СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБРАЗЦА ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМА, СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМА И НАБОР ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМА

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу детектирования микроорганизма, содержащегося в продуктах питания или клинических образцах, способу получения образца, используемого для способа, и к набору для детектирования микроорганизма. Более конкретно настоящее изобретение относится к способу и набору для детектирования микроорганизма, который позволяет равномерно различать живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки микроорганизма, содержащегося в пищевых продуктах и клинических образцах.

Уровень техники

Метод культивирования на чашках традиционно использовали для измерения общего количества живых бактерий в пищевых продуктах, клинических образцах или окружающей среде. Однако метод культивирования на чашках требует для получения результатов примерно два дня времени. Более того, при бактериологическом тесте, основанном на культуре, при использовании обычно используемой среды трудно детектировать поврежденные бактерии в окружающей среде, бактерии, поврежденные искусственным воздействием (первое может относиться к живым, но не культивируемым (VNC) клеткам, и последнее может относиться к поврежденным клеткам, в особенности в узком смысле этого слова), и т.д. и было желательным разработать быстрый и надежный способ для подсчета живых бактерий.

Проточная цитометрия (FCM) представляет собой способ пропускания потока образца в проточной кювете при постоянной скорости потока, проходящего через лазерный луч, и измерения рассеяния света клетками или другими микрочастицами или флуоресценции, испускаемой клетками или другими микрочастицами. Поскольку это позволяет детектировать микроорганизмы на уровне одной клетки, в последние годы этот способ используют для детектирования микроорганизмов не только в области молекулярной биологии и клеточной биологии, но также для детектирования микроорганизмов в окружающей среде, молочных продуктах, напитках, клинических образцах и т.д. (например, патентные документы 1 и 2, непатентные документы с 1 по 5).

Однако аппараты для FCM (проточные цитометры), используемые в целях указанного способа, являются чрезвычайно дорогостоящими и имеют большие размеры, и они также требуют наличия навыка для их использования. Более того, для указанных аппаратов до настоящего момента существуют требующие улучшения или решения проблемы, связанные с экономией, безопасностью, простотой, надежностью и достоверностью различения живых клеток и мертвых клеток микроорганизмов для действительных применений в области пищевой промышленности, где существует большое разнообразие бактериальных контаминантов, как неповрежденными бактериями, поврежденными бактериями, так и мертвыми бактериями.

Например, патентный документ 1 описывает способ детектирования общего содержания бактерий в жидком образце при использовании хелатирующего иона, протеазы, поверхностно-активного вещества и бактериологически-специфического флуоресцентного красителя. Хелатирующий ион, типичным примером которого является ЭДТА, необходимо использовать в концентрации от 1 до 5 мМ, и если концентрация превышает данный уровень, то клеточные стенки и клеточные мембраны живых бактерий, клеточные стенки которых не повреждены, могут быть также разрушены. Предпочтительная концентрация хелатирующего иона, используемого в способе патентного документа 1, составляет от примерно 6 до 17 мМ, и, исходя из этого, существует проблема, состоящая в том, что подвергаются лизису как мертвые бактерии, так и живые бактерии. Более того, предел детектирования указанного способа составляет примерно 10⁴ КОЕ/мл, и, исходя из этого, если число живых бактерий низкое (10³ КОЕ/мл или меньше) в жидком образце, при условии что только одна живая бактерия существует в жидком образце, бактерии должны пролиферировать до уровня указанного выше предела детектирования. Исходя из этого, указанный способ нельзя безусловно рассматривать как быстрый способ.

Патентный документ 2 описывает способ обработки образцов жидкостей организма протеазой, липазой и нуклеазой, лизис лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов при использовании окрашивания этидий бромидом в буфере, включающем борат натрия, ЭДТА, формальдегид и неионное поверхностно-активное вещество (Triton X-100 и т.д.), для окрашивания этидий бромидом только бактерий, детектирование и количественные оценки бактерий на основе флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или т.п. Однако предполагается, что лейкоциты и тромбоциты не подвергаются лизису, оставаясь в теле жидкого образца даже после обработки протеазой, липазой и нуклеазой, и на них адсорбируются живые бактерии с образованием комплексов, и что окрашиваются как живые бактерии, так и мертвые бактерии, и, таким образом, оказывается трудным определить, является бактерия живой или мертвой. Более того, хотя патентный документ 2 описывает, что способ представляет собой способ детектирования бактерий при такой низкой плотности, как 10 клеток/мл (образец) в течение времени примерно 2 часа или быстрее, часто 45 минут или быстрее, патентный документ в действительности описывает пример, в котором детектирование оказалось невозможным, пока в жидком образце не присутствовало бы по крайней мере 10⁴ КОЕ/мл или более бактерий, и, таким образом, способ не применим для детектирования небольшого количества микроорганизмов, такого как в коровьем молоке.

Непатентный документ 1 описывает способ использования свойства SYTO63, состоящего в том, что он проникает сквозь клеточные стенки и клеточные мембраны живых клеток и мертвых клеток, и свойство TO-PRO3, состоящее в том, что он проникает сквозь клеточные стенки и клеточные мембраны мертвых клеток, в попытке распознавания живых бактерий и мертвых бактерий на основе проточной цитометрии. Дополнительно, документ описывает пример, в котором живые клетки и мертвые клетки суспендировали в стерилизованной воде и проводили попытку распознавания живых клеток и мертвых клеток в указанной среде. Однако мертвые клетки представляли собой клетки, которые кипятили в течение 15 минут, и их клеточные стенки и клеточные мембраны были в значительной степени повреждены по сравнению с мертвыми клетками в реальных пищевых продуктах. Исходя из этого, указанный способ представляет собой способ, пригодный исключительно для мертвых бактерий в ограниченном диапазоне пищевых продуктов, таких как термически обработанные блюда, при этом не оценивались условия для ультравысокотемпературной пастеризации, используемой для коровьего молока и т.д. и в современных продуктах, и уничтожающей бактерии без денатурации белков в пищевых продуктах.

Непатентный документ 2 описывает способ, позволяющий протеиназе К действовать на UHT (пастеризованное при ультравысокой температуре) коровье молоко для переваривания мицеллярного казеина, с удалением липидов путем центрифугирования при охлаждении для детектирования бактерий в коровьем молоке и измерения в нем общего числа бактерий (включая живые бактерии и мертвые бактерии), и способ добавления 0,1% Triton X-100 в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества к сырому молоку дополнительно к указанной выше протеиназе К для детектирования бактерий в сыром молоке и измерения общего бактериального числа (числа живых бактерий и мертвых бактерий). Однако в способах непатентного документа 2 даже если предоставляли протеазе К воздействовать на UHT коровье молоко, мицеллярный казеин полностью не переваривается и присутствует большое число не полностью переваренных продуктов, имеющих размер, сопоставимый с размером бактерий. Если флуоресцентный ядерный краситель, такой как SYTO BC или SYTO9, действует на такие продукты, наблюдается сильное неспецифическое поглощение, затрудняющее их различение от живых бактерий. Более того, существует проблема, состоящая в том, что клеточные мембраны соматических клеток, такие как коровьи лейкоциты и клетки эпителия молочной железы, рассматриваемые как часть компонентов, контаминирующих молоко, повреждаются только в незначительной степени, и если их подвергают окрашиванию SYTO BC, SYTO9 или пропидий йодидом в том виде, в котором они присутствуют, то пропидий йодид не проникает в них, и в результате хромосомная ДНК испускает зеленую флуоресценцию, что затрудняет различение соматических клеток и живых бактерий.

