ммоль) и TBTU (38,8 мг, 0,121 ммоль). Добавляли DMF (1,0 мл) и диизопропилэтиламин (0,10 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (5%-95% ацетонитрил в воде с 0,1% AcOH) с получением соединения 8' (36,2 мг, 0,0285 ммоль, 71%-ый выход).

Сосуд наполняли Fmoc-STrt-цистеином (585 мг, 1,00 ммоль) и TBTU (330 мг, 1,03 ммоль). Добавляли DMF (4 мл), трет-октиламин (0,176 мл, 1,10 мл) и диизопропилэтиламин (0,30 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Добавляли пиперидин (2 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, и реакционную смесь нагружали на 50 г колонку C18 Isco, элюируя 15%-85% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH. Очищенный продукт сушили в вакууме, и выделенный продукт повторно растворяли в метаноле (10 мл). Добавляли 1н HCl (2 мл), и все растворители снова удаляли в вакууме с получением соли HCl S-тритилцистеин трет-октиламида (401 мг, 0,784 ммоль, 78%-ый выход).

Сосуд наполняли цикло[Phe-NMeGlu-Tyr-DTrp-Lys(Boc)-Thr] (6', 27,0 мг, 0,0279 ммоль), HCl S-тритилцистеин трет-октиламид (20,0 мг, 0,0391 ммоль) и TBTU (11,0 мг, 0,0343 ммоль). Добавляли DMF (1 мл) и диизопропилэтиламин (0,10 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (25%-95% ацетонитрил в воде с 0,1% AcOH) с получением соединения 9' (24,2 мг, 0,0170 ммоль, 61%-ый выход).

Колбу наполняли NHS эфиром тритил-3-меркаптопропионовой кислоты (1,02 г, 2,29 ммоль), и его растворяли в DMF (10 мл). Реакционную смесь охлаждали до 0°С и за раз добавляли 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамин (3,00 мл, 13,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин, затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь нагружали на колонку 100 C18 Isco, и элюирование 5%-85% ацетонитрилом в воде давало соединение 10' (552 мг, 1,00 ммоль, 44%-ый выход).

Соединения 11'-13' получали по аналогии с получением соединения 10':

Сосуд наполняли соединением 6' (27,6 мг, 0,0285 ммоль), соединением 10' (31,4 мг, 0,0570 ммоль) и TBTU (18,3 мг, 0,0570 ммоль). Добавляли DMF (1 мл) и диизопропилэтиламин (0,10 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (25%-95% ацетонитрил в воде с 0,1% AcOH) с получением соединения 14' (29,6 мг, 0,0197 ммоль, 69%-ый выход).

Соединения 15'-17' получали по аналогии с получением соединения 14':

Сосуд наполняли N-Boc-глутаминовой кислотой (125 мг, 0,506 ммоль), 3-малеимидопропиламином HCl (200 мг, 1,05 ммоль) и TBTU (330 мг, 1,03 ммоль), добавляли DMF (5 мл) и диизопропилэтиламин (0,30 мл), смесь подвергали воздействию ультразвука в течение 10 мин с получением однородной суспензии, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь подкисляли уксусной кислотой (0,50 мл), а затем разбавляли водой (2,0 мл). Реакционную смесь нагружали на 30 г колонку C18 Isco, и элюирование 5%-60% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH давало 18' (77,0 мг, 0,148 ммоль, 29%-ый выход). LCMS M/Z: 520,2 (M+1).

Соединение 19' получали аналогичным образом:

Сосуд наполняли соединением 18' (12,0 мг, 0,0233 ммоль), и TFA (1 мл) добавляли. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, затем все количество TFA удаляли в вакууме. Во втором сосуде растворяли цикло[Phe-NMeGlu-Tyr-DTrp-Lys(Boc)-Thr] (6', 20,0 мг, 0,0206 ммоль) и TBTU (9,0 мг, 0,0280 ммоль) в DMF (1 мл) и диизопропилэтиламин (0,15 мл). Этот раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, затем добавляли в сосуд с соединением 18' со снятой защитой. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, и реакционную смесь подкисляли, добавляя AcOH (0,20 мл). Реакционную смесь затем очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 15%-80% ацетонитрилом в воде с 0,2% AcOH с получением соединения 20' (11,6 мг, 0,0085 ммоль, 41%-ый выход).

Соединение 21' получали по аналогии с получением соединения 20':

Сосуд наполняли 2,2'-дитиодипиридином (110 мг, 0,500 ммоль) и его растворяли в метаноле (1 мл). Добавляли по каплям раствор 2-(бутиламино)этантиола (37,0 мкл, 0,250 ммоль) в метаноле (1 мл), перемешивали в течение 5 мин, и все количество метанола удаляли в вакууме. К остальному остатку добавляли раствор цикло[Phe-NMeGlu-Tyr-DTrp-Lys(Boc)-Thr] (6', 28,6 мг, 0,0295 ммоль) и TBTU (14,2 мг, 0,0443 ммоль) в DMF (2 мл) и диизопропилэтиламине (0,10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, и реакционную смесь затем нагружали на 30 г колонку C18 Isco, элюируя 40%-95% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH, с получением соединения 22' (21,1 мг, 0,0177 ммоль, 60%-ый выход). LCMS M/Z: 547,4 [(M+2 - Boc)/2].

