НОСИТЕЛЬ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ И КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Изобретение относится к области медицинских исследований и служит для направленной доставки лекарственных средств, их контролируемого высвобождения, а также для диагностики онкологических заболеваний и визуализации места локализации опухоли, включая мониторинг динамики высвобождения лекарственных средств. Предлагаемое решение позволяет эффективно и направлено обеспечивать доставку лекарственных средств в место локализации опухолевого роста без его преждевременного разрушения и оказания токсического эффекта на здоровые части организма пациента, обеспечивает контролируемое высвобождение лекарственных средств под действием внешних стимулов, а также позволяет диагностировать и визуализировать места опухолевого роста, расположенные как на поверхности, так и в глубине тканей организма. Предлагаемый носитель представляет собой микрокапсулы, которые могут использоваться как в научных и прикладных исследованиях по разработке новых лекарственных средств, так и для лечения пациентов с помощью уже существующих лекарственных средств, обеспечивая более высокую эффективность и меньшую токсичность по сравнению с существующими подходами.

Известно решение [1] для направленной доставки лекарственных средств, в частности бор-содержащих фармацевтических субстанций и мониторинга процесса их высвобождения. При этом авторами известного изобретения используются липосомы, в которые вводят бор-содержащие фармацевтические субстанции, в качестве компонента, обеспечивающего терапевтическую эффективность, в липидную часть липосомы вводят люминесцентный краситель одного цвета, а в ее водную часть вводят краситель другого цвета. Для обеспечения большего времени цикруляции липосом и увеличения их сродства к опухолевым тканям поверхность липосом модифицируют полиэтиленгликолем. Контроль процесса доставки лекарственных препаратов и мониторинг их высвобождения происходит путем детекции флуоресцентного сигнала с помощью люминесцентного микроскопа и изменения взаимного расположения красителей, локализованных в липидной и водной частях липосом. К недостаткам известного изобретения можно отнести невозможность детектирования процесса доставки и высвобождения лекарственных препаратов в глубине исследуемого организма, недостаточной яркости флуоресцентных красителей, а также невозможности проводить контролируемое разрушение оболочки липосом для высвобождения лекарственных препаратов в нужном месте и в нужное время. Также к недостаткам стоит отнести то, что таргетная доставка лекарств осуществляется только за счет «пассивного» транспорта липосом, т.е. за счет переноса липосом с током биологических жидкостей или диффузией. Кроме того, недостатком можно считать выбор липосомы в качестве носителя, так как липиды их оболочки подвергаются окислению, а сама оболочка недостаточно прочна и может разрушиться до момента доставки лекарственного средства к месту расположения опухоли.

Частично этих недостатков лишено известное решение [2] для визуализации, направленной доставки и высвобождения активных соединений, выбранное в качестве прототипа. В данном решении используют липосомы, в оболочку которых включен сфингомиелин, содержащие магнитные наночастицы, метки для визуализации и/или детекции и лекарственное средство, которое может высвобождаться из липосом в результате внешнего воздействия. При этом в качестве метки для визуализации используются изотопы, контрастные агенты, флуорофоры или метки для позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ). Высвобождение лекарственных средств из липосом происходит в следствие ее разрушения, которое происходит при конверсии сфингомиелина в керамид. Данная реакция осуществляется ферментом сфингомиелиназой, активность которого повышена в опухолевых клетках или может быть индуцирована внешним стимулом, например, облучением светом в УФ диапазоне длин волн, нагревом, окислительным стрессом или воздействием ионизирующего излучения. К недостаткам данного способа стоит отнести, во-первых, применение липосом, т.е. микрокапсул из фосфолипидов, в частности сфингомиелина, которые могут быть самопроизвольно разрушены в организме до их поступления в место локализации опухоли, а также тем, что способом не предусмотрена возможность определения эффективности высвобождения лекарственных средств из носителя.

Технический результат заключается в создании биологически совместимого носителя для высокочувствительной диагностики онкологических заболеваний, направленной доставки, управляемой магнитным полем, специфического накопления и контролируемого детектируемого высвобождения лекарственных средств, который позволяет повысить эффективность применения противоопухолевых средств и снизить их негативное воздействие на организм пациента.

Технический результат достигается тем, что известный носитель для диагностики, направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных средств, представляющий собой микрокапсулу, содержащую лекарственные средства, метки для оптической и томографической визуализации и магнитные наночастицы, при этом на поверхности оболочки микрокапсулы иммобилизованы биологические распознающие молекулы, а сама оболочка выполнена с возможностью разрушения в ответ на внешнее воздействие, выполнен так, что оболочка микрокапсулы состоит из трех и более слоев полиэлектролитов, причем на поверхности внешнего слоя полиэлектролита ориентированным образом иммобилизованы однодоменные антитела, применяемые в качестве биологических распознающих молекул, при этом между слоями полиэлектролитов нанесены один и более слоев, включающих магнитные наночастицы, кроме того один и более слоев, включающих инфракрасные квантовые точки, без содержания тяжелых металлов, а также один и более слоев, включающих плазмонные наночастицы, а внутрь микрокапсулы помещены квантовые точки для позитронно-эмиссионной томографии и флуоресцентной детекции, также без содержания тяжелых металлов, при этом на поверхности квантовых точек для позитронно-эмиссионной томографии и флуоресцентной детекции иммобилизованы однодоменные антитела.

