Способ ранней диагностики нарушения углеводного обмена

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для выявления нарушений углеводного обмена на ранних стадиях и выявление скрытого диабета на фоне нормальных показателей глюкозы и гликозилированного гемоглобина.

Экспрессия рецепторов для IgE на клетках островков Лангерганса в частности FCeRI; CD14; FCeRII (CD23), и участие этих рецепторов в созревании клеток островков Лангерганса (Хаитов P.M. Система маркерных антигенов CD. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 280 с; KatohN., KraftS., Wessendorfl, BieberT. The high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI) blocks apoptosis in normal human monocytes. J. Clin. Invest., 2000, Vol. 105, no. 2, pp. 183-190) свидетельствуют, что они могут быть маркерами нарушений углеводного обмена разной степени тяжести и отражать роль IgE в формировании полноценности клеток, отвечающих за продукцию инсулина.

Известно, что уровень сывороточного IgE служит маркером генетически обусловленного типа иммунной реактивности, который отражает вероятный баланс Th1/Th2. Усиление поликлонального IgE ответа считают маркером экспансии Th2 (Кологривова И.В., Суслова Т.Е., Кошельская О.А. и др. Влияние глюкозы и инсулина на секрецию цитокинов мононуклеарами периферической крови in vitro // Иммунология. 2013. Т. 34. №5. С. 267-270). По данным зарубежных исследователей (K1amt S., Vogel М., Hiemisch A., Prensel F., Zachariae S., Ceglarik U., Thiery I., Kiess W. Association between IgE mediated allergiesand diabetes mellitus tupe 1 in children and adolescents // Pediatric Diadetes. 2015. V. 16. P. 493-503) существует связь между IgE-опосредованной аллергизацией и сахарным диабетом 1 типа. Известно утверждение, что сахарный диабет 1 типа характеризуется иммунологической реакцией, в которой доминируют Th1 клетки, в то время, как IgE-опосредованная аллергия связана с Th2 клетками. В соответствии с Th1/Th2 гипотезой иммунная система развивается либо через Th-клетки, либо через Th2-клетки. Это означает, что развитие IgE-опосредованной аллергии будет понижать риск развития сахарного диабета 1 типа (Роер В.О. Роль Т-клеток в патогенезе сахарного диабета 1 типа: от причин до лечения // Диабетология. 2003. Т. 46. С. 305-321).

Известно, что низко аффинный рецептор IgE-CD23 (Fc эпсилон RII) является гликопротеиновымлектиновым рецептором типа С, содержит домен, характерный для Са-зависимых углеводсвязывающих белков, содержит 1 потенциальный сайт N-гликозилирования (Хаитов P.M. Система маркерных антигенов CD. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013.-280 с.). Анализ известного биохимического строения этого рецептора позволяет с высокой степенью вероятности определить его метаболическое участие в углеводном обмене.

Известен способ диагностики сахарного диабета 2 типа (Шабалова Н.П. Диагностика и лечение эндокринных заболеваний у детей и подростков // Под ред. Проф., 2-е изд. М. 2009. 527 с. (С. 113, 120)), путем оценки толерантности к глюкозе с помощью пероральной сахарной нагрузки (глюкозотолерантный тест), при этом в соответствии со стандартными критериями, при значениях глюкозы в крови 7,8-11 ммоль/л через 2 часа после пероральной сахарной нагрузки диагностируют нарушение толерантности к глюкозе; более 11 ммоль/л диагностируют сахарный диабет.

Однако способ проводят в условиях in vivo, а не in vitro, что создает некомфортные условия пациенту, провоцирует транзиторную латентную гипергликемию. Данный способ не дает возможность оценить степень нарушения углеводного обмена и определить ранние стадии этих нарушений, выявить скрытую форму диабета.

Для диагностики латентной формы диабета используют способ определения процентного содержания гликогемоглобина (HbA1c) в крови (Reynolds TM, Smellie WS, Twomey PJ. Glycated haemoglobin (HbA1c) monitoring. BMJ. 2006; 333 (7568):586-588), основанный на аффинной хроматографии в микроколонке гликированной и негликированной фракции гемоглобина гемолизата крови. Измерение оптических плотностей обеих фракций позволяет рассчитать по формуле относительное содержание HbA1c. Метод используют для диагностики скрытой формы диабета, для оценки качества лечения сахарного диабета и ретроспективной оценки декомпенсации больных сахарным диабетом, а также оценки состояния больных диабетом в момент обследования. Норма HbA1c составляет от 4 до 6,2% (более 6,5 - заключение: предполагаемый сахарный диабет, проведение дополнительных анализов).