Соединение 23' получали по аналогии с получением соединения 22':

f-цикло(CTwKTC)T-OH (24') синтезировали, нагружая Fmoc-треонин(tBu) на 2-хлортритиловый полимер, и присоединяя последующие аминокислоты стандартными химическими процедурами Fmoc с помощью Fmoc-S-тритилцистеина, Fmoc-треонин(tBu), Nα-Fmoc-Nε-Boc-лизина, Nα-Fmoc-Nⁱⁿ-Boc-D-триптофана, Fmoc-тирозин(tBu), Fmoc-S-тритилцистеина и Fmoc-D-фенилаланина. Окончательное снятие защиты достигали путем обработки 95:2,5:2,5 TFA:вода:триизопропилсилан. Сырой пептид сушили, взвешивали, растворяли в 1:1 ацетонитрил:вода и обрабатывали 2 экв. йода в метаноле с получением циклического дисульфида. Очистка на обращенной фазе давала желаемый пептид.

Соединения 25'-28' получали по аналогии с получением соединения 24':

К раствору 24' (50,0 мг, 0,0477 ммоль) в DMF (2 мл) и диизопропилэтиламине (0,10 мл) добавляли Boc₂O (52,0 мг, 0,238 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем реакционную смесь нагружали на 30 г колонку C18 Isco, элюируя 30%-95% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH с получением соединения 29' (42,0 мг, 0,0336 ммоль, 70%-ый выход).

Соединения 30'-34' получали аналогичным образом:

Соединение 35' синтезировали, нагружая 1,49 г Sieber амидного полимера (0,67 ммоль/г, 1,00 ммоль) FMoc-S-тритил-цистеином, и присоединения Fmoc-аланин, Fmoc-аланин, и Fmoc-треонин(tBu) посредством стандартной химической процедуры Fmoc. Расщепление полимера с помощью 95:3:2 дихлорметан:триизопропилсилан:TFA, а затем очистка препаративной ВЭЖХ давала соединение 35' (34,0 мг, 0,0514 ммоль, 5,1%-ый выход).

Колбу наполняли Fmoc-S-тритил-цистеинциклогексил амидом (514 мг, 0,771 ммоль) и добавляли воду (0,50 мл), TFA (10 мл) и триизопропилсилан (0,50 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин до тех пор, пока не исчезал желтый цвет, и все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток растворяли в DMF (2 мл) и добавляли раствор 2,2'-дитиодипиридина (1,03 г, 4,68 ммоль) в DMF (8 мл). По каплям добавляли 100 мм pH 7,4 фосфатный буфер (2,0 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. Реакционную смесь затем нагружали на колонку 50 g C18 Isco, и элюирование 35%-95% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH давало соединение 36' (174 мг, 0,326 ммоль, 42%-ый выход).

Сосуд наполняли соединением 36' (81,0 мг, 0,152 ммоль), и его растворяли в 4:1 DMF:пиперидин (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, и все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток еще раз растворяли в 4:1 DMF:пиперидин (2 мл), перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, и опять все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток растворяли в 1:1 метанол:толуол (5 мл), и все растворители удаляли в вакууме, для гарантии полного исчезновения всего количества оставшегося пиперидина. Сырой амин 37' затем непосредственно использовали в последующей реакции.

Колбу наполняли соединением 29' (18,4 мг, 0,0147 ммоль), S-Trt цистеамином (25,0 мг, 0,0783 ммоль) и COMU (30,0 мг, 0,0700 ммоль). Добавляли DMF (5 мл) и диизопропилэтиламин (0,10 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 5%-95% ацетонитрилом в воде с 0,2% AcOH, с получением соединения 38' (10,6 мг, 0,00684 ммоль, 47%-ый выход).

Соединения 39'-50' получали по аналогии с получением соединения 38'.

Цикло(CYwK(Boc)TC)T-OH (51') синтезировали, нагружая Fmoc-треонин(tBu) на 2-хлортритиловый полимер и присоединяя Fmoc-S-тритилцистеин, Fmoc-треонин(tBu), Nα-Fmoc-Nε-Boc-лизин, Nα-Fmoc-Nⁱⁿ-Boc-D-триптофан, Fmoc-тирозин(tBu) и Fmoc-S-тритил-цистеин, используя стандартные химические процедуры Fmoc. Не отщепляя N-концевую Fmoc группу пептид отщепляли от полимера с помощью 95:2,5:2,5 TFA:вода:триизопропилсилан, циклизовали вместе с йодом в 1:1 ацетонитрил:вода, обрабатывали Boc₂O и диизопропилэтиламином в DMF, и, наконец, обрабатывали 20% диэтиламином в дихлорметане, и очищали хроматографией с обращенной фазой с получением соединения 51'.

