Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Изобретение относится к селекции и биотехнологии растений, а именно к генной инженерии растений, и направлено на создание высокоэффективной системы генетической трансформации сахарной свеклы.

Изобретение может быть использовано для получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы, экспрессирующих самые различные гетерологичные гены, которые, в частности, могут определять устойчивость растений к абиотическим (гербициды, пониженные температуры окружающей среды, засуха, засоление почвы) и биотическим (насекомым-вредителям, фитопатогенным грибам, вирусам) стрессам. Кроме того, для генетической трансформации могут быть использованы гены, ответственные за синтез новых соединений (полимеров, натурального каучука, вакцин и т.д.), а также гены, изменяющие эффективность фотосинтеза.

Сахарная свекла (Beta vulgaris L) - важнейшая техническая культура, дающая сырье для сахарной промышленности. Сахарная свекла является источником 35% сахара, поставляемого на мировой рынок. Сахар является важнейшим сырьем для производства продуктов питания для населения. Кроме того, сахарная свекла имеет большое значение для обеспечения животноводства кормами. Сахарная свекла подвержена многочисленным заболеваниям, вызываемым фитопатогенными микроорганизмами и вирусами, и имеет большой круг насекомых-вредителей, которые могут уничтожать значительную часть урожая, повреждая корнеплоды, листья и семена. Значительный урон урожаю сахарной свеклы наносят сорные растения. Сорняки на полях сахарной свеклы представляют собой основную проблему для фермера. Они конкурируют с культурными растениями, снижая их урожайность.

За последние 20 лет в Российской Федерации урожаи сахарной свеклы значительно снизились из-за насекомых-вредителей, сорняков, вирусов и патогенных микроорганизмов. Это обусловлено отсутствием эффективных методов борьбы с этими вредителями и сорняками-конкурентами за питательные вещества почвы и солнечную энергию.

Традиционные методы селекции сахарной свеклы на устойчивость к патогенам и стрессам среды на современном этапе почти полностью исчерпали свой потенциал. Новым, приоритетным, направлением в борьбе с биотическими и абиотическими стрессами за повышение урожайности растений является создание трансгенных растений сахарной свеклы, несущих гены, придающие растениям новые свойства - свойства противостоять неблагоприятным факторам среды, увеличенную продуктивность и способность синтезировать новые вещества. Улучшение сахарной свеклы методами биотехнологии чрезвычайно затруднено из-за отсутствия эффективной, воспроизводимой системы генетической трансформации.

Известны попытки получения трансгенных растений сахарной свеклы. Первые успехи в трансформации сахарной свеклы были получены при использовании для трансформации бактерии Agrobacterium tumefaciens, при этом в качестве эксплантата для трансформации использовали основания побегов (1), семядольные узлы (4), эмбриогенный каллус, полученный из листовых дисков (2) или проростков (3). Однако наибольшая достигнутая частота трансформации во всех этих попытках составляла менее 1% (4). Кроме того, частота трансформации была генотипически зависимой и требовала наличия специальных навыков у сотрудников лабораторий, в которых проводились эксперименты.

Описан способ получения трансформантов с использованием трансформации протопластов, выделенных из клеток обкладки устьиц листьев, при помощи полиэтилегликоля (5). Однако этот способ не является достаточно эффективным и был подвергнут критике, в частотности, коллективом лаборатории молекулярной патологии растений министерства сельского хозяйства США, возглавляемой Л. Д. Оуэнс, который в своих экспериментах не сумел воспроизвести частоту трансформации, указанную в работах (1, 4).

