Результат интеллектуальной деятельности: Штамм бактерий Bacillus pumilus ВКПМ В-13250, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к микроорганизмам Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. epidermidis

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии в частности к созданию нового штамма, оказывающего антагонистическое влияние на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Непатогенные бактерии p. Bacillus с выраженными противомикробными свойствами активно используются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и других отраслях народного хозяйства [1, 2, 3]. Однако для того, чтобы бактериальные препараты длительное время сохраняли свою активность и конкурентоспособность, необходимо производить постоянную ротацию штаммов [4, 5]. В связи с этим селекция новых бактериальных штаммов с целью получения активных противомикробных агентов актуальна и в настоящее время.

Бактерии вида В. pumilus в соответствии с санитарно-эпидемиологическим правилом СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» [6] не относятся к патогенным для человека микроорганизмам и в первую очередь известны за счет своих антифунгальных свойств [7, 8, 9, 10]. Заявленный штамм Bacillus pumilus 16 в свою очередь обладает не только противогрибковым, но и антибактериальным действием в отношении патогенных и условно-патогенных для человека и животных бактерий.

Наиболее близким к заявляемому объекту по спектру антагонистического действия является штамм В. subtilis В-1323, депонированный в ВКПМ (Всероссийской коллекции промышленных организмов) как антимикробный агент [11].

Недостатком этого штамма является то, что он обладает узким спектром противо-микробной активности и к тому же давно был выделен из природной среды, поэтому в искусственных «лабораторных» условиях мог снизить свою эффективность.

Задачей изобретения является получение нового штамма Bacillus pumilus, обладающего широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и дрожжеподобным грибкам, таким как Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. epidermidis.

Задача решается выделением нового штамма Bacillus pumilus, обладающего широким антимикробным действием, из ризосферы растений p. Cichorium.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма, заключается в повышении эффективности уже существующих биологических препаратов или разработке новых с высоким противомикробным эффектом за счет включения в их состав заявленного штамма.

Описание изобретения

1. Видовое название штамма и его происхождение

Предлагаемый штамм бактерий Bacillus pumilus 16 выделен из ризосферы p. Cichorium в Алтайском крае, Павловском районе, в окрестностях п. Новые Зори, осенью 2017 года. Штамм был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, где ему был присвоен коллекционный номер ВКПМ В13250.

2. Генетическая характеристика представленного штамма

При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.

Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project II), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представляются в графическом виде.

S000012241 0.998 0.951 1440 Bacillus vallismortis (Т); DSM11031; АВ021198

S000014133 0.998 0.951 1426 Bacillus atrophaeus (Т); JCM9070; АВ021181

S000417318 1.000 0.972 1415 Bacillus altitudinis (T); type strain:41KF2b; AJ831842

S000458519 1.000 0.989 1354 Bacillus safensis (T); FO-036b; AF234854

S000481068 1.000 0.995 1352 Bacillus pumilus (T); ATCC 7061; AY876289

S000734915 0.998 0.951 1389 Bacillus amyloliquefaciens (T); NBRC 15535; AB255669

S001014161 1.000 0.972 1443 Bacillus stratosphericus (T); type strain: 41KF2a; AJ831841

S001014162 1.000 0.972 1443 Bacillus aerophilus (T); type strain: 28K; AJ831844

S004007309 1.000 0.962 1426 Bacillus xiamenensis (T); MCCC 1A00008; JX680066

При проведении реакции ПЦР были использованы следующие праймеры.

Праймеры, специфичные для Bacillus pumilus (gyrA)

Pum-f ATGACAAGTGATAAACCATTTAAG (87)

Pum-r AACGGTTGCATCTCTACGCAG (861)

Праймеры, специфичные для Bacillus safensis (gyrA)

Saf-f AGGCATGACGATTGGTTC (53)

Saf-r CCAGATGTGCGAGATGGCTTG (435)

См. фиг. 1, ПЦР-анализ исследуемого штамма с использованием видоспецифических праймеров, где:

1. Маркер O'GeneRuler 1 kb DNA Ladder (250, 500, 750, 100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н, сверху вниз)

2. ПЦР-анализ исследуемого штамма с использованием праймеров Pum-f и Pum-r, специфических для Bacillus pumilus.

Наработка фрагмента размером 774 п. н. при использовании видоспецифических праймеров Pum-f и Pum-r и отсутствие фрагментов при использовании праймеров Saf-f и Saf-r позволяет отнести исследуемый штамм к виду Bacillus pumilus.