Соединения 52' и 53' получали по аналогии с получением соединения 51'.

К раствору октреотид ацетата (545 мг, 0,505 ммоль) в DMF (10 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,50 мл). Раствор затем охлаждали до -40°С и по каплям добавляли раствор BocOSu (119 мг, 0,553 ммоль) в DMF (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при -40°С в течение 1 ч, затем постепенно нагревали до комнатной температуры в течение 1 ч. Большую часть DMF удаляли в вакууме, и остальной остаток нагружали на 50 г колонку C18 Isco. Элюция 15%-60% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH давала Lys-Boc октреотид ацетат (54', 440 мг, 0,373 ммоль, 74%-ый выход) с >95% региоселективностью, определенной ¹H ЯМР.

Соединение 55', Lys-Boc вапреотид, получали по аналогии с получением соединения 54'.

Fmoc-аспарагиновую кислоту(tBu) нагружали на 2-хлортритиловый полимер и присоединения Fmoc-аспарагиновую кислоту(tBu), Fmoc-S-тритилцистеин и Ac₂O, используя стандартные химические методики Fmoc. Пептид отщепляли от полимера и очищали хроматографией с обращенной фазой. Очищенный пептид (50 мг, 0,067 ммоль) растворяли в дихлорметане (3 мл) и добавляли DCC (20,6 мг, 0,100 ммоль) и HOSu (11,5 мг, 0,100 ммоль), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Полученный раствор фильтровали, фильтрат концентрировали в вакууме, и сырой эфир NHS использовали как есть.

Колбу наполняли трифенилметантиолом (1,23 г, 4,45 ммоль) и дихлорметаном (7 мл), добавляли диизопропилэтиламин (1,0 мл) и акролеин (0,60 мл, 8,98 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, и все растворители удаляли в вакууме с получением тритил 3-меркаптопропиональдегида (57', 1,48 г, 4,45 ммоль), который использовали сырым в следующей стадии.

Соединения 58' и 59' получали по аналогии с получением соединения compound 57'.

Колбу наполняли этил 1-пиперазинилацетатом (1,03 г, 6,02 ммоль) и тритил 3-меркаптопропиональдегидом (2,00 г, 6,02 ммоль). Реагенты растворяли в дихлорметане (20 мл), добавляли уксусную кислоту (0,10 мл) и добавляли триацетоксиборгидрид натрия (3,19 г, 15,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем очищали хроматографией на силикагеле с получением соединения 60' (1,80 г, 3,69 ммоль, 61%-ый выход).

Соединение 60' (640 мг, 1,31 ммоль) растворяли в 10:1 этанол:вода (10 мл) и добавляли гидроксид лития (63,0 мг, 2,62 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем подкисляли 10% лимонной кислотой. Полученный твердый продукт фильтровали, промывали водой и сушили с получением 61' (400 мг, 0,870 ммоль, 66%-ый выход).

Соединение 61' (76,3 мг, 0,167 ммоль) растворяли в дихлорметан (2 мл). Добавляли DCC (51,5 мг, 0,250 ммоль) и HOSu (28,8 мг, 0,250 ммоль), реакционную смесь перемешивали в течение ночи, затем реакционную смесь фильтровали, и фильтрат концентрировали в вакууме. Полученный эфир NHS использовали сыром виде в следующей стадии.

К раствору соединения 61' (450 мг, 0,978 ммоль) в дихлорметане (15 мл) добавляли CDI (190 мг, 1,17 ммоль) в виде твердого вещества. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем добавляли гидрохлорид N,O-диметилгидроксиламина (114 мг, 1,17 ммоль) в виде твердого продукта. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, реакционную смесь промывали водой (15 мл), и органический слой сушили и концентрировали в вакууме с получением соединения 63' (200 мг, 0,398 ммоль, 41%-ый выход).

К раствору соединения 63' (50 мг, 0,099 ммоль) в THF (5 мл) при 0°С добавляли раствор алюмогидрида лития (0,13 мл, 1M в THF, 0,13 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 2 ч, затем гасили 1 н HCl (5 мл) и экстрагировали этилацетатом (10 мл). Органический слой сушили MgSO₄, и концентрирование в вакууме давало сырое соединение 64' (20 мг, 0,045 ммоль, 45%-ый выход), которое использовали сырым в следующей стадии.

Соединение 65' получали по аналогии с получением соединения 64'.

Колбу наполняли соединением 66' (200 мг, 0,388 ммоль) и его растворяли в 4:1 DMF:диэтиламин (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, и растворитель удаляли в вакууме. Полимер растворяли в нескольких каплях дихлорметана и добавляли диэтиловый эфир (20 мл) к выпавшему в осадок продукту. Сырое соединение 67' фильтровали и непосредственно брали для следующей стадии.