Недостатком аналога является то, что он имеет погрешность, которая возникает при анализе больных гемоглобинопатиями или анемий, при заболеваниях щитовидной железы, а также необходимо отметить, что уровень HbA1c практически всегда коррелирует с уровнем глюкозы в крови, что не позволяет использовать этот тест для прогнозирования и выявления скрытого диабета или предрасположенности к нему.

За прототип выбран способ диагностики доклинической формы нарушения углеводного обмена, использующийся для определения вкусовой чувствительности к глюкозе у потомков больных сахарным диабетом (пат. 2140204 Рос. Федерация: МПК А61В 10/00 (1995.01)/ Романенко И.А. заявитель и патентообладатель Ивановская гос. мед. академия. - №97113836/14; заявл. 11.08.1997; опубл. 27.10.1999).

Метод заключается в том, что для приготовления проб используют лимонную кислоту и глюкозу, для оценки вкуса, в качестве контроля индифферентного вкуса используют дистиллированную воду. Наносят на кончик языка и боковые поверхности соответственно. Проводят идентификацию вкуса к этим раздражителям, выявляют лиц со снижением абсолютного порога вкусовой чувствительности к глюкозе и при изменении восприятия к ней вкусовыми рецепторами с нормальным восприятием кислого вкуса и адекватной оценки безвкусной пробы (дистиллированная вода), диагностируют доклинические формы, патологии углеводного обмена.

Недостатком прототипа является то, что способ оценивается по субъективным параметрам ощущений пациента, не поддающихся оценке с помощью цифровых показателей. Метод не пригоден для диагностических целей в плане оценки нарушений углеводного обмена, так как рассчитан на определение вкусовой чувствительности у здоровых людей, в нем предусмотрена регистрация вкусового восприятия всех вкусовых раздражителей.

Задачей нашего изобретения является разработка способа ранней диагностики нарушений углеводного обмена in vitro, когда глюкоза и гликозилированный гемоглобин HbA1c находятся в норме предшествующих возникновению толерантности к глюкозе и инсулинрезистентности.

Поставленная задача достигается тем, что в данный способ диагностики нарушения углеводного обмена, включающий определение уровня специфического IgE к инсулину (кЕ/л) путем твердофазного неконкурентного непрямого ИФА, определение уровня инсулина (мкЕ/мл) с помощью двух стадийного "сэндвич" варианта твердофазного ИФА в сыворотке крови, рассчитывают IgE-инсулиновый индекс (IgE/I)Ha основании расчета отношения показателя уровня IgE к инсулину к уровню инсулина:

где IgE/I-IgE-инсулиновый индекс;

- IgЕ_инс - показатель уровня IgEк инсулину в сыворотке крови, кЕ/л;

инсулин-показатель концентрации инсулина в сыворотке крови, мкЕ/мл.

Оценку результатов нарушений углеводного обмена осуществляют с помощью шкалы (табл. 1), прогрессивное снижение индекса указывает на степень нарушения углеводного обмена:

1) индекс более 5,0 - нормальный уровень углеводного обмена;

2) индекс 4,0-4,9 - пограничная ситуация;

3) индекс 3,0-3,9 - при прогрессивном снижении индекса констатируем нарушение углеводного обмена, есть предрасположенность к сахарному диабету;

4) индекс 2,1-2,9 - выраженное нарушение углеводного обмена, скрытый диабет;

5) индекс менее 2,0 - нарушение толерантности к глюкозе, сахарный диабет.

Способ осуществляется следующим образом.

Первым этапом производится забор крови из пальца, центрифугируют для получения сыворотки. Вторым этапом определяют количественное содержание специфического IgE к инсулину в сыворотке крови при помощи иммуноферментного метода с применением диагностического набора для ИФА(Ig Е-Ат-ИФА) серии «Иммунотекс» (Ставрополь). В лунку с аллергенами, сорбированными на поверхности полистиролового планшета вносят по 90 мкл рабочего промывающего раствора (РПР) и по 10 мкл анализируемых проб сыворотки крови. Инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, после промывают 3 раза РПР. Затем вносят во все лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител к IgE и инкубируют при t°C 37°С в течение часа. Образовавшиеся иммунные комплексы выявляют ферментативной реакцией с Н₂О₂ и раствором ТМБ. Результаты реакции оцениваются на спектрофотометре с длиной волны 450 нм.

