СРЕДСТВО, НОРМАЛИЗУЮЩЕЕ ТОНУС МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из мочевого пузыря и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как средство, нормализующее тонус мочевого пузыря.

Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (а.с. SU №1218521, 1994; а.с. SU №1227198, 1986; патент РФ 1298879, 1993; патент РФ №1448443, 1994; а.с. SU №1522486, 1993; патент РФ №2075944, 1997; патент РФ №2161501, 2001; патент РФ №1522486, 1993; патентов №4341765 патент GB 1161896, 1969; патент FR 2583982, 1987).

Известно средство, обладающее тонизирующим действием на гладкую мускулатуру вен, мочевого пузыря и предстательной железы (патент РФ №2058780, 1996, А61К 35/38), являющееся наиболее близким аналогом для предлагаемого средства, нормализующего тонус мочевого пузыря.

Известны способы получения комплексных пептидных препаратов, обладающих тканеспецифическим действием (патент РФ №944191, 1994; патент РФ №1122606, 1993; патент РФ №1417244, 1993; патент РФ №2104702, 1998).

Известен способ получения указанных препаратов (Морозов В.Г, Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы. СПб.:, Наука, 1996. 74 с.), включающий получение биологически активного вещества из органов и тканей животных, путем экстракции 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработкой надосадочной жидкости ацетоном, являющийся наиболее близким аналогом для предлагаемого способа получения средства, нормализующего тонус мочевого пузыря.

К недостаткам указанного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани большого количества (более 70%) веществ непептидной природы - балластных компонентов, которые, являясь примесями, не определяют биологическую активность выделенного активного вещества, а также его низкий выход.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства, нормализующего тонус мочевого пузыря, в виде лекарственной формы для парентерального введения, выделенного из мочевого пузыря телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 74 до 394 Да и получения водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить его выход.

Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, нормализующего тонус мочевого пузыря, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.

Другим аспектом изобретения является средство, нормализующее тонус мочевого пузыря, в виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 74 до 394 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, технический результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных веществ, полученных ранее из животного сырья, по молекулярной массе (от 500 до 1500 Да) входящих в него пептидных компонентов (патенты РФ №№1298879, 2104702, 2163129), а также по его нетоксичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.

В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор средства в концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что позволяет считать показанным использование средства при различных видах патологии мочевого пузыря. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.

В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, нормализующего тонус мочевого пузыря, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения (далее - препарат):

- повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее двух раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких как липидные, белковые, фосфолипидные и другие;

- получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование, с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, и добавлении в ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН 5,6÷6,6;

- стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см², что обеспечивает стабильность препарата при сохранении терапевтической эффективности.

Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально.

Указанный технический результат достигается тем, что средство, нормализующее тонус мочевого пузыря, выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 74 до 394 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл и получено из мочевого пузыря телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.

Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения средства, нормализующего тонус мочевого пузыря, характеризуется тем, что мочевой пузырь телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3%-ный раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°C, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1%-ный раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7÷16°C, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3÷5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее 2 раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН 5,6÷6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см², разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см².

Сущность изобретения поясняется фигурами и таблицами.

На фиг.1 изображено влияние препарата на развитие эксплантатов стенки мочевого пузыря.

На фиг.2 изображено влияние препарата на напряжение полоски мочевого пузыря крысы in vitro.

В таблице 1 показано влияние препарата на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.

В таблице 2 показано влияние препарата на состояние уродинамики у больных с аденомой предстательной железы

Изобретение иллюстрируется следующими примерами: пример 1 - способ получения препарата; примеры 2 и 3, подтверждающие биологическую активность препарата; пример 4 - изучение токсичности препарата; пример 5, подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.

Пример 1. Способ получения препарата

В качестве сырья используется мочевой пузырь телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней, который замораживают при температуре не менее минус 40°С и выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев.

В реактор для экстракции перекачивают 500 л 3%-ного раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры (20±5)°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 100 кг измельченного до получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1%-ный раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры плюс 7÷16°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.

Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при (5000±500) об/мин в течение 1 ч. К экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре плюс 3±5°С в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее двух раз. Затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета. Промытый осадок протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном шкафу до полного удаления запаха ацетона.

Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из мочевого пузыря) составляет 40 г на 1 кг исходного сырья.

Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5÷2,9 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при (3000±200) об/мин в течение (20±5)мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа АР-15 или аналогичный.

Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см², через материалы с задерживающей способностью 15000 Да.

В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола, до его конечной концентрации 10±20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении рН 5,6÷6,0.

Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0, кгс/см².

Полученный раствор разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом подвергают стерилизации в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении не более 1,1 кгс/см².

Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл.

Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.

Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях.

С целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.

Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 270±5 нм.

Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют следующими методами:

методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки колонки 1,6×60 см используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия);

методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Voyager DE Biospectrometry с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (MALDI-TOF) при относительной интенсивности азотного лазера 2300-2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки 90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6·10⁶ Торр;

методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков.

Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 74 до 394 Да.

С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C18», колонка 2×62 мм), установлено, что в состав препарата входят преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в препарате отсутствуют.

Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с.183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9%-ного раствора натрия хлорида для инъекций. Показано, что препарат является апирогенным.

Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 74 до 394 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл.

Пример 2. Влияние препарата на развитие эксплантатов стенки мочевого пузыря

Эксперименты проведены на 38 фрагментах стенки мочевого пузыря крыс линии «Wistar» с массой тела 150÷200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35%-ного раствора Игла, 25%-ной фетальной сыворотки теленка, 35%-ного раствора Хенкса, 5%-ного куриного эмбрионального экстракта; в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты стенки мочевого пузыря помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли препарат в концентрациях 1, 10, 50, 100, 200 и 400 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента стенки мочевого пузыря. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

На фиг.1 показано влияние препарата на развитие эксплантатов стенки мочевого пузыря.

Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации препарата 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 34% по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов стенки мочевого пузыря на более длительных сроках культивирования (7 дней) было выявлено аналогичное стимулирующее действие препарата в той же концентрации.

Таким образом, в отношении ткани стенки мочевого пузыря препарат оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.

Пример 3. Влияние препарата на гладкомышечные клетки детрузора мочевого пузыря in vitro

Эксперименты проводили на полоске ткани мочевого пузыря крыс линии «Wistar», установленной между фиксированным стержнем и датчиком силы, помещенной в специальную ванночку с раствором Кребса. В раствор добавляли препарат в концентрациях 8, 16 и 32 мкг/мл, затем регистрировали авторитмическую сократительную активность полоски мочевого пузыря.

Установлено, что под действием препарата происходит дозозависимое изменение фазно-тонических сокращений гладкомышечных клеток.

На фиг.2 показано влияние препарата на напряжение полоски мочевого пузыря крысы in vitro.

Максимальное напряжение, развиваемое мышцей в ответ на действие препарата, также росло по мере увеличения его концентрации в перфузате. Так, если в контрольном растворе максимальное напряжение равнялось 92,8 г/см², то при действии наименьшей из исследуемых концентраций препарата значение показателя возрастало до 172,3 г/см² (фиг.2).

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о стимулирующем действии препарата на тонус гладких мышц мочевого пузыря, при этом наибольший эффект препарат оказывает в дозировке 32 мкг/мл. В дальнейших экспериментах эта концентрация была принята за терапевтически эффективную дозу - 5 мг для человека.

Пример 4. Изучение токсичности препарата

Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 78 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 19÷23 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 35 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9%-ный раствор NaCl.

Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 68 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 170÷190 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9%-ный раствор NaCl. До введения препарата на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата на 84 морских свинках-самцах массой 250÷280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 месяцев в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9%-ный раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 300÷3000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата достоверного изменения показателей не выявлено (таблица 1).

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.

Пример 5. Эффективность применения препарата у больных с аденомой предстательной железы

Исследование проведено с участием 33 больных в возрасте 51÷67 лет с аденомой предстательной железы I-II стадии. Характерными симптомами патологического состояния у больных с аденомой предстательной железы были упорная дизурия, не поддающаяся общепринятым методам лечения, ослабленная струя мочи, снижение способности к совершению половых актов. Все больные ранее получали общепринятые лекарственные средства симптоматического и патогенетического действия, при применении которых отмечался кратковременный терапевтический эффект, требующий увеличения дозы препаратов на курс лечения и продолжительного их приема.

19 Пациентам, которые составили основную группу, вводили исследуемый препарат внутримышечно в дозе 5 мг в 2,0 мл физиологического раствора однократно ежедневно в течение 10 дней.

Контрольная группа включала 14 пациентов, получавших общепринятое лечение.

Эффективность лечения оценивали на основании динамики жалоб больных, лабораторного исследования крови и мочи. Степень брюшного давления при мочеиспускании и характер струи мочи выражали в баллах от 1 до 5 (1 - норма, 5 - наибольшие изменения показателя). Определяли максимальную, среднюю скорость и время мочеиспускания, время достижения максимальной скорости мочевыделения, оценивали флуорометрический индекс.

Динамика результатов исследования у больных с аденомой предстательной железы до и после окончания курса лечения препаратом представлена в таблице 2.

Состояние больных с аденомой предстательной железы после лечения препаратом характеризовалось достоверным улучшением субъективных и объективных показателей уродинамики по сравнению с показателями у пациентов, получавших лечение общепринятыми средствами (таблица 2). У 37,3% больных отмечалось усиление либидо.

Таким образом, результаты проведенного клинического исследования свидетельствуют о лечебной эффективности препарата в дозе 5 мг и целесообразности его применения в комплексном лечении дизурических расстройств различного генеза, обсуловленных нарушением тонуса мочевого пузыря, в дозе 5 мг (2,5 мг/мл) внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.