Сырое соединение 67' растворяли в DMF (5 мл) и добавляли NHS эфир тритил 3-меркаптопропионовой кислоты (173 мг, 0,388 ммоль), а затем диизопропилэтиламин (0,30 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, и реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ с получением соединения 68' (140 мг, 0,224 ммоль, 58%-ый выход).

Сосуд наполняли соединением 68' (40 мг, 0,064 ммоль), DCC (14 мг, 0,064 ммоль) и HOSu (7,4 мг, 0,064 ммоль). Добавили дихлорметан (2 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, и реакционную смесь фильтровали, фильтра собирали и концентрировали в вакууме, и сырое соединение 69', использовали непосредственно в следующей стадии.

Колбу наполняли N-Boc D-тирозинметиловым эфиром (1,00 г, 3,39 ммоль), трифенилфосфином (977 мг, 3,73 ммоль) и S-тритил-2-меркаптоэтанолом (1,08 г, 3,39 ммоль). В атмосфере азота добавляли THF (20 мл), а затем по каплям добавляли диэтилазодикарбоксилат (0,64 мл, 4,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, и растворитель удаляли в вакууме, и остальной остаток очищали препаративной ВЭЖХ с получением соединения 70' (880 мг, 1,48 ммоль, 44%-ый выход).

Соединение 70' (880 мг, 1,48 ммоль) растворяли в этаноле (20 мл) и воде (2 мл) и добавляли гидроксид лития (72 мг, 3,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, и реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ с получением соединения 71' (820 мг, 1,41 ммоль, 95%-ый выход).

Сосуд наполняли соединением 71' (58 мг, 0,10 ммоль), DCC (21 мг, 0,10 ммоль) и HOSu (11 мг, 0,10 ммоль). Добавляли дихлорметан (2 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, затем фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме и собранное сырое соединение 72' напрямую использовали в следующей стадии.

К раствору соединения 52' (62,0 мг, 0,0539 ммоль) в DMF (3 мл) добавляли NHS эфир тритил 3-меркаптопропионовой кислоты (90,0 мг, 0,202 ммоль). Добавляли диизопропилэтиламин (0,20 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакционную смесь затем нагружали на 30 г колонке C18 Isco, и элюирование 5%-95% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH давало соединение 73' (43,1 мг, 0,0291 ммоль, 54%-ый выход).

Соединения 74'-85' получали по аналогии с получением соединения 73'.

Соединение 54' (413 мг, 0,350 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл), метаноле (3 мл) и уксусной кислоте (0,25 мл). Добавляли соединение 57' (180 мг, 0,541 ммоль), а затем триацетоксиборгидрид натрия (115 мг, 0,541 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, и все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток растворяли в минимальном количестве DMF и нагружали на 50 г колонке C18 Isco. Элюирование 15%-85% ацетонитрилом в воде с 0,1% TFA давало соединение 86' в виде трифторацетатной соли (389 мг, 0,251 ммоль, 72%-ый выход).

Соединения 87'-94' получали по аналогии с получением соединения 86':

К раствору p-нитрофенилхлорформиата (145 мг, 0,719 ммоль) в дихлорметане (1 мл) и диизопропилэтиламине (0,20 мл) добавляли раствор S-тритилцистеамина (168 мг, 0,526 ммоль) в дихлорметаен (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и реакционную смесь непосредственно нагружали на 24 г колонку с силикагелем. Элюирование 0%-30% этилацетатом в гептане давало соединение 95' (120 мг, 0,247 ммоль, 47%-ый выход).

К раствору соединения 54' (162 мг, 0,137 ммоль) в THF (3 мл) и диизопропилэтиламине (0,50 мл) добавляли раствор соединения 95' (120 мг, 0,247 ммоль) в THF (1 мл). Добавляли DMAP (36,6 мг, 0,300 ммоль) в виде твердого вещества, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 6 ч. Все растворители удаляли в вакууме, и оставшееся вещество нагружали на 30 г колонке C18 Isco, элюируя 15%-95% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH с получением соединением 96' (201 мг, 0,137 ммоль, 100%-ый выход).

Сосуд наполняли соединением 88' (30,0 мг, 0,0190 ммоль), COMU (16,0 мг, 0,0,0374 ммоль) и соединением 11' (35,0 мг, 0,0896 ммоль). Добавляли дихлорметан (2 мл) и диизопропилэтиламин (0,20 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. Растворитель удаляли в вакууме, и оставшееся вещество нагружали на 30 г колонке C18 Isco, и элюирование 40%-95% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH давало соединение 97' (16,6 мг, 0,00903 ммоль, 47%-ый выход).