Непатентный документ 3 описывает способ, сходный со способом патентного документа 1, за тем исключением, что не используют обработку протеазой в качестве способа измерения числа живых бактерий молочнокислых бактерий в йогурте или закваске йогурта, и способ описан в качестве способа использования неионогенного поверхностно-активного вещества в сочетании с хелатирующим агентом. В качестве отличительного признака изобретения описано, что способ позволяет разрушать соматические клетки, выступающие в качестве контаминантов, и эффективно разделять глобулы жира. Однако образцы, подвергаемые указанной выше обработке, содержат множество контаминантов, происходящих из молока, и предел обнаружения живых кисломолочных бактерий уменьшается до настолько малого содержания, как примерно 10⁵ КОЕ/мл для йогурта или закваски йогурта из-за наличия контаминантов. Исходя из этого, способ требует в особенности деликатного определения условий для разрушения исключительно соматических клеток и отсутствия повреждения клеточных стенок и клеточных мембран живых бактерий путем регулирования концентрации неионогенного поверхностно-активного вещества и хелатирующего агента. Таким образом, способ не пригоден в качестве удобного и высокочувствительного способа детектирования для различения живых бактерий и мертвых бактерий.

Хотя этидий моноазид (EMA, 8-азид-3-амин-6-фенил-5-этилфенантрадиний хлорид) в общем известен как обладающий противораковым действием, он представляет собой яд в отношении топоизомеразы II (тип II топоизомеразы), существующей в клетках млекопитающих (например, непатентный документ 5). ЕМА беспорядочно интеркалирует в хромосомную ДНК, и затем только интеркалированный ЕМА превращается в нитрен под действием облучения видимым светом и связывается с хромосомной ДНК при помощи ковалентного связывания. Например, под действием топоизомеразы раковые клетки регулируют степень спиральности цепей ДНК или разматывают цепи ДНК, для того чтобы осуществить репликацию цепей ДНК и экспрессию генов (транскрипция ДНК), и расплетание достигается путем расщепления соответствующих участков хромосомной ДНК и повторного лигирования продуктов расщепления. В этом случае, как и для функции ЕМА, повторное лигирование ДНК топоизомеразой II ингибируется в результате ковалентного присоединения нитрена, полученного из ЕМА, в момент повторного лигирования, и в результате усиливается фрагментация ДНК. ЕМА, не интеркалированная в цепи ДНК и существующая в свободной форме, превращается под действием видимого света в гидроксиламин, но гидроксиламин не ингибирует активности топоизомеразы II.

В качестве соединений, ингибирующих такую активность топоизомеразы II, помимо этидий моноазида, упомянутого выше, известны амсакрин, доксорубицин, эллиптицин, этопсид, митоксантрон, саинтопин и т.д. В качестве соединений, ингибирующих активность топоизомеразы I, которая обладает активностью, сходной с топоизомеразой II, известны камптотецин, топотекан и т.д. (например, непатентный документ 6). Дополнительно, в области бактерий в качестве соединений, ингибирующих активность бактериальной ДНК-гиразы, имеющей активность, сходную с упомянутыми выше ферментами, известны ципрофлоксацин, офлоксацин, эноксацин, пефлоксацин, флероксацин, норфлоксацин, налидиксовая кислота, оксолиновая кислота, пиромидиновая кислота и т.д. (например, непатентный документ 7).

Однако до настоящего времени не сообщалось об использовании указанных ядов топоизомеразы I, ядов топоизомеразы II и ядов бактериальной ДНК-гиразы для предварительной обработки образцов, таких как пищевые продукты и клинические образцы, содержащие микроорганизмы, в способах исследования для различения живых клеток и мертвых клеток микроорганизмов в целях реализации быстрого и высокочувствительного детектирования.

В качестве другого способа детектирования живых бактерий предлагалась автоматическая система для удобного и быстрого детектирования респираторной активности и эстеразной активности (патентный документ 3). Однако детектирование при использовании указанного способа ограничивается случаями, при которых может быть точно измерена респираторная активность и эстеразная активность исследуемой бактерии.

В качестве состояний, отличных от живых бактерий, существуют поврежденные клетки, VNC (живые, но некультивируемые клетки) и мертвые клетки. Описан способ определения их проточной цитометрией при использовании cFDA (диацетат карбоксифлуоресцеина), который испускает зеленую флуоресценцию в присутствии эстеразы и пропидий йодида (PI) (непатентный документ 8). Однако данный способ также представляет собой способ, при помощи которого можно легко различать живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки, только в том случае, если повреждение клеточных стенок в поврежденных клетках выражено в значительной степени.

Таким образом, если поврежденные клетки представляют собой поврежденные клетки с низкой степенью повреждения, вызванной длительным временем пастеризации при низкой температуре (LTLT) или коротким временем пастеризации при высокой температуре (HTST), или поврежденные клетки с низкой степенью повреждения, вызванной воздействием окружающей среды, живые клетки и поврежденные клетки не могут быть различены при использовании данного способа.

Патентный документ 1: Международная патентная заявка, нерассмотренная публикация в Японии № 9-510105.

Патентный документ 2: Японская патентная публикация (Kokoku) № 6-55157.

Патентный документ 3: Японский опубликованный патент № 2002-281998.

Непатентный документ 1: Bokin Bobai, vol. 31, No.7, 2003, pp. 357-363.

Непатентный документ 2: Applied and Environmental Microbiology, vol. 66, No. 3, 2000, pp. 1228-1232.

Непатентный документ 3: Applied and Environmental Microbiology, vol. 68, No. 6, 2002, pp. 2934-2942.

Непатентный документ 4: Applied and Environmental Microbiology, vol. 60, No. 12, 1994, pp. 4255-4262.

Непатентный документ 5: Biochemistry, vol. 36, No. 50, 1997, pp. 15884-15891.

Непатентный документ 6: The Journal of Biological Chemistry, vol. 270, No. 37, 1995, pp. 21429-21432.

Непатентный документ 7: The New England Journal of Medicine, vol. 324, No. 6, 1991, pp. 384-394.

Непатентный документ 8: Applied and Environmental Microbiology, vol. 68, 2002, pp. 5209-5216.

Описание изобретения

Проблемы, которые решает настоящее изобретение

Одна из целей настоящего изобретения состоит в обеспечении способа детектирования микроорганизма, который позволяет удобное и быстрое детектирование живых микроорганизмов в пищевых продуктах и клинических образцах при использовании экономически выгодной проточной цитометрии, и может применяться при выборочных инспекциях на пищевых предприятиях или в клинической области, и способа получения образца, используемого в последующем способе. Более того, другая цель настоящего изобретения состоит в обеспечении набора, делающего возможным распознавание живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток.

Средства решения проблемы

С точки зрения указанного выше уровня техники, заявители настоящего изобретения тщательно исследовали удобный способ теста с достоверностью и точностью и в приложении к детектированию живых клеток микроорганизма, содержащихся в пищевых продуктах и клинических образцах, в особенности для различения живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток. В результате, заявители обнаружили, что даже если количество микроорганизма, содержащегося в образце, бесконечно мало, то возможно различить живые клетки и мертвые клетки с высокой степенью чувствительности, путем идентификации различных контаминантов, включающих мертвые клетки, содержащиеся в пищевых продуктах и клинических образцах, путем предварительной обработки пищевого продукта или клинического образца липазой, протеазой, этидий моноазидом, в качестве ДНК-интеркалирующего агента и т.д., для того чтобы эффективно удалять контаминанты на стадии предварительной обработки образца, флуоресцентного окрашивания образца и подвергания измерению при использовании проточного цитометра. Таким образом, заявители осуществили настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ получения измеряемого образца для детектирования живых клеток микроорганизма в тестируемом образце при помощи проточной цитометрии, который включает следующие стадии:

а) стадия обработки тестируемого образца ферментом, обладающим активностью с точки зрения разрушения клеток, отличающихся от клеток микроорганизма, коллоидных частиц белков или липидов, присутствующих в исследуемом образце, и

b) стадия обработки тестируемого образца ядом топоизомеразы и/или ядом ДНК-гиразы.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ детектирования живых клеток микроорганизма в тестируемом образце при помощи проточной цитометрии, который включает следующие стадии:

а) стадия обработки тестируемого образца ферментом, обладающим активностью с точки зрения разрушения клеток, отличающихся от клеток микроорганизма, коллоидных частиц белков или липидов, присутствующих в исследуемом образце,

b) стадия обработки тестируемого образца ядом топоизомеразы и/или ядом ДНК-гиразы,

с) стадия обработки тестируемого образца, обработанного на стадиях а) и b) агентом, окрашивающим ядра, и

d) стадия детектирования микроорганизмов в тестируемом образце, обработанном агентом, окрашивающим ядра, проточной цитометрией.