Третий этап заключается в определении содержания инсулина в сыворотке крови, который определяют с помощью двух стадийного «сэндвич» варианта твердофазного иммуноферментного метода с применением диагностического набора для ИФА. На первом этапе в лунки с иммобилизованными моноклональными антителами (МКА) вносят исследуемые образцы по 25 мкл сыворотки крови. На втором этапе, связавшийся в лунках инсулин обрабатывают по 100 мкл конъюгатом МКА к инсулину. Образовавшиеся иммунные комплексы «МКА-инсулин-конъюгат» выявляют ферментативной реакцией с Н₂О₂ и раствором ТМБ. Результаты реакции оцениваются на спектрофотометре с длиной волны 450 нм.

Четвертым этапом определяют IgE-инсулиновый индекс (IgE/I) для этого показатель уровня специфических IgE к инсулину делят на показатель концентрации самого инсулина, получают индекс отношения (IgE - инсулиновый индекс), полученный индекс отражает количество несвязанных с инсулином иммуноглобулинов Е. Чем меньше показатель этого отношения, тем больше степень нарушения углеводного обмена, в условиях нормальных показателей глюкозы и HbAlc.

Учет результатов производят по шкале путем оценки состояния углеводного обмена по расчетному инсулиновому индексу IgE/I (табл. 1).

Предлагаемая шкала основана на анализе 5 основных групп (из 156 человек), которые были разбиты по возрастному критерию, расовому признаку, уровню глюкозы и HbAlc и индексу отношения концентрации IgEинс к концентрации инсулина (IgE/I) (табл. 2).

Верификацию, диагноз заболевания и степень компенсации углеводного обмена осуществляют квалифицированные специалисты г. Ростова-на-Дону согласно рекомендациям ВОЗ (1999) и «Национальным стандартам оказания медицинской помощи больным сахарным диабетом».

1 группа здоровых молодых людей (n=24) в возрасте от 17 до 30 лет со средним значением глюкозы 5,06±0,07 ммоль/л и HbAlc 5,4±0,06%. Средний уровень IgEинс составил 151±12,2 кЕ/л, инсулина 7,0±2,2 мкЕ/мл. Соответственно, средний показатель отношения IgEинс/инс (IgE/I) для этой группы = 22.

2 группа здоровых молодых людей из Нигерии (n=7) в возрасте от 17 до 22 лет с средним значением глюкозы 5,1±0,03 ммоль/л и HbAlc 5,1±0,12%, средний уровень IgEинс ставил 283±118,2 кЕ/л, инсулина 2,9±0,8 мкЕ/мл. Соответственно, вычисленный показатель отношения IgEинс/инс(IgE/I) составил 97.

3 группа здоровых молодых людей, средние показатели группы 1 + группы 2 (n=31) в возрасте от 17 до 30 лет с средним значением глюкозы 5,08±0,02 ммоль/л и HbA1c 5,25±0,15%. Средний уровень IgEинс составил 217±66 кЕ/л, инсулина 5,1±2,2 мкЕ/мл. Соответственно, средний показатель отношения IgЕинс/инс для этой группы (IgE/I)=42.

4 группа здоровых людей (n=19) в возрасте от 38 до 65 лет с средним значением глюкозы 5,03±0,07 ммоль/л и HbA1c 5,2±0,06%, средний уровень IgEинс составил 100±34,4 кЕ/л, инсулина 7,8±2,6 мкЕ/мл. Соответственно, определенное отношение IgEинс/инс (IgE/I)=13.

Таким образом, в группе 1-4 продемонстрированы граничные параметры IgE-инсулинового индекса нормы для здоровых людей разного возраста.

Группа 5 - взрослые люди с нарушением углеводного обмена (n=30) в возрасте от 31 до 90 лете средним уровнем глюкозы 6,5±0,13 ммоль/л и HbA1c 6,1±0,07%, средний уровень IgEинс составил 48,3±14,3 кЕ/л, инсулина 13,0±2,2 мкЕ/мл. Соответственно, определенное отношение IgEинс/инс (IgE/I)=3,7.

Группа 6 - молодые люди с сд I типа (n=10), принимающие инсулин в возрасте от 19 до 34 лет со средним уровнем глюкозы 9,0±1,5 ммоль/л и HbA1c 7,6±0,8%. Средний уровень IgEинс составил 135,6±56 кЕ/л, а инсулина 46±13,7 мкЕ/мл. Соответственно, отношение IgEинс/инс (IgE/I) для этой группы составил лишь 2,9, что ниже контрольной группы 3 (здоровых молодых людей) в 55 раз.