S-тритил-L-цистеин этилендиамин амид (40,0 мг, 0,0986 ммоль) и глутаровый ангидрид (45,0 мг, 0,395 ммоль) добавляли в DMF (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, и реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ с получением соединения 98' (30,0 мг, 0,0473 ммоль, 48%-ый выход).

Сосуд наполняли соединением 98' (8,0 мг, 0,0126 ммоль), соединением 54' (28,2 мг, 0,0252 ммоль), EDC (5,8 мг, 0,030 ммоль) и HOBt (4,1 мг, 0,30 ммоль). Добавляли DMF (2 мл) и диизопропилэтиламин (9 мкл, 0,05 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при 35°С в течение 16 ч. Реакционную смесь затем очищали препаративной ВЭЖХ с получением соединения 99' (21,0 мг, 0,00740 ммоль, 59%-ый выход).

Синтез конъюгатов DM1

Колбу наполняли DM-1 (41,8 мг, 0,0566 ммоль) и добавляли дихлорметан (2 мл), диизопропилэтиламин (0,10 мл) и акролеин (0,25 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и все растворители удаляли в вакууме. Остальной остаток снова растворяли в дихлорметане (1 мл) и толуоле (0,5 мл), и растворители снова удаляли в вакууме для гарантии полного удаления любого количества оставшегося аролеина. К остальному остатку добавляли раствор соединения 54' (61,0 мг, 0,0517 ммоль) в дихлорметане (2 мл) и уксусной кислоте (0,05 мл). Добавляли триацетоксиборгидрид натрия (11,5 мг, 0,0523 ммоль) в виде твердого вещества, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Все растворители удаляли в вакууме, и остальной остаток растворяли в TFA (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и большую часть TFA удаляли в вакууме. Оставшееся вещество очищали препаративной ВЭЖХ (5%-55% ацетонитрил в воде с 0,2% AcOH) с получением Конъюгата 100 в виде ацетатной соли (7,6 мг, 0,0040 ммоль, 7,6%-ый выход). LCMS M/Z: 899,0 [(M+2)/2].

К раствору 2,2'-дитиодипиридина (1,24 г, 5,65 ммоль) в DMF (8 мл) и диизопропилэтиламине (1 мл) по каплям добавляли раствор DM-1 (417 мг, 0,565 ммоль) в 2 мл DMF в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 30 мин, и реакционную смесь нагружали на колонку C18 Isco gold. Элюирование 25%-85% ацетонитрилом в воде давало DM1-SSPy (287 мг, 0,339 ммоль, 60%-ый выход). LCMS M/Z: 847,3 [M+1].

Сосуд наполняли соединением 4' (20,0 мг, 0,0209 ммоль) и добавляли раствор DM-1/SSPy (17,7 мг, 0,0209 ммоль) в DMF (2 мл). По каплям добавляли 100 мм pH 7,4 фосфатный буфер (1,0 мл), при этом быстро перемешивая, и реакционную смесь перемешивали еще 5 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (5%-65% ацетонитрил в воде с 0,2% AcOH) с получением Конъюгата 10 (22,1 мг, 0,0126 ммоль, 60%-ый выход) в виде ацетатной соли. LCMS M/Z: 837,5 [(M+2-H₂O)/2].

Способ А конъюгирования DM-1: Сосуд наполняли соединением 8' (20,2 мг, 0,0159 ммоль) и добавляли воду (0,025 мл), TFA (1 мл) и триизопропилсилан (0,025 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и все растворители удаляли в вакууме. К остальному остатку добавляли раствор DM-1/SSPy (13,5 мг, 0,0159 ммоль) в DMF (3 мл). При перемешивании по каплям добавляли 100 мм pH 7,4 фосфатный буфер (1 мл), и реакционную смесь перемешивали еще 5 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь затем подкисляли уксусной кислотой (0,25 мл). Реакционную смесь затем очищали препаративной ВЭЖХ (5%-70% ацетонитрил в воде с 0,2% AcOH) с получением Конъюгата 14 (9,3 мг, 0,0054 ммоль, 34%-ый выход) в виде ацетатной соли. LCMS M/Z: 832,3 [(M+2)/2].

Способ В конъюгироваия DM-1: Сосуд наполняли соединением 22' (21,2 мг, 0,0177 ммоль) и добавляли TFA (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и все растворители удаляли в вакууме. К остальному остатку добавляли раствор DM-1 (13,1 мг, 0,0177 ммоль) в DMF (2 мл). При перемешивании по каплям добавляли 100 мм pH 7,4 фосфатный буфер (1 мл), и реакционную смесь затем перемешивали при комнатной температуре в течение еще 5 мин. Реакционную смесь подкисляли, добавляя уксусную кислоту (0,25 мл), и реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (5%-75% ацетонитрил в воде с 0,2% AcOH) с выходом Конъюгата 22 (20,2 мг, 0,0114 ммоль, 64%-ый выход) в виде ацетатной соли. LCMS M/Z: 860,5 [(M+2)/2].