В предпочтительном варианте осуществления способа для получения измеряемого образца для детектирования живых клеток микроорганизма в тестируемом образце при помощи проточной цитометрии и способа детектирования живых клеток микроорганизма в тестируемом образце при помощи проточной цитометрии, стадию b) проводят после стадии а).

В предпочтительных вариантах осуществления указанных выше способов тестируемый образец представляет собой тестируемый образец молока, молочного продукта, пищевого продукта, полученного при использовании молока или молочного продукта в качестве исходного материала, образец крови, образец мочи, образец спинно-мозговой жидкости, образец синовинальной жидкости и образец плевральной жидкости.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов микроорганизм представляет собой бактерию.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов фермент выбирают из липолитических ферментов и протеаз.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов яд топоизомеразы выбирают из амсакрина, камптотецина, доксорубицина, эллиптицина, этопозида, митоксантрона, саинтопина, топотекана и СР-115953.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов яд ДНК-гиразы выбирают из ципрофлоксацина, офлоксацина, эноксацина, пефлоксацина, флероксацина, норфлоксацина, налидиксовой кислоты, оксолиновой кислоты и пиромидиновой кислоты.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов яд топоизомеразы представляет собой этидий моноазид, и способ включает стадию подвергания тестируемого образца, к которому добавляют этидий моноазид, облучению видимым светом.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов способы дополнительно включают стадию с) обработки тестируемого образца, обработанного в стадиях а) и b), агентом, окрашивающим ядра.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов агент, окрашивающий ядра, включает первый окрашивающий агент, который может проникать через клеточные стенки живых клеток и мертвых клеток, и второй окрашивающий агент, который более легко проникает через клеточные стенки мертвых клеток, по сравнению с клеточными стенками живых клеток, по сравнению с первым окрашивающим агентом.

В предпочтительных вариантах осуществления упомянутых выше способов агент, окрашивающий ядра, представляет собой пропидий йодид и SYTO9.

Настоящее изобретение также обеспечивает набор для получения измеряемого образца для детектирования живых клеток микроорганизма в тестируемом образце при использовании проточной цитометрии, который включает следующие элементы: фермент, выбранный из липолитических ферментов и протеаз, яд топоизомеразы и/или яд ДНК-гиразы и агенты, окрашивающие ядра.

В предпочтительном варианте осуществления упомянутого выше набора яд топоизомеразы выбирают из амсакрина, камптотецина, доксорубицина, эллиптицина, этопозида, митоксантрона, саинтопина, топотекана и СР-115953.

В предпочтительном варианте осуществления упомянутого выше набора яд ДНК-гиразы выбирают из ципрофлоксацина, офлоксацина, эноксацина, пефлоксацина, флероксацина, норфлоксацина, налидиксовой кислоты, оксолиновой кислоты и пиромидиновой кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления упомянутого выше набора яд топоизомеразы представляет собой этидий моноазид.

Эффективное действие изобретения

Настоящее изобретение позволяет удобно и быстро различать живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки в пищевых продуктах и клинических образцах при использовании проточной цитометрии. Способы и набор по настоящему изобретению можно применять при стихийных инспекциях, а также он является выгодным с экономической точки зрения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания LP-обработанной группы суспензий Escherichia coli (живые бактерии и поврежденные бактерии) и LP-обработанной группы суспензий Staphylococcus epidermidis (живые бактерии и поврежденные бактерии), а также необработанной группы суспензий Escherichia coli (живые бактерии и поврежденные бактерии) и необработанной группы суспензий Staphylococcus epidermidis (живые бактерии и поврежденные бактерии).

Фиг. 2. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания LP-обработанного UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые бактерии), и LP-обработанного UHT гомогенизированного молока, не инокулированного бактериями.

Фиг. 3. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые бактерии и поврежденные бактерии), LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые бактерии и поврежденные бактерии), а также LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, не инокулированного бактериями.

Фиг. 4. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания для LP-обработанных и ЕМА-обработанных суспензий Escherichia coli (живые бактерии и поврежденные бактерии) и суспензий Staphylococcus epidermidis (живые бактерии и поврежденные бактерии).

Фиг. 5. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания для LP-обработанного и ЕМА-обработанного UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые бактерии), и UHT гомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые бактерии), и UHT гомогенизированного молока, не инокулированного бактериями.

Фиг. 6. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания для LP-обработанного и ЕМА-обработанного негомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые бактерии и поврежденные бактерии).

Фиг. 7. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания для LP-обработанного и ЕМА-обработанного LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые бактерии и поврежденные бактерии).

Фиг. 8. Графики, показывающие результаты FCM измерений после SYTO9/PI окрашивания для UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые бактерии) и Staphylococcus epidermidis (живые бактерии) после LP-обработки и обработки а) амсакрином, b) эллиптицином, с) камптотецином или d) ципрофлоксацином.

Фиг. 9. Графики, показывающие зависимость между временем погружения в кипящую воду микропробирки, содержащей физиологический солевой раствор, и температурой жидкости в микропробирке.

Фиг. 10. Фотографии электрофореза хромосомных ДНК Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter и Salmonella (живые бактерии и поврежденные бактерии), экстрагированных и очищенных до (N) или после (E) ЕМА-обработки.

Фиг. 11. Фотографии электрофореза хромосомных ДНК Escherichia coli (поврежденные бактерии и мертвые бактерии), экстрагированных и очищенных до (N) или после (E) ЕМА-обработки.

Фиг. 12. Фотографии электрофореза хромосомных ДНК Staphylococcus epidermidis (живые бактерии, поврежденные бактерии и мертвые бактерии), экстрагированных и очищенных до (N) или после (E) ЕМА-обработки.

Фиг. 13. Графики, показывающие результаты FCM измерений для живых бактерий, поврежденных бактерий и мертвых бактерий Escherichia coli до и после ЕМА-обработки.

Фиг. 14. Графики, показывающие результаты FCM измерений для живых бактерий, поврежденных бактерий и мертвых бактерий Staphylococcus epidermidis до и после ЕМА-обработки.

Фиг. 15. Графики, показывающие результаты FCM измерений для живых бактерий Mycobacterium tuberculosis, а также поврежденных бактерий и мертвых бактерий Mycobacterium tuberculosis, обработанных гидразидом изоникотиновой кислоты и рифампицином до и после ЕМА-обработки.

Фиг. 16. Графики, показывающие результаты FCM измерений для живых бактерий, а также поврежденных бактерий и мертвых бактерий Listeria, обработанных ампициллином и гентамицином до и после ЕМА-обработки.

Фиг. 17. Графики, показывающие соответствие классификаций живых бактерий, поврежденных бактерий и мертвых бактерий Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis и Listeria согласно АТФ способу и их различение согласно способу настоящего изобретения.

Фиг. 18. Графики, показывающие соответствие классификаций живых бактерий, поврежденных бактерий и мертвых бактерий Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis и Listeria согласно эстеразному способу и их различение согласно способу настоящего изобретения.

Фиг. 19. Графики, показывающие результаты FCM измерений для Listeria в крови человека до и после ЕМА-обработки

Лучший вариант осуществления изобретения

Далее здесь будут детально объяснены предпочтительные варианты осуществления изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается следующими предпочтительными вариантами осуществления и может быть свободно модифицировано в пределах области применения настоящего изобретения.