Использование микрокапсул с многослойной оболочкой из полиэлектролитов позволяет создавать носители вероятность самопроизвольного разрушения которых существенно ниже, чем у классических липосом, что актуально при необходимости использования высокой терапевтической дозы лекарственного средства, или при доставке нестабильных лекарственных средств, которые быстро инактивируются при контакте с биологическими тканями и жидкостями. Благодаря возможности создания микрокапсул контролируемого размера, содержащих в структуре оболочки магнитные ноночастицы, путем манипулирования внешним магнитным полем возможна активная (направленная) доставка носителя к месту локализации опухолевого роста. При этом специфическое накопление обеспечивается благодаря антителам, расположенным на поверхности микрокапсул. Однодоменные антитела обладают меньшим размером, по сравнению с иммуноглобулинами класса G, традиционно применяемыми в качестве биологических распознающих молекул, что позволяет добиться более высокой плотности их связывания с поверхностью носителя, а возможность их ориентированного связывания с поверхностью носителя, когда все антиген-связывающие участки однодоменных антител направлены от поверхности микрокапсулы, позволяет в несколько раз повысить эффективность связывания биомаркеров заболеваний. Включение в оболочку микрокапсул плазмонных наночастиц позволяет проводить тепловое разрушение оболочки микрокапсул в ответ на ее облучение лазерным светом требуемой длины волны, вызывающее локальный разогрев плазмонных наночастиц. Например, лазерным светом в ИК-диапазоне длин волн, в области «окон прозрачности» тканей, что актуально, когда микрокапсулы находятся в глубине организма. Кроме того, разрушение оболочки микрокапсул возможно и с помощью магнитных наночастиц, путем их разогрева переменным магнитным полем заданной частоты, причем использование двух различных внешних индукторов разрушения оболочки микрокапсул позволяет проводить как направленный транспорт носителей с использованием постоянного магнитного поля, так и высвобождение лекарственных средств с использованием лазерного излучения или переменного магнитного поля, что актуально при терапии крупных опухолей, для достижения равномерной концентрации лекарственных средств. Применение флуоресцентных радиоактивных квантовых точек, видимых методом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) позволяет, во-первых, существенно повысить чувствительность обнаружения опухоли, и, во-вторых, позволяет их использовать в качестве флуоресцентных зондов, когда возбуждение их флуоресценции происходит за счет Черенковского излучения. Использование в составе оболочки носителя инфракрасных квантовых точек (ИК-КТ), флуоресцирующих в ИК-диапазоне оптического спектра, позволяет контролировать процесс высвобождения лекарственных средств за счет мониторинга динамики разрушения оболочки микрокапсул, путем детектирования изменения флуоресцентного окрашивания микрокапсул от ИК-КТ и КТ, применяемых для ПЭТ. Это возможно благодаря тому, что КТ для ПЭТ конъюгированы с однодоменными антителами, которые имеют специфичность аналогичную антителам, находящимся на поверхности оболочке микрокапсулы, т.е. после разрушения оболочки микрокапсулы, КТ для ПЭТ локализуются рядом с местом изначальной доставки и локализации микрокапсул, а КТ из оболочки микрокапсулы - нет. Таким образом, определяя соотношение сигналов от двух различных типов квантовых точек можно судить о степени высвобождения лекарственного средства из микрокапсулы.

Возможен первый частный случай, в котором в качестве магнитных наночастиц используют ферромагнитные или супер-парамагнитные наночастицы размерами от 1 до 100 нанометров, или ансамбли таких наночастиц.

Возможен второй частный случай, в котором в качестве инфракрасных квантовых точек используют полупроводниковые нанокристаллы состава CuInS₂/ZnS, Ag₂S, флуоресцирующие в инфракрасной области оптического спектра.

Возможен третий частный случай, в котором в качестве плазмонных наночастиц применяют наночастицы золота, серебра, платины и других благородных металлов.

Возможен четвертый частный случай, в котором в качестве плазмонных наночастиц применяют плазмонные наночастицы в форме сфер, колец, торов, стержней, треугольников, или их комбинации.

Возможен пятый частный случай, в котором в качестве квантовых точек для позитронно-эмиссионной томографии и флуоресцентной детекции используют полупроводниковые нанокристаллы состава [⁶⁴Cu]CuInS₂/ZnS, флуоресцирующие в инфракрасной области оптического спектра.

Возможен шестой частный случай, в котором слои магнитных наночастиц, инфракрасных квантовых точек и плазмонных наночастиц разделены между собой слоями полиэлектролитов разных зарядов.

Возможен седьмой частный случай, в котором в качестве отрицательно заряженных полиэлектролитов используют поликислоты и/или соли этих поликислот.