Способ С конъюгирования DM-1: Сосуд наполняли соединением 7 (25,7 мг, 0,0233 ммоль) и добавляли TFA (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, и все растворители удаляли в вакууме. К остальному остатку добавляли раствор DM-1 (17,2 мг, 0,0233 ммоль) в DMF (4 мл), а затем диизопропилэтиламин (0,25 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, и затем подкисляли, добавляя уксусную кислоту (0,40 мл). Реакционную смесь затем очищали препаративной ВЭЖХ (5%-70% ацетонитрил в воде с 0,2% AcOH) с получением Конъюгата 12 (25,6 мг, 0,0142 ммоль, 61%-ый выход) в виде ацетатной соли. LCMS M/Z: 872,0 [(M+2)/2].

Синтез соединения 57A. Fmoc-Цистеин(Trt)-OH нагружали на 2-хлортритиловый полимер (25,0 г полимер, 100-200, 1 meq/г нагрузка). Многократное снятие защиты с помощью 4:1 DMF:пиперидин и последующее соединение с Fmoc-Треонин(tBu)-OH, Nα-Fmoc-Nε-Boc-лизином, Nα-Fmoc-Nⁱⁿ-Boc-D-триптофаном, Fmoc-тирозин(tBu), Fmoc-Цистеин(Trt)-OH и Boc-D-фенилаланином, используя стандартные условия SPPS (Nature Prot. 2012, 432), давало линейный пептид связанный с полимером. 8 г полимера (0,338 ммоль/g) перемешивали с DMF (80 мл), содержащим йод (3 экв.) в течение 3 ч при кт, затем фильтровали и промывали DMF (2×40 мл). Полимер снова обрабатывали йодом (3 экв.) в DMF (80 мл) в течение 3 ч. Полимер промывали DMF (2×40 мл), затем DCM (2×40 мл), и полимер сушили в вакууме при кт.

Полимер (8 г, 0,338 ммоль/g) увеличивали в объеме в DCM (80 мл) и добавляли гексафторизопропанол (30 мл) в течение ~1 мин. Полученную смесь перемешивали в течение 30 мин при кт, затем фильтровали и промывали DCM (2×40 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме при 20-25°C. Полимер снова помещали в условия расщепления вместе с DCM (80 мл) и гексафторизопропанолом (30 мл), перемешивали в течение 30 мин, затем фильтровали и промывали DCM (2×40 мл). Фильтрат упаривали при пониженном давлении при 20-25°С. Сырой осадок растворяли в MTBE (минимальное количество), затем по каплям добавляли в н-гептан, перемешивая при кт с получением осадка. Твердое вещество фильтровали и сушили при кт с выходом соединения 57A (2,95 г, 2,17 ммоль, 80%-ый выход). LCMS M/Z: 1361 [M+1].

100 мл RBF наполняли соединением 57A (2,73 г, 2,01 ммоль) и (2R)-2-амино-3-тритилсульфанилпропанамид (728,60 мг, 2,01 ммоль). Добавляли дихлорметан (27,00 мл), затем идиизопропилэтиламин (519,54 мг, 4,02 ммоль) и HATU (840,69 мг, 2,21 ммоль). Через 1,5 ч превращение завершалось по данным ВЭЖХ/MS. 27 г силикагель (10 взвешивание) нагружали в сосуд из фриттованного стекла. 40:60 TBME/DCM использовали для того, чтобы увлажнить силикагель. Добавляли раствор DCM сверху силикагеля, затем элюировали 40:60 TBME/DCM (250 мл), а затем 2% изопропанол в 40:60 TBME/DCM (250 мл). Фильтрат упаривали. Получали желаемый продукт, соединение 57B (3,16 г, 92%-ый выход). LCMS M/Z: 1705 [M+1].

Способ А снятия защиты. Соединение 57B (500,00 мг, 293,23 мкмоль) нагружали в 50 мл RBF, добавляли 2,2'-дитиодипиридин (129,85 мг, 589,39 мкмоль) и триизопропилсилан (386,81 мг, 2,44 ммоль), а затем гексафторизопропанол (8 мл), затем 8 мл 0,5 M HCl в гексафторизопропаноле (8 мл). Через 2 ч ВЭЖХ/MS показала полное превращение. Раствор медленно добавляли в TBME (30 мл), и образованный осадок фильтровали, затем промывали TBME (30 мл). Твердое вещество растворяли в 1 M AcOH (8 мл), и раствор перемешивали при КТ в течение 2 ч. ВЭЖХ/MS показало полное превращение в желаемый продукт. Сырую смесь напрямую вносили путем инъекции на 100 г колонку C18 Isco gold. Колонку промывали 360 мл (3 объема) 100 мм ацетатом аммония, затем уравновешивали с помощью 5% ацетонитрила в воде с 0,1% AcOH (2 объема) и элюировали, используя градиент 5%-30% ацетонитрил в воде с 0,1% AcOH в течение 24 мин. Чистые фракции лиофилизировали с получением соединения 57C в виде ацетатной соли. LCMS M/Z: 1160 [M+1].