Методы Hall et al. 1996 (5) и D'Halluin et al. 1992 (3), оказались непрактичными из-за зароста Agrobacterium (6). В этой лаборатории USDA были разработаны два метода трансформации сахарной свеклы (Beta vulgaris L.). Первый - с использованием Agrobacterium, в котором в качестве эксплантата использовали изолированные семядоли проростков, второй - биобаллистический, в котором используется бомбардировка морфогенного каллуса, полученного из гипокотилей, микрочастицами, несущими векторные молекулы ДНК. Полученная авторами трансформационная частота достигала 0.7% для метода с использованием Agrobacterium (вычисляемая как отношение числа полученных трансгенных растений на обработанную семядолю) и около 8% при биобаллистической трансформации (вычисляемая как отношение числа полученных трансгенных растений к числу обстрелянных чашек Петри с каллусами). Однако данная частота, конечно, является завышенной и отражает лишь количество использованных чашек Петри с каллусами, где число каллусов может быть от одного до нескольких десятков на чашку.

В работе Шнайдер с соавторами (6) были получены трансгенные растения сахарной свеклы, несущие гены, кодирующие или патогенобусловленные защитные белки, или репортерный фермент β-glucuronidase (GUS) под контролем индуцибильных промоторов. Этими авторами также были получены растения сахарной свеклы, несущие ген повышения устойчивости к насекомым, за счет их трансформации геном синтеза цитокинина под контролем пататинового промотора из картофеля.

Из числа последних достижений можно также отметить способ трансформации сахарной свеклы, раскрытый в публикации коллектива японских авторов (7), в котором получена высокая частота трансформации растений путем прямой регенерации побегов из листовых эксплантатов Beta vulgaris и Beta maritime с последующей Agrobactenum-опосредованной трансформацией. Авторы применяли следующую технику. После появления семядолей гипокотиль срезается у основания и переносится на среду для индукции роста листьев, затем листовые пластинки срезают с гипокотилей и помещают на среду индукции побегов. Побеги были регенерированы из областей проводящих пучков листовых пластинок. Полученные таким образом побеги были использованы для трансформации с использованием Agrobacterium tumefacies.

Очевидно, наиболее близким техническим решением к заявленному изобретению является способ получения трансгенного растения сахарной свеклы, включающий Agrobacterium-опосредованную трансформацию клеток выращенных in vitro семядолей сахарной свеклы с использованием вектора, несущего участок ДНК, кодирующий гены cp4/epsps, и последующую регенерацию из семядольной ткани ростков в присутствии глифосата, который описан в патенте РФ №2224024 (Зингента Партиписейшенс АГ, опубл. 20.02.2004).

Как показывает анализ, эффективность метода трансформации, или частота получения генетически трансформированных растений, определяется как отношение числа полученных истинных трансформантов к числу использованных эксплантатов. Эта частота является результатом произведения частот процессов, приводящих к получению фертильного генетически модифицированного растения: 1) частоты индукции клеточных структур, компетентных к трансформации и способных к регенерации из состояния in vitro во взрослое фертильное растение; 2) частоты возникновения трансформационного события (частоту стабильной интеграции вектора экспрессии в геном растения реципиента); 3) частоты выживания трансформантов на селективных средах при селекции и 4) частоты укоренения выживших после селекции трансформантов.

Вместе с тем всем известным методам трансформации сахарной свеклы, помимо типичных недостатков, заключающихся в низкой частоте получения трансгенных растений и высокой зависимости от генотипа, присущ еще один, обычно не упоминаемый недостаток, а именно высокая вероятность получения химерных трансформантов, т.е. трансформантов не только из клеток, которые желательно трансформировать, но и из различных иных неидентифицированных клеток, что приводит к получению совершенно не того материала для селекции растений, который непосредственно предусматривался разработанным способом трансформации.

В заявленном изобретении решается задача получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы, при котором резко снижается частота получения химерных трансформантов, что само по себе повышает эффективность трансформации независимо от достижения других преимуществ по сравнению с известными способами получения трансгенных растений, а также задача повышения частоты трансформации.

Данная задача решается тем, что в способе получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы, включающем Agrobacterium-опосредованную трансформацию культивированных in vitro клеток сахарной свеклы и регенерацию побегов из трансформированных клеток, для трансформации используют меристематические клетки семядольных узлов, не вступившие в стадию каллусообразования или регенерации побегов.