Возможен восьмой частный случай, в котором в качестве положительно заряженных полиэлектролитов используют полиоснования и/или соли этих полиоснований.

Возможен девятый частный случай, в котором в качестве полиэлектролитов используются биодеградируемые полиэлектролиты.

Возможен деятый частный случай, в котором в качестве однодоменных антител применены однодоменные антитела специфичные к маркерам онкологических заболеваний.

Возможен частный случай, в котором в качестве однодоменных антител применены однодоменные антитела, связывающие белки HER2, CEA, EGFR, ЕрСАМ.

На фиг. 1 представлен конкретный пример носителя для диагностики, направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных средств. Цифрами обозначены следующие элементы: оболочка микрокапсулы - 1; однодоменные антитела, иммобилизованные на внешнем слое оболочки - 2; лекарственные средства - 3; квантовые точки для позитронно-эмиссионной томографии и флуоресцентной детекции - 4; слои полиэлектролитов - 5; магнитные наночастицы - 6; плазмонные наночастицы - 7; инфракрасные квантовые точки - 8; внешний слой полиэлектролита - 9; однодоменные антитела, иммобилизованные на поверхности квантовых точек для позитронно-эмиссионной томографии и флуоресцентной детекции - 10.

Конкретный пример, поясняющий принцип действия и использования носителя для диагностики, направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных средств показан на примере доставки фотосенсибилизатора фотодитиазина, детектирования раковых клеток опухоли молочной железы подсаженной мыши, а также визуализация процесса разрушения носителя. Для этого использовались микросферы, на поверхности которых были иммобилизованы однодоменные антитела специфичные к Her2, в качестве ИК-КТ использовались флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы типа ядро/оболочка состава CuInS₂/ZnS, имеющие максимум флуоресценции на длине волны 810 нм. В качестве плазмонных наночастиц использовались наночастицы золота в форме сферы с диаметром 40 нм, в качестве магнитных наночастиц использовались наночастицы состава Fe₃O₄ среднего размера 10 нм, а в качестве квантовых точек для позитронно-эмиссионной томографии и флуоресцентной детекции были выбраны КТ типа ядро/оболочка состава [⁶⁴Cu]CuInS₂/ZnS, имеющие максимум флуоресценции на длине волны 710 нм, конъюгированные с однодоменными антителами к Her2. В качестве полиэлектролитов использовали поли(стирен сульфонат) и поли(аллиламин гидрохлорид). Слои ИК-КТ, магнитных наночастиц и плазмонных наночастиц разделены тремя чередующимися слоями полиэлектролитов разных зарядов. Носитель указанного состава в физиологическом растворе шприцом вводили в тело двух мышей в 2 см от места локализации опухоли. Через 10 минут после введения, локализация носителя около места введения была подверждена ПЭТ анализом. После этого постоянный магнит (0,7 Тл) был помещен в район локализации опухоли у мыши №1, в то время как мышь №2 использовалась в качестве отрицательного контроля и не подвергалась воздействию магнитного поля. Через 30 минут воздействия магнитного поля локализация носителя была определена ПЭТ анализом. У мыши №1 наблюдалась локализация носителя в области опухоли, в то время как у мыши №2 подавляющее количество носителя осталось в месте изначального введения. Индукция разрушения оболочки носителя и высвобождения фотосенсибилизатора проводилась путем облучения места локализации носителя лазерным облучением с длиной волны 1113 нм, в области полосы поглощения плазмонных наночастиц. Эффективность разрушения микрокапсул и высвобождения лекарственных средств определяется путем снятия спектров флуоресценции квантовых точек изначально локализованых в оболочке микрокапсулы (ИК-КТ, λ_max, _фл=810 нм) и КТ, которые применяются для ПЭТ (λ_max, _фл=710 нм), в момент времени до облучения микрокапсул лазерным облучением и через один час после облучения. В результате нами было детектировано более значительное убывание флуоресценции на 810 нм, чем на 710 нм, свидетельствующее о разрушении оболочки носителя и высвобождении лекарственного средства.

Таким образом, предложенный носитель для диагностики, направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных средств, позволяет повысить эффективность существующих лекарственных средств за счет возможности контролирования режима их дозировки и направленной доставки к месту непосредственного действия, а также снизить негативное влияние лекарственных средств на здоровые части организма пациента. При этом применение высокоаффинных однодоменных антител и КТ, совместимых с ПЭТ-детекцией, позволяет использовать предлагаемый носитель в качестве эффективного средства для чувствительной диагностики и визуализации онкологических заболеваний.

Источники информации

1. Кичигин Александр Иванович, Каныгин Владимир Владимирович, Мухамадияров Ринат Авхадиевич, Таскаев Сергей Юрьевич. Способ доставки борсодержащих препаратов для бор-нейтронозахватной терапии. Патент Российской Федерации RU 2589822.

2. Claus-Christian, Penate Medina Tuula, Medina Oula Penate. Magnetoenzymatic carrier system for imaging and targeted delivery and release of active agents. Международный патент WO 2015169843 A1.