Способ В снятия защиты. Колбу наполняли соединением 57C (502 мг, 0,294 ммоль). Другой сосуд наполняли TFA (8,8 мл), триизопропилсиланом (0,20 мл), водой (0,50 мл) и тиоанизолом (0,50 мл). Этот сосуд трясли до тех пор, пока смесь не становилась гомогенной, затем добавляли смесь для снятия защиты к твердому веществу 57C. Колбу перемешивали до тех пор, пока все не переходило в раствор, затем перемешивали при комнатной температуре в течение еще 30 мин. ВЭЖХ/MS показывала полное снятие защиты. TFA удаляли в вакууме до объема реакционной смесь приблизительно 1 мл. Добавляли этанол (30 мл) в реакционную смесь, раствор охлаждали до 0°C, затем добавляли раствор 2,2'-дитиодипиридина (130 мг) в 10 мл этаноле. Раствор перемешивали при 0°C в течение 1 ч, затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. ВЭЖХ/MS показало полное превращение в продукт SSPy. Добавляли пиридин (5 мл), раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, затем все растворители удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 2 мл DMF и 8 мл 1% AcOH в воде, нагружали на 100 г колонку C18 Isco gold. Колонку промывали 360 мл (3 объема) 100 мм аммония ацетата, затем уравновешивали 5% ацетонитрилом в воде с 0,1% AcOH (2 объема) и элиюировали, используя градиент 5%-30% ацетонитрила в воде с 0,1% AcOH в течение 24 минут. Чистые фракции лиофилизировали с получением 57C в виде ацетатной соли. Выделяли 241 мг (61,5%-ый выход). LCMS M/Z: 1160 [M+1].

100 мл RBF наполняли бис-ацетатной солью соединением 57C (210 мг, 0,164 ммоль) и растворяли в THF (4 мл) и 0,2M AcOH (3,6 мл) и 0,2M NaOAc (0,4 мл). Соединение 57C проверяли с помощью LCMS путем взятия аликвоты 2 мкл и растворяя в 50 мкл метаноле, и проводя способ ниже. В реакционную смесь добавляли раствор DM-1 (124 мг, 0,167 ммоль) в THF (4 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. 2 мкл-овую аликвоту удаляли, растворяли, используя 50 мкл метанол, и проверяли LCMS. Область BT-891:область BT-976 составляет >10:1 при 280 нм, и реакцию оценивали как завершенную. Все растворители удаляли в вакууме при температуре бани 35°C, и при 10 мбар в течение 45 мин для удаления всей воды. Остальной остаток растворяли в 1 мл DMF, и его растворяли 3 мл водного раствора 1% уксусной кислотой. Этот раствор нагружали на 50 г колонку RediSep Rf Gold C18 (размер частиц 20-40 микрон). Добавляли еще 1 мл DMF и 3 мл 1% уксусной кислотой в реакционную колбу, и смесь также нагружали на колонку C18. Колонку элюировали 40 мл/мин градиентом, 17 мин пробега. 2 мин @ 5% ацетонитрила в воде с 0,1% AcOH, затем 15 мин градиент 5%-40% ацетонитрила в воде с 0,1% AcOH. Продукт элюировали как единичный пик 35% ацетонитрилом. Элюированные фракции собирали, большую часть растворителя удаляли в вакууме до тем пор, пока общий объем не становился 5 мл. Этот раствор переносили в желтую колбу, и использовали 5 мл 1:1 смеси ацетонитрил:вода для ополаскивания колбы и переносили в желтую колбу. 2 мкл аликвоту разбавляли 50 мкл метанолом, проверяли способом LCMS ниже. Полученный раствор замораживали, помещая на баню сухой лед/ацетонитрил, и сушили в настольной лиофильной сушилке при 200 миллиторр в течение 3 дней. Выделенное соединение 57 в виде бис-ацетатной соли (262 мг, 0,137 ммоль, 84%-ый выход). LCMS M/Z: 893,4 [(M+2)/2].

Пример 19: Эффект Коньюгата 10 и Конъюгата 10 соединений NP6 на рост опухоли и фармакокинетикие исследования

Заявители оценили активность конъюгата и состав наночастиц конъюгата in vivo. В этих экспериментах была протестирована способность соединений оказывать влияние на рост NCI-H69 SCLC человека. Для in vivo исследования 8 недельным самкам "голых" мышей NCR прививали подкожно в правый бок 2 млн. клеток в 1:1 среде RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA)/Matrigel® (BD Biosciences, San Jose, CA). Измерения опухоли проводили два раза в неделю, используя штангенциркуль. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V=0,5 × ширина × ширина × длина.