Способ получения измеряемого образца для проточной цитометрии (в дальнейшем также обозначаемой аббревиатурой «FCM») согласно настоящему изобретению представляет собой способ для получения измеряемого образца для детектирования живых клеток микроорганизма в тестируемом образце при помощи проточной цитометрии и представляет собой способ, включающий следующие стадии:

а) стадия обработки тестируемого образца ферментом, обладающим активностью с точки зрения разрушения клеток, отличающихся от клеток микроорганизма, коллоидных частиц белков или липидов, присутствующих в исследуемом образце, и

b) стадия обработки тестируемого образца ядом топоизомеразы и/или ядом ДНК-гиразы.

Способ детектирования живых клеток микроорганизма в тестируемом образце представляет собой способ детектирования живых клеток при использовании образца, полученного указанным выше способом для получения измеряемого образца для FCM, и дополнительно включает следующие стадии дополнительно к указанным выше стадиям а) и b):

с) стадия обработки тестируемого образца, обработанного на стадиях а) и b) агентом, окрашивающим ядра, и

d) стадия детектирования микроорганизмов в тестируемом образце, обработанном агентом, окрашивающим ядра, проточной цитометрией.

В указанной спецификации «тестируемый образец» обозначает объект, для которого детектируются присутствующие в нем живые клетки микроорганизма, и он не является ограничивающим до той степени, пока микроорганизм может быть детектирован FCM.

Примеры включают молоко, молочные продукты и пищевые продукты, полученные при использовании молока или молочного продукта в качестве исходного материала, образцы крови, образцы мочи, образцы спинно-мозговой жидкости, образцы синовинальной жидкости и образцы плевральной жидкости и т.п. В особенности предпочтительны молоко, молочные продукты, пищевые продукты, полученные при использовании молока или молочного продукта в качестве исходного материала. В настоящем изобретении тестируемый образец может представлять собой любой из указанных выше продуктов и биологических образцов самих по себе и может представлять собой образец, получаемый разбавлением или концентрированием любого из указанных выше продуктов и биологических образцов, или путем подвергания любого из указанных выше продуктов или биологических образцов предварительной обработке, отличающейся от обработки согласно способу настоящего изобретения. Примеры предварительной обработки включают термическую обработку, фильтрацию, обработку антибиотиком и т.д.

«Микроорганизм» представляет собой объект, детектируемый при использовании способа настоящего изобретения, и он не является ограничивающим до той степени, пока микроорганизм может быть детектирован FCM, и яд топоизомеразы, яд ДНК-гиразы или этидий моноазид по-разному действуют на живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки микроорганизма. Предпочтительные примеры включают бактерии, гифомицеты, дрожжи и т.д. Бактерии включают как грамположительные бактерии, так и грамотрицательные бактерии. Примеры грамположительных бактерий включают бактерии Staphylococcus, такие как Staphylococcus epidermidis, бактерии Streptococcus, бактерии Listeria, бактерии Bacillus, бактерии Mycobacterium и т.д. Примеры грамотрицательных бактерий включают бактерии Escherichia, такие как Escherichia coli, кишечные бактерии, типичным представителем которых являются бактерии Enterobacter, бактерии Salmonella, бактерии Vibrio, бактерии Pseudomonas и т.п.

В настоящем изобретении «живые бактерии (живая клетка)» относится к клетке, которая может пролиферировать при ее культивировании при, в общем, предпочтительных условиях культивирования, и могут пролиферировать в состоянии, таком, что клетка проявляет метаболическую клеточную активность (состояние живые и культивируемые) в предпочтительных условиях, и клетки в значительной степени не имеют повреждений клеточной стенки. В качестве примеров указанной выше метаболической клеточной активности могут быть указаны АТФ активность, эстеразная активность и т.д.

«Поврежденные бактерии» (поврежденная клетка или живая, но не культивируемая клетка) представляют собой клетку в состоянии, в котором она практически не может пролиферировать даже при культивировании в оптимальных условиях культивирования, поскольку клетка повреждена в связи с искусственным стрессом или природным стрессом и проявляет метаболическую активность на низком уровне по сравнению с живой клеткой, но на значительном уровне по сравнению с мертвой клеткой (поврежденное или живое, но не культивируемое [VNC] состояние). Хотя VNC клетки и поврежденные клетки можно различать в узком смысле на основе типа воздействия, являющегося причиной повреждения, VNC клетки и поврежденные клетки в узком смысле могут быть объединены под названием поврежденные клетки по настоящему изобретению по сравнению с живыми клетками или мертвыми клетками.

Детектирование бактерий, проявляющих состояние поврежденной клетки при использовании термической обработки в мягких условиях или введении антибиотиков, привлекает внимание в особенности в области санитарной инспекции пищевых продуктов и клинических тестов, и настоящее изобретение обеспечивает способ детектирования микроорганизма, который позволяет различать все состояния клеток, включая не только детектирование живых клеток, но и различение живых клеток и мертвых клеток и различение живых клеток и поврежденных клеток.

«Мертвая клетка» представляет собой клетку в состоянии, в котором она не может пролиферировать, не проявляет метаболическую активность (мертвое состояние), даже если ее культивируют при оптимальных условиях культивирования. Более того, она находится в состоянии, в котором хотя структура клеточной стенки поддерживается, но сама клеточная стенка в значительной степени повреждена, и агент, окрашивающий ядра, обладающий слабой проницаемостью, такой как пропидий йодид, может проходить через клеточную стенку.

Единицей числа клеток живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток обычно является число клеток (клетки)/мл. Число живых клеток может быть аппроксимировано числом колоний (КОЕ/мл (образующие колонии единицы/мл)), образованных при культивировании клеток при оптимальных условиях на подходящей среде на чашках Петри. Стандартный образец мертвых клеток может быть получен путем подвергания суспензии живых клеток термообработке, например термообработке в кипящей воде. В указанном случае число мертвых клеток в таком образце может быть примерно описано как КОЕ/мл суспензии живых клеток перед термообработкой. Хотя время термообработки в кипящей воде для получения мертвых клеток изменяется в зависимости от типа микроорганизма, мертвые клетки бактерий, описанные в примерах, могут быть получены, например, термообработкой в течение примерно 12 минут. Поврежденные клетки могут быть получены при помощи термообработки в кипящей воде в течение более короткого времени по сравнению с временем, используемым для получения мертвых клеток. Например, поврежденные клетки бактерий, описанные в примерах, могут быть получены термообработкой в течение примерно 50 секунд. В указанном случае число поврежденных клеток может быть примерно описано как КОЕ/мл суспензии живых клеток перед термообработкой. Дополнительно, стандартный образец поврежденных клеток может быть также получен при помощи обработки антибиотиком. В таком случае число поврежденных клеток может быть примерно оценено по числу колоний (КОЕ/мл), образованных при культивировании клеток при оптимальных условиях на подходящей среде для чашек Петри, путем удаления антибиотика после обработки суспензии живых клеток антибиотиком, измерением коэффициента пропускания видимого света (длина волны: 600 нм), что представляет собой оптическую мутность, и сравнение оптической мутности с оптической мутностью суспензии живых клеток, для которой известна плотность живых клеток.

«Коллоидные частицы белков» представляют коллоидные частицы, содержащиеся в тестируемом образце, включающие белки в качестве составных частей, и неспецифически окрашиваемые агентом, окрашивающим ядра, и пример которых включает мицеллярный казеин.

Здесь и далее способ настоящего изобретения будет объяснен для каждой стадии.

(1) Стадия а)

В этой стадии тестируемый образец обрабатывают ферментом, имеющим активность с точки зрения разрушения клеток, отличающихся от клеток микроорганизма, коллоидных частиц белков или липидов, присутствующих в исследуемом образце.