В оптимальном варианте задача решается тем, что для трансформации предпочтительно используют клетки вторичных апикальных меристем, индуцируемых посредством срезания первичных побегов у культивируемых in vitro семядольных узлов, причем для индуцирования клеток вторичных апикальных меристем используют модифицированную среду MS, включающую MS макро- и микросоли; витамин В-5; 0,01 мг/л биотина; 1 мг/л пантотеновой кислоты; 0,5 г/л буфера MES; 0,5 мг/л БАП (бензиламинопурин); 0,1 мг/л NAA (нафтилуксусная кислота); 25 мг аденозинсульфата; 30 г/л сахарозы и 0,8% агар-агара.

Кроме того, указанная задача решается тем, что перед трансформацией клетки меристематической ткани сахарной свеклы обрабатывают путем бомбардирования их микрочастицами твердого вещества, причем до бомбардирования клеток микрочастицами семядольные узлы, клетки которых используют для трансформации, подсушивают в ламинарном боксе в течение 30 - 60 мин.

Далее изобретение раскрывается подробно в виде конкретных примеров выполнения отдельных стадий процесса получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы.

Пример 1. Получение асептических растений сахарной свеклы в культуре in vitro.

Все операции выполняются в условиях ламинарного бокса, обеспечивающего асептические условия. Семена сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) помещают в концентрированную серную кислоту на 50-60 минут. Промывают 15 минут в горячей дистиллированной воде (50-60°С), содержащей 3-4 капли Tween. Далее промывают стерильной дистиллированной водой. После этого семена помещают на 20 минут в 20-40% раствор NaOCl, который приготовляют разбавлением любого коммерческого отбеливателя типа «Белизна», «Ас» или «Domestos» стерильной дистиллированной водой, добавляя 2-3 капли Tween. Пять раз промывают стерильной водой, время промывок 2, 5, 10, 15 и 30 минут. Затем простерилизованные семена высаживают в пробирки, содержащие среду GM (Germination Media). Среда содержит MS макро- и микросоли, В-5 витамины, 0,01 мг/л биотина, 1 мг/л пантотеновой кислоты, 0.5 г/л буфера MES, 1 мг/л БАП (бензиламинопурин), 0.5 мг/л ТИБК (трийодбензойная кислота), 30 г/л сахарозы и 8 г/л агар-агара, среда имеет рН 5.8 до автоклавирования. Стерилизацию среды осуществляют в автоклаве при 1.2 атм в течение 15 минут. Выращивание производят в темноте при температуре от 22 до 27°С.

Пример 2. Получение эксплантатов

После 18-24 дней проращивания проростки, достигшие 3-4 см, используют для получения семядольных узлов. Проростки помещают в чашку Петри и скальпелем отсекают апекс побега с семядолями, отрезают низлежащую область гипокотиля длиной 1,5-2 мм, по 1 сегменту от каждого проростка. Помещают в чашки Петри, содержащие модифицированную среду MS для индукции первичных адвентивных побегов (MS макро- и микросоли, В-5 витамины, 0,01 мг/л биотина, 1 мг/л пантотеновой кислоты, 0.5 г/л буфера MES, 0.5 мг/л БАП (бензиламинопурин), 0.1 NAA (нафтилуксусная кислота), 25 мг аденозинсульфата, 30 г/л сахарозы и 0.8% агар-агара). Культивируют при люминесцентном освещении в течение 6-7 дней при температуре 24°С. От семядольных узлов отсекают новообразовавшиеся побеги, обнажая меристемные зоны. Полученные меристемные зоны, компетентные к вторичной регенерации множественных побегов, подвергают сокультивации с Agrobacterium. Результаты индукции множественной регенерации побегов в культивируемых in vitro семядольных узлах показаны в таблице 1.