Если опухоль приближалась к объему 200 мм³, то мышей случайным образом разделяли на четыре группы по десять животных. Мышей обрабатывали контролем с носителем (10% пропиленгликоль в воде для инъекций), Конъюгат 10 при 2 мг/кг (10% пропиленгликоль в воде для инъекций), Конъюгат 10 NP6 наночастиц в 2 мг/кг (10% сахароза) или DM1 при 0,8 мг/кг (10% пропиленгликоль в воде для инъекций). Мышам вводили две дозы один раз в неделю. Конечные объемы опухолей проанализировали, используя однофакторный дисперсионный анализ и критерий множественного сравнения Тьюки. За объемом опухолей следили вплоть до 100 дней, как показано на Фиг.4.

Как показано на Фиг.4, объем опухоли быстро увеличивался в случае введения контролей с носителями и DM1. Один конъюгат 10 сначала давал регрессию опухоли, но опухоль снова вырастала в течение исследования. Конъюгат 10 NP6 давал полное излечение, т.е. 9 из 9 мышей были без опухоли в течение 100 дней после введения двух доз в 1-ый и 8-ой дни. Кривая объема опухоли Каплана-Мериера процента мышей с размером опухоли менее, чем 2000 мм³ на Фиг.5 показывает, что в течение 100 дней ни одно животное не выбывало из исследования в группе с Конъюгатом 10 NP6, но в группе с Конъюгатом 10 одно из трех животных было исключено из исследования из-за большого размера опухоли.

Исследование объема опухоли повторяли с тремя дозами для носителя, Конъюгата 10 (0,7 мг/кг каждая) и Конъюгата 10 NP6 (0,7 мг/кг каждая). За объемом опухолей следили в течение 30 дней. Результаты представлены на Фиг. 6. Конъюгат 10 NP6 снова показал значительно более высокую эффективность, чем свободный Коньюгат 10.

Также проводили фармакокинетические исследования в плазме крови крыс. рК плазмы крысы Коньюгата 10 и Конъюгата 10 NP6 было показано на Фиг.7. Значения AUC были показаны в Таблице 16. Включение Коньюгата 10 в наночастицы увеличивает AUC Коньюгата 10 примерно в 10 раз.

Ответ фосфо-гистона H3 в опухолях NCI-H69 был показан на Фиг.8. Увеличение фосфо-гистона H3 наблюдали в опухолях после обработки Конъюгатом 10 и Конъюгатом 10 NP6. Примерно в 50 час ответ фосфо-гистон H3 свободного Конъюгата 10 начал снижаться, а ответ фосфо-гистона H3 Конъюгата 10 NP6 оставался высоким. На основании фармакокинетических исследований было сделано предположение о том, что Конъюгат 10 NP6 задерживает и удлиняет ответ.

Таким образом, конъюгаты, включенные в наночастицы, являются гораздо более эффективными, чем только конъюгаты и только DM1.

Объем настоящего изобретения ограничен прилагаемой формулой изобретения, а не приведенным выше описанием.

В формуле изобретения единственное число может также означать множественное, если не указано иного, или иным образом очевидно из контекста. В формуле изобретении или описании "или" между одним или несколькими членами группы считаются выполненными, если один, более одного или все члены группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу, если не указано иного, или иным образом не очевидно из контекста. Изобретение включает варианты осуществления, в которых присутствует, используется или иным образом имеет отношение к данному продукту или процессу только один член группы. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых более одного или все члены группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу.

Следует также отметить, что термин "содержащий" является открытым и позволяет, но не требует, включения дополнительных элементов или стадий. Когда в описании используется термин "содержащий", то термин "состоящий из", таким образом, также включен и раскрыт.

Там, где приведен диапазон, конечные точки включены. Кроме того, следует понимать, что если не указано иного, или если это не очевидно из контекста и для понимания средним специалистом в данной области, то значения, которые выражены в виде диапазонов, могут принимать любое конкретное значение или поддиапазон в пределах указанных диапазонов в различных вариантах осуществления настоящего изобретение, до десятой единицы нижнего предела диапазона, если из контекста не очевидно обратное.

Кроме того, следует понимать, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который относится к предшествующему уровню техники, может быть исключен из любого одного или нескольких пунктов формулы изобретения. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными среднему специалисту в данной области, то они могут быть исключены, даже если исключение не явно указано в настоящем документе. Любой конкретный вариант осуществления композиции по настоящему изобретению может быть исключен из одного или нескольких пунктов формулы изобретения, по любой причине, независимо от того, относится он или нет к предшествующему уровню техники.

Все цитированные источники, например, ссылки, публикации, базы данных, записи в базе данных, и уровне техники, цитированные в настоящем документе, включены в настоящую заявку в качестве ссылки, даже если это и не указано в этой цитате. В случае противоречивых высказываний цитируемого источника и настоящей заявки, то указание в настоящей заявка является контрольным.

Раздел и табличные заголовки не предназначены для ограничения.