3. Микроскопические и морфолого-культуральные признаки штамма бактерий Морфология клеток заявленного штамма: небольшие прямые палочки (около 0,7 мкм) с закругленными концами, чаще расположены одиночно или парами, реже - цепочками. Отмечается спорообразование по бациллярному типу.

Для штамма Bacillus pumilus 16 характерны колонии желтоватого цвета на МПА, с максимальным диаметром 0,5-0,7 см, матовые, приподнятые, ровной округлой формы, со складчатой каймой. На L-твердой среде: колонии белого цвета, с максимальным диаметром 0,5-0,8 см, матовые, приподнятые, ровной округлой формы, со складчатой каймой. Цвет колоний на окраине более прозрачный по сравнению с центром.

4. Физиолого-биохимические признаки заявленного штамма

Для штамма Bacillus pumilus 16 установлена: положительная окраска по Граму и отрицательная реакция Грегерсена, положительная реакция на каталазу и отрицательная - на лецитиназу, а также подвижность, способность к спорообразованию и рост исключительно в аэробных условиях.

5. Способ, условия и состав сред для размножения и ферментации штамма Заявленный штамм микроорганизма культивируется 24 ч при 37°С в шейкер-инкубаторе на L-бульоне (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 15,0, NaCl - 5,0, вода дистилированная - 1,0 л. Для приготовления твердой среды необходимо добавить к указанным выше ингредиентам 15,0 г/л агара.

Состав ферментационной питательной среды (г/л): меласса - 25, кукурузный экстракт -12,5, дрожжевой экстракт - 1, триптон - 0,5, MgSO4 - 0,25, MnSO4 - 0,03, CoCl2 - 0,046, CaCl2 - 1, солевой сток - 10 мкл, лапрол - 2, вода водопроводная - 1 л. Начальное рН - 7,0, аэрация - 300 л/ч, постоянное перемешивание 250 оборотов в минуту, время - 20-24 ч.

6. Антибиотикорезистентность штамма

Штамм Bacillus pumilus 16 чувствителен к: цефалексину, олеандомицину, энрофлок-сацину, бензилпеницилину и мономицину. Устойчив к оксациллину.

7. Антагонистическая активность представленного штамма

Антагонистическая активность штамма Bacillus pumilus 16 была зафиксирована в отношении Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. Epidermidis. Изобретение иллюстрируется следующими примерами: Пример 1. Выделение штамма Bacillus pumilus 16.

Штамм Bacillus pumilus 16 был получен из ризосферы p. Cichorium. В общем виде этапы выделения бактерий p. Bacillus представлены на рисунке 2. О патогенности/непатогенности выделенного штамма судили по реакции на лецитиназу (для непатогенных представителей p. Bacillus она отрицательна). На Фиг. 2 - этапы выделения бактерий p. Bacillus.

Для определения видовой принадлежности выделенного штамма была произведена молекулярно-генетическая идентификация.

Пример 2. Определение антагонистической активности штамма Bacillus pumilus 16.

Антагонистическое действие штаммов Bacillus subtilis В-1323 и Bacillus pumilus 16 проверялось в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Для этого применялся один из методов отсроченного антагонизма - перпендикулярных штрихов. В качестве тест-культур использовали: Е. coli, В. cereus, St. aureus, St. epidermidis, С. albicans.

Штаммы-антагонисты высевали штрихами на чашки с L-твердой средой и культивировали при 37°С в течение 48 часов, после этого к выросшим штрихам перпендикулярно подсевали культуры патогенных тест-штаммов. Высевы бактерий выдерживали в течение 24 часов при температуре 37°С, дрожжеподобных грибов - при температуре 28°С 5 суток. Положительный результат по определению антимикробной активности исследуемых бактерий учитывали по наличию лизиса патогенов в зоне диффузии выделяемых ими в среду роста водорастворимых метаболитов (табл. 1).

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что заявленный штамм Bacillus pumilus 16 обладает более широким спектром антагонистического действия по сравнению со штаммов Bacillus subtilis В-1323.