Пример 3. Предобработка семядольных узлов сахарной свеклы

Обработанные вышеуказанным способом семядольные узлы выкладывают в центре чашки Петри диаметром 90 мм, по окружности диаметром 30 мм по 15-20 узлов на чашку. Для уменьшения поврежденности меристематической ткани при обстреле микрочастицами семядольные узлы подсушивают в ламинарном боксе 30-60 минут, чем вызывают плазмолиз - отслаивание цитоплазмы от стенок клеток, что обеспечивает повышенную выживаемость клеток после бомбардировки микрочастицами.

Для бомбардировки используют вольфрамовые микрочастицы M10 (Sylvania Chemical/Metals), размер частиц в смеси варьирует 0,1-7 мкм, наибольшее количество частиц 80% имеет размер 0,4-2 мкм. Навеску микрочастиц M10 массой 50 мг помещают в эппендорф объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл 96% этанола, ресуспендируют и оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Через 20 минут смесь центрифугируют 7 минут при 14000 об/мин, удаляют этанол и добавляют 500 мкл стерильной дистиллированной воды. Центрифугируют 9 минут при 14000 об/мин. Промывку частиц водой повторяют три раза. Конечный объем смеси воды с частицами доводят до 500 мкл. Смесь должна быть использована в течение 24 часов.

Пример 4. Сокультивация эксплантатов с Agrobacterium

Подсушенные семядольные узлы дважды обстреливают микрочастицами. Обстрел семядольных узлов сахарной свеклы проводится посредством "генной пушки" PIG (Particle inflow gun) (10). Давление гелия при выстреле равно 6 атмосфер. Объем гелия при выстреле 6 см³. Давление вакуума в камере 30 мм Hg столба. Расстояние от источника частиц (фильтродержатель) до ткани мишени (морфогенетический каллус сахарной свеклы) 12 см. Разбивающая сетка находится на расстоянии 9 см от ткани мишени, сечение ячейки сетки 500 мкм. Каждая чашка Петри с каллусами обстреливается дважды.

Далее семядольные узлы инкубируют с разведенной культурой штамма Agrobacterium tumefaciens EHA 105 в течение 20-60 мин, затем переносят на стерильную фильтровальную бумагу и далее - на чашки Петри диаметром 9 см со средой 1/5-1/10 MS с ацетосирингоном (200 μM) для сокультивации. Культивируют 2-5 суток. Условия сокультивации: температура 22-27°С, фотопериод - 16 ч.

Пример 5. Селекция трансформантов

После сокультивации с Agrobacterium семядольные узлы помещают на среду SM (selection medium), содержащую MS макро- и микросоли, витамин В-5, цефотаксим (250-500 мг/л) или карбенициллин (500-1000 мг/л), бензиламинопурин (1 мг/л), селективный агент - фосфинотрицин (2 мг/л), на 2 недели. Далее от семядольных узлов отсекают новообразовавшиеся побеги и листья в основании и пересаживают на свежую селективную среду с добавлением фосфинотрицина в концентрации 2-5 мг. На селективной среде экспланты культивируют 12-16 недель с пересадкой на свежую селективную среду каждые 1.5-2 недели. Фотопериод день/ночь составляет -16/8 часов. Температура культивирования 24°С.

Пример 6. Микроклональное размножение трансформантов и регенерация растений

Отселектированные трансформированные побеги подвергали микроклональному размножению на среде MS с цефотаксимом (250 мг/л), нафтилуксусной кислотой (0.05 мг/л) и бензиламинопурином (0.5 мг/л) с добавлением фосфинотрицина (0.5 мг/л). Выжившие после селективного микроклонального размножения трансгенные одиночные побеги укореняли на среде для укоренения (1/2 MS солей и В 5-витаминов, 8 г/л агара, 15 г/л сахарозы, рН 5.7, 5 мг/л индолилбутановой или индолилмасляной кислоты, 250 мг/л цефотаксима, 0.25-0.50 фосфинотрицина).