В общем указано, что для того, чтобы детектировать бактерии FCM, бактерии необходимо подвергать пропусканию через детектор в количестве по крайней мере примерно 100 КОЕ. Однако если живые клетки в тестируемом образце, таком как молоко, детектируют при помощи FCM, большое число контаминантов, таких как соматические клетки, глобулы жира и мицеллярный казеин, не только бактерии, попадают в целевую область (бактериальный целевая область) FSC (прямой рассеянный свет) - SSC (боковой рассеянный свет), и поэтому бактерии могут не детектироваться, даже если через детектор проходит примерно 100 КОЕ бактерий. Исходя из сказанного, предпочтительно удалять или уменьшать число клеток, отличающихся от клеток микроорганизмов, коллоидальные частицы белков, липиды и т.д., существующие в тестируемом образце, путем обработки ферментом.

В том случае, если тестируемый образец представляет собой молоко, молочный продукт или пищевой продукт, полученный при использовании молока или молочного продукта в качестве исходного материала, примеры клеток, отличающиеся от клеток микроорганизмов, присутствующих в тестируемом образце, включают коровьи лейкоциты, эпителиальные клетки молочной железы и т.д. Более того, в том случае, если тестируемый образец представляет собой биологический образец, такой как образец крови, образец мочи, образец спинно-мозговой жидкости, образец синовинальной жидкости и образец плевральной жидкости, то примеры клеток включают эритроциты, лейкоциты (гранулоциты, нейтрофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты и т.д.), тромбоциты и т.д.

Указанный выше фермент не является ограничивающим до той степени, пока фермент может разрушать указанные выше контаминанты и не повреждает живые клетки микроорганизма, которые выбраны в качестве детектируемого объекта, и примеры ферментов включают липолитические ферменты и протеазы. Хотя в качестве фермента может независимо использоваться один тип ферментов или могут использоваться в комбинации два или более типа ферментов, предпочтительно использовать одновременно липолитический фермент и протеазу.

Примеры липолитического фермента включают липазы, протеазы и т.д., и примеры протеазы включают протеиназу К, проназу и т.д.

Хотя условия обработки указанными ферментами специально не ограничены, они могут быть пригодным образом определены, например, для липаз могут быть указаны условия конечной концентрации от 10 до 50 ед./мл, температуры от 25 до 37°С и время обработки 30 минут или более, и для протеиназы К могут быть указаны условия конечной концентрации от 10 до 50 ед./мл, температуры от 25 до 37°С и время обработки 30 минут или более.

Обработку липолитическим ферментом и протеазой предпочтительно проводят в порядке: (i) обработка липолитическим ферментом и (ii) обработка протеазой, или обработка может проводиться одновременным их добавлением. Хотя указанные ферменты можно оставлять в тестируемом образце после обработки, предпочтительно отделять ферменты от клеток при помощи центрифугирования или т.п.

(2) Стадия b)

В этой стадии тестируемый образец обрабатывают ядом топоизомеразы и/или ядом ДНК-гиразы. Стадию b) предпочтительно проводят после стадии а).

Яд топоизомеразы и яд ДНК-гиразы, используемые в настоящем изобретении, относятся к ядам, которые не ингибируют активность топоизмеразы и ДНК-гиразы соответственно в расщеплении ДНК, но ингибируют повторное лигирование ДНК или улучшают обратную скорость расщепления ДНК. Яд топоизомеразы и яд ДНК-гиразы предпочтительно представляют собой яды, которые связываются с хромосомной ДНК микроорганизма при помощи ковалентного присоединения, которые интеркалируют в хромосомную ДНК и связываются с хромосомной ДНК при помощи ковалентного присоединения под действием облучения видимым светом, яды, которые легко интеркалируют в хромосомную ДНК, или яды, которые образуют комплекс топоизомеразы или ДНК-гиразы.

Хотя предпочтительно одновременно использовать яд топоизомеразы и яд ДНК-гиразы, также может быть использован любой из них.

Яд топоизомеразы и яд ДНК-гиразы предпочтительно представляют собой яды, которые обладают различным действием на живые клетки, поврежденные клетки, мертвые клетки, соматические клетки, такие как коровьи лейкоциты, лейкоциты и тромбоциты, и т.д., более конкретно, яды, которые проявляют более высокую проницаемость клеточных стенок поврежденных клеток и мертвых клеток и клеточных мембран соматических клеток, таких как коровьи лейкоциты, лейкоциты и тромбоциты, и т.д., по сравнению с проницаемостью клеточной стенки живых клеток.

Примеры яда топоизомеразы включают амсакрин, камптотецин, доксорубицин, эллиптицин, этопозид, митоксантрон, саинтопин, топотекан, СР-115953 и т.д. Может быть независимо использован один тип яда топоизомеразы или комбинация двух или более типов яда топоизомеразы.

Примеры яда ДНК-гиразы включают ципрофлоксацин, офлоксацин, эноксацин, пефлоксацин, флероксацин, норфлоксацин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, пиромидиновую кислоту и т.д. Может быть независимо использован один тип яда ДНК-гиразы или комбинация двух или более типов яда ДНК-гиразы.

Условия обработки ядом топоизомеразы или ядом ДНК-гиразы могут быть определены подходящим способом. Например, условия, которые делают возможным легкое различение живых клеток от поврежденных клеток и мертвых клеток, могут быть определены путем добавления яда топоизомеразы или яда ДНК-гиразы при различных концентрациях к суспензиям живых клеток, поврежденных клеток или мертвых клеток микроорганизма, представляющего собой объект детектирования, выдерживания их в течение различных периодов времени, затем сбором клеток путем центрифугирования и т.п., окрашивания клеток агентом, окрашивающим ядра, и анализа клеток при использовании FCM. Более того, условия, которые делают возможным легкое различение живых клеток микроорганизма, представляющего собой объект детектирования, от соматических клеток, таких как коровьи лейкоциты, тромбоциты и т.д., могут быть определены путем добавления яда топоизомеразы при различных концентрациях к суспензиям живых клеток и указанных выше различных клеток (живые клетки, содержащие поврежденные клетки), выдерживания их в течение предварительно определенного времени, затем сбором живых клеток и указанных выше различных клеток путем центрифугирования и т.п., окрашивания клеток агентом, окрашивающим ядра, и анализа клеток при использовании FCM. Примеры таких условий включают конкретно для амсакрина конечную концентрацию от 1 до 100 мкг/мл, температуру от 25 до 37°С и время обработки от 5 минут до 48 часов, для эллиптицина конечную концентрацию от 0,05 до 5 мкг/мл, температуру от 25 до 37°С и время обработки от 10 минут до 48 часов, для камптотецина конечную концентрацию от 1 до 100 мкг/мл, температуру от 25 до 37°С и время обработки от 10 минут до 48 часов, для ципрофлоксацина конечную концентрацию от 0,4 до 40 мкг/мл, температуру от 25 до 37°С и время обработки от 10 минут до 48 часов, для этопозида конечную концентрацию от 1 до 100 мкг/мл, температуру от 25 до 37°С и время обработки от 5 минут до 48 часов, для митоксантрона конечную концентрацию от 0,1 до 10 мкг/мл, температуру от 25 до 37°С и время обработки от 10 минут до 48 часов. После того как тестируемый образец обрабатывают при предварительно определенных условиях, обработку предпочтительно останавливают путем удаления, разбавлением и/или разделением центрифугированием и т.п.

Указанные выше яд топоизомеразы и яд ДНК-гиразы скорее проникают через клеточные стенки поврежденных клеток и мертвых клеток по сравнению с клеточными стенками живых клеток. Таким образом, считается, что если время обработки находится в пределах диапазонов, указанных выше, то яды в значительной степени не проникают через клеточные стенки живых клеток, но они проникают в поврежденные клетки, мертвые клетки и живые соматические клетки, включая поврежденные клетки, поскольку они имеют только клеточные мембраны и не имеют клеточных стенок. Установлено, что яд топоизомеразы или яд ДНК-гиразы проникает в соматические клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки, затем хаотично связывается с хромосомной ДНК за счет ковалентного присоединения, интеркалирует в ДНК или образует комплекс с топоизомеразой и дополнительно ингибирует повторное лигирование ДНК топоизомеразой II или топоизомеразой I в соматических клетках или топоизомеразой IV, или топоизомеразами I, III, или ДНК-гиразой в поврежденных клетках, или повышает обратную скорость расщепления ДНК, вызывая фрагментацию хромосомной ДНК.