Помимо этого, антагонистическую активность бацилл в отношении Е. coli проверяли также другим диффузионным методом - агаровых блоков. Для этого культуры штаммов-антагонистов высевали поверхностным газоном на твердой L-среде и инкубировали при температуре 37°С в течение 24 ч для образования и накопления в агаре ингибиторных соединений. Затем стерильным пробочным сверлом вырезали агаровые блоки с выросших культур бацилл и устанавливали их в чашки Петри на поверхности агаровой среды, только что глубинно засеянные культурой тест-штамма. Чашки выдерживали в течение суток в холодильнике (во избежание преждевременного роста тест-штамма) для диффузии ингибиторных соединений из блоков в толщу агара с тест-штаммом, а затем инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С. О степени антагонистической активности испытуемых бактерий судили по величине зоны ингибирования роста тест-штамма вокруг агарового блока (табл. 2).

Согласно данным, приведенным в таблице 2, видно, что заявленный штамм Bacillus pumilus 16 обладает большей антагонистической активностью по отношению Е. coli в сравнении со штаммов Bacillus subtilis В-1323.

Пример 3. Изучение резистентности к антибиотикам штамма Bacillus pumilus 16.

Антибиотикорезистентность заявленного штамма определяли диско-диффузионным методом на твердой L-среде. Для этого на поверхность агара сплошным газоном рассевали культуру бацилл. На среду помещали диски с различными антибиотиками. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками (табл. 3).

Чувствительность к антибиотикам штамма Bacillus pumilus 16 является одним из показателей его безопасности, ведь в таком случае он не сможет передавать гены антибиотикорезистентности патогенным бактериям.

Исходя из полученных данных штамм Bacillus pumilus 16 является антимикробным агентом с широким спектром антагонистического действия.

Литература

1. Sorokulova I. Modern Status and Perspectives of Bacillus Bacteria as Probiotics // J. Prob. Health. - 2013. - Vol.1. - №4. https://doi.org/10.4172/2329-8901.1000e1066.

2. Perez-Garcia A., Romero D., de Vicente A. Plant protection and growth stimulation by microorganisms: biotechnological applications of Bacilli in agriculture // Current Opinion in Biotechnology, 2011. - Vol.22. - Is. 2. - P. 187-93. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2010.12.003.

3. Mansour, A., Rakhisi, Z., Ahmady, A.Z. Isolation and identification of Bacillus species from soil and evaluation of their antibacterial properties // Avicenna Journal of Clinical Microbiology and Infection, 2015. - Vol.2. - Is. 1. e23233. https://doi.org/10.17795/ajcmi23233.

4. Евстигнеева Т.Н., Кудрявцева Т.А. Селекция промышленных штаммов микроорганизмов. - СПб.: Университет ИТМО, 2017. - 59 с.

5. Иркитова А.Н., Гребенщикова А.В., Мацюра А.В. Антагонистическая активность штаммов Bacillus subtilis, выделенных из различных источников // Ukrainian Journal of Ecology, 2018, - Vol.8. - Is. 2. - P. 354-364. doi: 10.15421/2018_354

6. СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенно-сти (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, с изменениями на 29 июня 2011 года.

7. Кузин А.И., Николаенко М.А., Азизбекян P.P. Фунгицидные свойства штамма Bacillus pumilus 16-1937 по отношению к грибу Aspergillus niger // Успехи медицинской микологии, 2014. - Т. 12. - С.413-414.

8. Чеботарь В.К., Ерофеев С.В., Щербаков А.В., Чижевская Е.П. Штамм бактерий Bacillus pumilus А 1.5, в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами: Пат. 2551968 Рос.Федерация. МПК51 C12R 1/07; 2013136149/10; заявл. 01.08.2013; опубл. 10.02.2015, бюл. №16.

9. Kaushal M., Kumar A., Kaushal R. Bacillus pumilus strain YSPMK11 as plant growth promoter and bicontrol agent against Sclerotinia sclerotiorum // 3 Biotech, 2017. - Vol.7(2): 90. https://doi.org/10.1007/sl3205-017-0732-7.

10. Yang H.L., Xia H.Q., Ye Y.D., Zou W.C., Sun Y.Z. Probiotic Bacillus pumilus SE5 shapes the intestinal microbiota and mucosal immunity in grouper Epinephelus coioides // Diseases of Aquatic Organisms, 2014. - Vol. - 111(2). - P. 119-27. doi: 10.3354/dao02772.

11. Гребенщикова A.B. Изучение антагонистической активности коммерческих и коллекционных штаммов Bacillus subtilis // Молодежь - Барнаулу: материалы XVII-XIX городской научно-практической конференции молодых ученых / под ред. Ю.В. Анохина. -Барнаул, 2018. - Часть XIX. - С.121-123.