Результаты трансформации, показывающие влияние генотипа растений на частоту агробактериальной трансформации сахарной свеклы с использованием культивируемых in vitro семядольных узлов, приведены в таблице 2.

В качестве подтверждения трансформации вышеописанным способом приведен электрофоретический анализ результатов полимеразно-цепной реакции (ПЦР) (см. фиг.). Были использованы праймеры BarAtF и BarAtR на ген BAR (Bialaphos resistance) (8, 9) из ДНК трансгенной сахарной свеклы.

На дорожках с указанными номерами показаны:

1. Маркер молекулярной массы ДНК 1кb (Fermentas).

2. Н₂O.

3. ПЦР на препарате ДНК трансгенного картофеля, несущего ген BAR.

4. ПЦР на препарате ДНК нетрансгенной сахарной свеклы.

5. ПЦР на препарате ДНК, используемой для трансформации и содержащей последовательность гена BAR.

6-12. ПЦР на препарате ДНК трансгенной сахарной свеклы Льговская, несущей ген BAR.

13-17. ПЦР на препарате ДНК трансгенной сахарной свеклы Рамонь 73, несущей ген BAR.

18,19. ПЦР на препарате ДНК трансгенной сахарной свеклы Русь, несущей ген BAR.

Приведенные примеры не исчерпывают всех вариантов выполнения изобретения, охватываемых пунктами формулы изобретения, и приведены лишь для иллюстрации возможностей, предоставляемых данным изобретением.

Список литературы

1. Lindsey К. and Gallois P. Transformation of sugar beet (Beta Vulgaris L.) by Agrobacterium tumefaciens. Journal Experemental Bot. 41: p.529-536, 1990.

2. Ben-Tahar S., Gerentes D., Kallerhoff J., Perez P., Perret J. Transforming Beta Vulgaris cells with Agrobacterium-contg. Vector which imparts e.g. resistance to virus, by contacting bacteria with dispersion or suspension of callus tissue. Patent WO 9113159, 1991.

3. D'Halluin К., Bossut M., Bonne E., Mazur В., Leemans J. and Botterman J. Transformation of sugarbeet (Beta Vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plant. Biotechnology 10: p.309-315, 1992.

4. Krens F.A., Trivonova A., Keizer L.C.P. and Hall R.D. The efficiency of exogenously - applied phytohormones on gene transfer efficiency in sugar beet (Beta Vulgaris L.). Plant Science, 116:97-106, 1996.

5. Hall R.D., Riksenbuinsma Т., Weyens G.J., Rosqoin I.J., Denys P.N., Evans I.J. and Krens F.A. A high efficiency technique for the generation of transgenic sugar beet from stomatal guard cells. Nature Biotech., p.1133-113, 1996.

6. Snyder G.W., Ingersoll J.C., Smigocki A.C., Owens L.D. Introduction of pathogen defense genes and cytokinin biosynthesis gene into sugar beet (Beta vulgaris L.) by Agrobacterium or particle bombardment. Plant Cell Rep., 18: 829-834,1999.

7. Hisano H., Kimoto Y., Hayakawa H., Takeichi J., Domae Т., Hashimoto R., Abe J., Asano S., Kanazawa A., Shimamoto Y. High frequency Agrobacterium-mediated transformation and plant regeneration via direct shoot formation from leaf explants in Beta vulgaris and Beta maritime. Plant Cell Rep., 22:910-918, 2004.

8. Wohlleben W., Arnold W., Broer I., Hillermann D., Strauch E. and Pühler A. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces Tü494 and its expression in Nicotiana tabacum. Gene 70:25-37, 1988.

9. Wehrmann A., Van Vliet A., Opsomer С., Botterman J. and Schulz A. The similarities of bar and pat gene products make them equally applicable for plant engineers. Nature Biotechnology 14:1274-1278, 1996.

10. Finer J.J, Vain P., Jones M.W., McMullen M.D. Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Reports 11:232-238, 1992.