Полагают, что если хромосомная ДНК поврежденной клетки предпочтительно фрагментируется по сравнению с хромосомной ДНК живых клеток при окрашивании агентом, окрашивающим ядра, который проникает через клеточные стенки живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток, таким как SYTO9, интенсивность окрашивания поврежденных клеток уменьшается по сравнению с интенсивностью окрашивания живых клеток, и в результате становится возможным различать живые клетки и поврежденные клетки при детектировании при использовании FCM.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения яд топоизомеразы представляет собой этидий моноазид, и способ включает стадию подвергания тестируемого образца, к которому добавляют этидий моноазид, облучению видимым светом. Этидий моноазид (ЕМА) более легко проникает через клеточные стенки поврежденных клеток по сравнению с клеточными стенками живых клеток микроорганизмов. Исходя из этого, полагается, что ЕМА в значительной степени не проникает в клеточные стенки живых клеток, но ЕМА проникает в клеточные стенки поврежденных клеток и через клеточные мембраны живых соматических клеток, включая поврежденные клетки, поскольку клеточные мембраны соматических клеток не представляют собой клеточных стенок. В том случае, когда лейкоциты и тромбоциты в крови представляют собой живые клетки, ЕМА более легко проникает через клеточные мембраны клеток в стерилизованной воде или гипотоническом солевом растворе. ЕМА проникает в соматические клетки и поврежденные клетки и хаотично интеркалирует в хромосомную ДНК, и затем только интеркалированный ЕМА превращается в нитрен под действием облучения видимым светом и связывается с хромосомной ДНК за счет ковалентного присоединения. Установлено, что затем он ингибирует повторное лигирование ДНК топоизомеразой II в соматических клетках, топоизомеразой IV в поврежденных клетках или ДНК-гиразой, вызывая фрагментацию хромосомной ДНК.

Условия обработки ЕМА могут быть определены подходящим образом. Например, условия, которые делают возможным легкое различение живых клеток от поврежденных клеток, могут быть определены путем добавления ЕМА при различных концентрациях к суспензиям живых клеток и поврежденных клеток микроорганизма, представляющего собой объект детектирования, выдерживанием их в течение различных периодов времени, затем облучением их видимым светом, сбором клеток при помощи центрифугирования и т.д. в соответствии с требованием, окрашиванием клеток агентом, окрашивающим ядра, и анализом клеток при использовании FCM.

Предпочтительные условия для облучения видимым светом также могут быть определены подходящим образом, путем проведения такого эксперимента, как указано выше, при использовании различного времени облучения. Конкретно, обработку ЕМА предпочтительно проводят при конечной концентрации от 0,5 до 100 мкг/мл, при температуре от 4 до 10°С в течение времени от 5 минут до 48 часов. Более того, обработку ЕМА предпочтительно проводят при экранировании света. В качестве видимого света предпочтительным является видимый свет, содержащий компоненты от 500 до 700 нм. Конкретные примеры условий облучения видимым светом включают облучение видимым светом от 100 до 750 Вт в течение от 5 минут до 2 часов на расстоянии от 10 до 50 см до тестируемого образца. Облучение видимым светом предпочтительно проводят при низкой температуре, например при охлаждении образца льдом.

(3) Стадия с)

В этой стадии тестируемый образец, обработанный в стадиях а) и b), обрабатывают агентом, окрашивающим ядра. Агент, окрашивающий ядра, содержит по крайней мере первый окрашивающий агент, который может проникать через клеточные стенки живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток. Выражение «окрашивающий агент может проникать через клеточные стенки живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток» относится одновременно к тому случаю, когда проницаемость агента в отношении клеточных стенок живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток представляет собой в значительной степени одинаковую, и к случаю, когда если даже проницаемость различна, то различия в проницаемости агента в отношении клеточных стенок живых клеток и мертвых клеток представляют собой меньшие по сравнению со вторым окрашивающим агентом, описанным ниже. Конкретные примеры первого окрашивающего агента включают, например, SYTO9.

Более того, агент, окрашивающий ядра, предпочтительно содержит второй окрашивающий агент, который в большей степени проникает через клеточные стенки мертвых клеток по сравнению с клеточными стенками живых клеток и поврежденных клеток по сравнению с первым агентом. Другими словами, первый окрашивающий агент представляет собой окрашивающий агент, который может окрашивать живые клетки и мертвые клетки в различные цвета. Примеры второго окрашивающего агента включают пропидий йодид (PI). Если указанные агенты, окрашивающие ядра, проникают в клетки, то они интеркалируют в хромосомную ДНК, и возбуждаются под действием облучения лазерными лучами с испусканием флуоресценции. Например, если SYTO9 и PI, интеркалированные в ДНК, облучают лазерным лучом с λ488 нм, то они переходят в возбужденное состояние и SYTO9 и PI испускают соответственно зеленую флуоресценцию с центральной длиной волны λ518 нм и красную флуоресценцию с центральной длиной волны λ617 нм.

При окрашивании окрашивающим агентом, если существует явное различие между живыми клетками и мертвыми клетками, и соматическими клетками, отличными от микроорганизма, присутствующего в исследуемом образце, то живые клетки можно отличать до некоторой степени при использовании подобного окрашивающего агента. Однако даже окрашивающий агент, который может проникать в физически поврежденные мертвые клетки, может не проникать в слабо поврежденные клетки и, таким образом, проявляет незначительное различие в окрашивании по сравнению с живыми клетками. В таком случае трудно четко различить живые клетки и поврежденные клетки исключительно при использовании второго окрашивающего агента.

Однако хромосомные ДНК поврежденных клеток фрагментируются при обработке на указанной выше стадии b) и, таким образом, становятся в меньшей степени окрашиваемыми окрашивающим агентом, и, таким образом, становится возможным отличить живые клетки от поврежденных и т.д. путем окрашивания первым окрашивающим агентом. Более того, при использовании второго окрашивающего агента становится возможным двухмерное детектирование клеток при использовании FCM. Исходя из этого, в настоящем изобретении, хотя живые клетки могут быть детектированы исключительно окрашиванием первым окрашивающим агентом, использование второго окрашивающего агента делает возможным различение живых клеток и мертвых клеток для повышения точности детектирования, и, таким образом, предпочтительно использовать как первый окрашивающий агент, так и второй окрашивающий агент.

Окрашивание первым окрашивающим агентом и вторым окрашивающим агентом может проводиться как одновременным использованием агентов, так и раздельным их использованием.

Условия окрашивания агентами для окрашивания не являются особенным образом ограниченными, и можно использовать условия, обычно используемые, для окрашивания хромосомных ДНК микроорганизмов. Конкретно, предпочтительно добавлять окрашивающий агент к суспензии клеток в конечной концентрации от 4,0 до 6,0 мкМ в случае SYTO9 или от 25,0 до 35,0 мкМ в случае PI и проводить реакцию при от 15 до 25°С в течение от 10 до 20 минут.

(4) Стадия d)

В этой стадии микроорганизм в тестируемом образце, обработанный агентом, окрашивающим ядра, в указанной выше стадии с) детектируют при использовании FCM. Принципы детектирования микроорганизма при использовании FCM представляют собой такие, как изложено ниже.