Группа 7 - взрослые люди с выраженным нарушением толерантности к глюкозе (n=35) в возрасте от 43 до 78 лет с средним уровнем глюкозы 10,9±0,13 ммоль/л и HbA1c 8,4±0,07%, средний уровень IgEинс составил 28,8±3,47кЕ/л, инсулина 19,2±0,9 мкЕ/мл. Соответственно, определенное отношение IgЕинс/инс (IgE/I)=1,5.

Следовательно, мы наблюдаем прогрессивное снижение индекса отношения IgEинс/инс, в зависимости от возраста и степени нарушения углеводного обмена. Таким образом, на основании изменения IgE-инсулинового индекса отношения IgEинс/инс можно констатировать уровень нарушения углеводного обмена, когда показатели глюкозы и HbA1c еще остаются в норме.

Способ осуществляют путем изучения содержания специфического IgE к инсулину и инсулина в сыворотке крови обследуемых лиц, что позволяет выдвинуть гипотезу о регуляторной роли IgE к инсулину. Так как, чем больше продуцируется инсулина в ответ на глюкозу, тем меньше концентрация IgE к инсулину и чем меньше инсулина, тем больше «несвязанного» IgE.

Пример 1. Пациент - женщина 50 лет, имеет уровень глюкозы 4,6 ммоль/л, HbAlc - 5,2%, IgEинс - 49,6 кЕ/л, инсулина - 1,0 мкЕ/мл. Согласно шкале индекс IgE/I = 49,6 (более 5,0), что указывает на нормальный уровень углеводного обмена, и подтверждается хорошим самочувствием и отсутствие физиологических и клинических признаков, характерных для нарушения углеводного обмена.

Пример 2. Женщина 50 лет - тот же пациент, что в случае 1, но в период вялотекущей вирусной инфекции с уровнем глюкозы - 4,6 ммоль/л, HbAlc - 5,2%, уровнем IgEинс - 54,4 кЕ/л, инсулина - 12,9 мкЕ/мл, соответственно, отношение IgE/I = 4,2. Видно, что на фоне вирусной инфекции увеличился уровень продукции инсулина и уменьшился несвязанный IgEинс (в 4,2 раза) на фоне нормальных показателей глюкозы и HbAlc. Такая ситуация по нашей шкале соответствует IgE/I - 4,0-4,9 и считается пограничной.

Пример 3. Женщина 73 года с уровнем глюкозы - 4,1 ммоль/л, HbAlc - 4,9%, уровень IgEинс - 35,3 кЕ/л, инсулина - 13,9 мкЕ/мл, IgE/I = 2,5. Видим, что на фоне нормальных показателей глюкозы и HbAlc, IgE/I индекс в диапазоне 2,1-2,9 по шкале, что свидетельствует о возрастном нарушении углеводного обмена и ведет к сахарному диабету.

Пример 4. Девушка 20 лет, с уровнем глюкозы 6,6 ммоль/л и гликозилированного гемоглобина 6,5%, уровень IgEинс составил 36,9 кЕ/л, а средний уровень инсулина - 100,0 мкЕ/мл. Отношение IgE/I для этого пациента = 0,4, что соответственно по шкале (индекс менее 2,0) свидетельствует о нарушении толерантности к глюкозе и наличии диабета, что подтверждает и высокий уровень глюкозы. Этой девушке в дальнейшем специалистами-эндокринологами был поставлен диагноз сахарный диабет I типа после вакцинации от гриппа. Степень компенсации углеводного обмена осуществляли квалифицированные специалисты г. Ростова-на-Дону согласно рекомендациям ВОЗ (1999) и «Национальным стандартам оказания медицинской помощи больным сахарным диабетом».

Эффективность способа изучена на контингенте 156 человек, разделенных на подгруппы - группа здоровых людей; группа с повышенным содержанием глюкозы и гликозилированного Hb по верхней границе нормы и тенденции к превышению нормы; группа с выраженным нарушением толерантности к глюкозе. Диагностическая ценность рассчитана с помощью метода статистического анализа (Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл // Биохимия человека: в 2 томах. - М.: Мир; БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, Т. 2. - 414 С.) и составляет 80%. Предлагаемый способ позволяет выявить нарушение углеводного обмена на ранних стадиях и с целью принятия мер по профилактике сахарного диабета.