Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ ПОЛИСАХАРИДУ Haemophilus influenzae ТИПА b

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета при вакцинации существующими (АКТ-ХИБ) и разрабатываемыми форсифицированными вакцинами.

Haemophilus influenzae типа b (Hib) является наиболее частой причиной бактериальных менингитов, поражающих детей до 6-летнего возраста, особенно детей от 3 до 12 месяцев. При инфицировании этим видом бактерий у человека формируется иммунный ответ к трем основным антигенам: капсульному полисахариду, белкам наружной мембраны и липоолигосахаридам. Капсульный полисахарид - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) - является основой современных вакцинных препаратов. Для формирования Т-клеточного иммунитета его конъюгируют с различными бактериальными белками, такими как столбнячный и дифтерийный анатоксины и др. Для профилактики заболеваний, вызываемых Hib, за рубежом созданы вакцинирующие препараты. Одна из таких вакцин «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), представляющая собой конъюгат ПРФ со столбнячным анатоксином, сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность. Разрабатываются подобные вакцины и в нашей стране. Для оценки эффективности разрабатываемых отечественных форсифицированных вакцин необходимы тесты, регистрирующие уровень поствакцинального иммунитета.

Известен способ выявления антител к олигосахариду капсульного полисахарида Hib с помощью ИФА. В качестве иммуносорбента используют 96-луночный полистироловый планшет, на котором сорбирован олигосахарид, конъюгированный с альбумином человека [Clin. And Diagn. Labor. Immunol., 1996, Jan., p.84-88]. Анализируемые образцы сывороток титруют с 1:50 в фосфатно-солевом буфере с добавлением твина и ЭДТА. После инкубации и отмывания вносят моноклональный конъюгат. Полученное соединение антиген-антитело-конъюгат проявляют субстратной смесью с последующей детекцией на спектрофотометре. Для калибровочной кривой используют аффинноочищенные антитела.

Однако при использовании иммуносорбента, содержащего альбумин человека, есть вероятность определения аутоантител к нему в анализируемых пробах.

Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности определения антител к капсульному полисахариду H.influenzae за счет использования высокоочищенного полисахарида, не требующего конъюгации, а также за счет использования поликлонального конъюгата, представляющего собой кроличьи антитела против иммуноглобулинов G (H+L) человека, меченные пероксидазой, и калибровочных проб, представляющих собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib.

Для достижения указанного технического результата способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. Ед./мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 минут, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 минут в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.

Наличие гуморального иммунитета может быть оценено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода лежит иммуносорбент, представляющий собой стрипированный 96-луночный планшет, сорбированный высокоочищенным капсульным полисахаридом Hib, принадлежность которого к ПРФ доказана с помощью ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии и химического анализа, а специфическая активность - в различных серологических тестах.

При выполнении анализа образцы сывороток и калибровочные пробы вносят в лунки иммуносорбента в рабочем разведении. После инкубации и отмывки во все лунки иммуносорбента вносят конъюгат в рабочем разведении. Проявка реакции осуществляется субстратной смесью, содержащей тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода.

Калибровочные пробы - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. На их основе строится график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах (см. чертеж).

По калибровочному графику определяют относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых сыворотках крови человека.

Используемые реагенты:

(1) иммуносорбент - планшет полистирольный разборный, состоящий из 128-луночных стрипов, сорбированных капсульным полисахаридом Hib, - 1 шт.;

(2) калибровочные пробы (8) - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. Каждая проба содержит 0,2 мл раствора, во флаконе;

(3) отрицательный контроль (К-) - сыворотка крови человека, содержащая <0,5 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;

(4) положительный контроль (К+) - сыворотка крови человека, содержащая >2,0 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;

(5) конъюгат (КГ) - антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, жидкий, концентрированный - 1 фл., 0,2 мл;

(6) субстратная смесь, содержащая тетраметилбензидин (ТМБ) - 1 фл., 12 мл;

(7) промывающий и разводящий фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом (ФСБ-Д)к - 1 фл., 50 мл;

(8) стоп-реагент - 0,9 М H₂SO₄.

Приготовление растворов для проведения анализа:

1) (ФСБ-Д)к перед применением разводят дистиллированной водой в 10 раз. Полученный раствор ФСБ-Д хранят не более 3 недель при 4-8°С. Раствор предназначен для отмывки планшета от непрореагировавших компонентов, разведения сывороток и конъюгата;

2) контроли (К+ и К-), а также анализируемые сыворотки перед проведением анализа разводят раствором ФСБ-Д до соотношения 1:100 (10 мкл на 1000 мкл ФСБ-Д.) Рабочее разведение сывороток хранению не подлежит;

3) рабочее разведение конъюгата готовят непосредственно перед использованием, разводя исходный раствор до соотношения 1:200 ФСБ-Д (50 мкл на 10 мл ФСБ-Д).

Последовательность операций

Отмывка иммуносорбента. Во все лунки планшета вносят ФСБ-Д в объеме не менее 0,2 мл. Выдерживают планшет при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 3 раза.

Внесение образцов. В лунки первого ряда планшета последовательно вносят калибровочные пробы №№1-8. Далее последовательно вносят рабочие растворы (1:100) контролей (К+ и К-) в дублях и анализируемые сыворотки. Объем вносимых проб - 100 мкл.

Инкубация. Выдерживают планшет с растворами сывороток в течение 30 мин при 18-22°С.

Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ-Д, как указано в п.1.

Внесение рабочего раствора конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора КГ.

Инкубация. Как в п.3.

Отмывка от избытка КГ. Как в п.1.

Внесение субстратного раствора ТМБ. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ.

Инкубация. 15-20 мин в темноте при температуре 18-22°С.

В каждую лунку вносят по 50 мкл стоп-реагента.

Учет результатов

Вывести спектрофотометр на нулевой уровень («blank») по воздуху.

Измерить оптическую плотность в лунках планшета при 450 нм в течение 10 минут после остановки реакции.

Построить график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах.

По калибровочному графику определить относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых пробах.

Пример исследования сывороток детей в возрасте до 3 лет, подвергшихся иммунизации вакциной «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), на наличие антител к капсульному полисахариду Hib

Из 17 детей у 13 (*) уровень IgG AT после вакцинации вырос (из них - в 4 и более раз - только у 5 человек (**)). У 3 детей произошло понижение уровня AT после вакцинации (°), а у одного уровень AT не изменился (-).

Пример определения антител капсульному полисахариду в сыворотках вакцинированных детей с помощью набора «Fuller Laboratories» и предложенного способа.