Если частицы, такие как микроорганизмы, расположены в линию и их последовательно облучают лучом аргонового лазера (λ488 нм), то свет рассеивается в малом диапазоне угла от 1,5 до 19° по отношению к оси луча лазера. Этот рассеянный свет называют прямым рассеянным светом (FSC), и степень рассеяния в значительной степени пропорциональна размеру частиц. Свет, одновременно рассеиваемый при угле примерно 90° по отношению к лучу лазера, называют боковым рассеянным светом (SSC), и считается, что он отражает сложность внутренней структуры частиц, включая структуру ДНК. Таким образом, если FSC-SSC график получают в виде x-y графика, то горизонтальная ось представляет собой размер частиц, и вертикальная ось представляет сложность внутренней структуры частиц.

Если бактерии окрашены указанными выше первым агентом, окрашивающим ядра, и вторым агентом, окрашивающим ядра, и облучены лучом лазера, то точки на графике для индивидуальных клеток расположены в определенной конкретной области FSC-SSC графика. Путем окружения конкретной области с четырех сторон (целевая область) при использовании программного обеспечения FCM анализа (например, Cell Quest Ver. 3.1, Becton Dickinson, Sydney, Australia), селективно выбирая только частицы бактериальной области и уделяя внимание только выбранным частицам, могут быть получены графики точек живых клеток и мертвых клеток (относится к фиг. 1-8).

FCM измерения предпочтительно проводят при следующих условиях. Они состоят в предпочтительном применении 15 мВт луча аргонового лазера (длина волны λ=488 нм) для возбуждающего света и измерении прямого рассеянного света (FSC, <15°), бокового рассеянного света (> 15°) и трех типов флуоресцентных сигналов от FL1 до 3 соответственно. Для измерения флуоресцентных сигналов от FL1 до 3 предпочтительно используют фильтр с полосой пропускания от 515 до 545 нм, в особенности 530 нм, для зеленой флуоресценции (FL1), предпочтительно используют фильтр с полосой пропускания от 564 до 606 нм, в особенности 585 нм, для желто-оранжевой флуоресценции (FL2), предпочтительно используют длинноволновый фильтр с полосой пропускания от 655 до 800 нм, в особенности 670 нм, для красной флуоресценции (FL3).

Более того, измерения предпочтительно проводят при следующих установках детекторов FSC: Е02, SSC: 376, FL1: 709, FL2: 736 и FL3: 811 (все представлено при использовании логарифмического коэффициента усиления), установки для % компенсации FL1-FL2: 0,0, FL2-FL1: 0,0, FL2-FL3: 0,0 и FL3-FL2: 0,0, сигнал FSC 150% порог (граничная величина), скорость загрузки суспензии с низкой скоростью потока для FCM теста: 12 мкл/мин, число клеток, попавших в целевую область на FSC-SSC графике (число частиц), 5000000 и время измерения 30 секунд.

Например, при предпочтительных условиях живые клетки и поврежденные клетки попадают на график в SYTO9 положительной и PI отрицательной области (SYTO9(+)·PI(-)), и мертвые клетки в основном попадают на график в SYTO9 положительной и PI положительной области (SYTO9(+)·PI(+)) на SYTO9/PI графике. Граница отрицательных и положительных значений для SYTO9 и граница отрицательных и положительных значений для PI представлена интенсивностью флуоресценции 10³ в случае SYTO9 и интенсивностью флуоресценции 2×10² в случае PI. Установки целевой области предпочтительно представляют собой для FSC от 10² до 2×10³ и SSC от 10 до 2×10².

Анализ при использовании FCM можно проводить при помощи коммерчески доступных FCM приборов. Условия для FCM не являются особенным образом ограниченными, и условия, обычно применяемые для детектирования и разделения микроорганизмов, представляют собой такие, чтобы настоящее изобретение могло применяться применительно к бактериям.

В настоящем изобретении «детектирование живых клеток» включает как определение присутствия или отсутствия живых клеток в тестируемом образце, так и определение количества живых клеток в тестируемом образце. Более того, «детектирование живых клеток» включает различение живых клеток и поврежденных и/или мертвых клеток и определение наличия или отсутствия каждых из живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток. Количество живых клеток не ограничивается абсолютным количеством и может представлять собой относительное количество по отношению к количеству в контрольном образце.

<3> Наборы по настоящему изобретению

Первый набор по настоящему изобретению представляет собой набор для получения указанного выше первого образца для FCM измерения, включающий фермент, выбранный из липолитических ферментов и протеаз в качестве элемента, представляющего собой фермент, яд топоизомеразы и/или яд ДНК-гиразы и агент, окрашивающий ядра.

Второй набор по настоящему изобретению представляет собой набор для получения указанного выше второго образца для FCM измерения, включающий фермент, выбранный из липолитических ферментов и протеаз в качестве элемента, представляющего собой фермент, этидий моноазид и агент, окрашивающий ядра.

В указанных выше наборах фермент выбирают из липолитических ферментов и протеаз, яд топоизомеразы и/или яд ДНК-гиразы и агент, окрашивающий ядра, представляют собой такие же, как указано выше для способов настоящего изобретения.

Наборы по настоящему изобретению дополнительно к указанным выше элементам могут также включать разбавитель, инструкцию, описывающую способ настоящего изобретения, и т.д.

ПРИМЕРЫ

Здесь далее настоящее изобретение будет более конкретно объяснено по отношению к следующим примерам. Однако настоящее изобретение не ограничивается следующими примерами.

Тестируемые образцы

В последующих примерах и контрольных примерах эксперименты проводили с использованием тестируемых образцов, полученных путем подвергания образцов следующим типам обработки при использовании Escherichia coli DH5α (далее здесь обозначаемая как «Escherichia coli») и Staphylococcus epidermidis штамм KD (далее здесь обозначаемый как «Staphylococcus epidermidis»).

(1) Живые клетки и поврежденные клетки в суспензии в физиологическом солевом растворе детектировали при использовании проточного цитометра (обозначены как «необработанная группа»).

(2) Суспензию живых клеток и поврежденных клеток в физиологическом солевом растворе обрабатывали липазой и протеиназой К, и затем клетки детектировали при использовании проточного цитометра (обозначена как «LP-обработанная группа»). Результаты указанных выше образцов (1) и (2) показаны в контрольном примере 1.

(3) Живые клетки и поврежденные клетки суспендировали в коровьем молоке, подвергнутом пастеризации при ультравысокой температуре (130°С, 2 секунды, обозначаемое как «UHT»), и коровьем молоке, подвергнутом пастеризации при низкой температуре в течение длительного времени (63°С, 30 минут, обозначаемое как «LTLT»), и суспензии обрабатывали липазой и протеиназой К. Клетки в суспензиях детектировали при использовании проточного цитометра (обозначены как «M-LP-обработанная группа»). Более того, клетки в коровьем молоке, обработанные липазой и протеиназой К, детектировали при использовании проточного цитометра. Результаты показаны в контрольных примерах 2 и 3.

(4) Указанный выше образец (2) дополнительно подвергали обработке этидий моноазидом (EMA), и клетки в образце детектировали при использовании проточного цитометра (обозначена как «LPE-обработанная группа»). Результаты показаны в примере 1.

(5) Указанный выше образец (3) дополнительно подвергали обработке EMA, и клетки в образце детектировали при использовании проточного цитометра (обозначена как «М-LPE-обработанная группа»). Результаты показаны в примерах 2 и 3.

(6) Образец получали сходным образом с указанным выше (5) с обеспечением того, что ЕМА-обработку заменяли обработкой ядом топоизомеразы или обработкой ядом ДНК-гиразы (обозначена как «М-LPD-обработанная группа»). Результаты показаны в примере 4.

Контрольный пример 1

Детектирование живых клеток и поврежденных клеток Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis, суспендированных в физиологическом солевом растворе (LP-обработанные или необработанные), при использовании проточного цитометра.

(1) Получение образцов

Получение суспензий живых клеток и поврежденных клеток

1-1-1. Суспензии Escherichia coli

Escherichia coli DH5α инокулировали в питательную среду L и культивировали при 10°С в течение 12 часов, в качестве стационарной культуры, и затем культуру подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 3000×g в течение 10 минут для сбора клеток. Собранные клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе (Otsuka Pharmaceutical, сходный раствор применяли в последующих описаниях) и суспензию вновь центрифугировали для сбора клеток. Сходную процедуру повторяли еще раз для промывания клеток.

Промытые клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе, суспензию подходящим образом разбавляли, 0,1 мл суспензии помещали на агаровую среду L и культивировали для измерения числа живых клеток. Указанную выше суспензию клеток доводили до конечной концентрации 4×10⁶ КОЕ/мл для получения суспензии живых клеток.

Суспензию живых клеток объемом 1 мл помещали в микропробирку объемом 2 мл и погружали в кипящую воду при 100°С на 50 секунд для получения суспензии поврежденных клеток. Отдельно получали другую суспензию поврежденных клеток и объем 0,1 мл помещали на L агаровую среду, для того чтобы подтвердить, что клетки не образуют колоний.

1-1-2. Суспензии Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis штамм KD инокулировали в питательной среде L и культивировали при 37°С в течение 18 часов, в качестве стационарной культуры, и затем культуру подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 3000×g в течение 10 минут для сбора клеток. Собранные клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе (Otsuka Pharmaceutical) и суспензию вновь центрифугировали для сбора клеток. Сходную процедуру повторяли еще раз для промывания клеток. Промытые клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе, суспензию подходящим образом разбавляли, 0,1 мл суспензии помещали на агаровую среду L и клетки культивировали для измерения числа живых клеток. Указанную выше суспензию клеток доводили до конечной концентрации 4×10⁷ КОЕ/мл для получения суспензии живых клеток.

Суспензию живых клеток объемом 1 мл помещали в микропробирку объемом 2 мл и микропробирку погружали в кипящую воду при 100°С на 50 секунд для получения суспензии поврежденных клеток. Отдельно получали другую суспензию поврежденных клеток и объем 0,1 мл помещали на агаровую среду L, для того чтобы подтвердить, что клетки не образуют колоний.

1-2. Обработка суспензий живых клеток и поврежденных клеток липазой и протеиназой К.

Каждую из суспензий Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки) и суспензий Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки), полученных в указанных выше 1-1-1 и 1-1-2, в объеме 1 мл помещали в микропробирку объемом 2 мл. К суспензиям добавляли 100 мкл липазы (E.C. 3.1.1.3, Sigma), доведенной физиологическим солевым раствором до 189 ед./мл, и суспензию инкубировали при 37°С в течение 30 минут для проведения обработки липазой.

К каждой суспензии клеток, подвергнутой обработке липазой, добавляли раствор 25 мкл 1250 ед./мл протеиназы К (E.C. 3.4.21.64, Sigma) и смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут для осуществления обработки протеиназой К.

После обработки липазой и обработки протеиназой К (здесь далее обозначается как «LP обработка») клетки собирали центрифугированием при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут и собранные клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе для получения LP-обработанной группы суспензии Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки) и LP-обработанной группы суспензии Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки) соответственно.

Дополнительно, в указанном выше способе добавляли 100 мкл физиологического солевого раствора вместо липазы и 20 мкл физиологического солевого раствора вместо протеиназы К и обрабатывали таким же образом для получения необработанной группы суспензии Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки) и необработанной группы суспензии Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки) соответственно.

(2) Способ FCM теста

К каждой LP-обработанной группе суспензии Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки), LP-обработанной группе суспензии Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки), необработанной группе суспензии Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки) и необработанной группе суспензии Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки) в объеме 300 мкл добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего агента (LIVE/DEAD BacLight^TM Bacterial Viability kit, Molecular Probes, SYTO9/PI=1/1 смесь) и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения каждого образца. Для указанных образцов проводили измерения при использовании FCM измерительной аппаратуры FACS Calibur (Becton Dickinson).

FCM измерения проводили следующим образом. В качестве возбуждающего света использовали 15 мВт луч аргонового лазера (длина волны λ=488 нм) и использовали продукт от Becton Dickinson в качестве защитного раствора для загрузки образца жидкости FCM. Дополнительно измеряли прямой рассеянный свет (FSC, <15°), боковой рассеянный свет (> 15°) и три типа флуоресцентных сигналов от FL1 до 3 соответственно. Для измерения флуоресцентных сигналов от FL1 до 3 использовали фильтр с полосой пропускания 530 нм (от 515 до 545 нм) для зеленой флуоресценции (FL1), использовали фильтр с полосой пропускания 585 нм (от 564 до 606 нм) для желто-оранжевой флуоресценции (FL2) и использовали длинноволновый фильтр с полосой пропускания 670 нм (от 655 до 800 нм) для красной флуоресценции (FL3).

Для проведения измерений использовали установки детекторов FSC: Е02, SSC: 376, FL1: 709, FL2: 736 и FL3: 811 (все представлено при использовании логарифмического коэффициента усиления), установки для % компенсации FL1-FL2: 0,0, FL2-FL1: 0,0, FL2-FL3: 0,0 и FL3-FL2: 0,0, сигнал FSC 150% порог (граничная величина), скорость загрузки суспензии для FCM теста устанавливали при 12 мкл/мин, число клеток, попавших в целевую область на FSC-SSC графике (число частиц), устанавливали при 5000000, и время измерения составляло 30 секунд.

(3) Результаты теста

Результаты данного теста показаны на фиг. 1.

SYTO9 демонстрирует высокую проницаемость клеточных стенок и проникает через клеточные стенки живых клеток и мертвых клеток, тогда как PI проявляет низкую проницаемость клеточных стенок и проникает только через клеточные стенки физически поврежденных мертвых клеток. Исходя из этого, изначально результаты для живых клеток должны попадать на графике в область SYTO9(+)·PI(-), результаты для мертвых клеток должны попадать на графике в область SYTO9(+)·PI(+) на графике SYTO9/PI. В действительности, при сравнении результатов для необработанной группы суспензии Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки) и необработанной группы суспензии Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки), PI не проникал не только в живые клетки, но также и в поврежденные клетки, и живые клетки и поврежденные клетки нельзя было четко различить. Поэтому оценено, что степень повреждения клеточных стенок бактерий после погружения в кипящую воду при 100°С на 50 секунд, что является сходными условиями с пастеризацией при ультравысокой температуре (промышленное коровье молоко), не является значительной. Более того, наблюдалось незначительное различие в интенсивности флуоресценции при окрашивании SYTO9 между живыми клетками и поврежденными клетками и оценено, что это различие было вызвано тем, что хромосомная ДНК поврежденных клеток частично разрушается при нагревании, и, таким образом, эффективность интеркаляции SYTO9 в хромосомную ДНК понижается.

Даже если была проведена LP обработка, живые клетки и поврежденные клетки не могут быть легко различимы в случае, в частности, Escherichia coli. Если сравнивают результаты необработанных групп суспензий Escherichia coli (живые клетки) и LP-обработанных групп суспензий Escherichia coli (живые клетки), то можно видеть, что часть точек, попавших в область SYTO9(+)·PI(-), сдвинулись в область SYTO9(-)·PI(-) на графике живых Escherichia coli, и эффективность детектирования живых клеток уменьшается, поскольку была проведена LP обработка. Указанный феномен представляет собой еще более выраженный в случае Staphylococcus epidermidis. Однако если живые клетки и поврежденные клетки раздельно детектировали из коровьего молока при использовании FCM, то контаминанты, т.е. соматические клетки, такие как коровьи лейкоциты и эпителиальные клетки молочной железы, мицеллярный казеин и липиды, должны быть удалены, и, таким образом, считается, что LP обработка неизбежна.

Контрольный пример 2

Детектирование живых клеток Escherichia coli (LP-обработанные), суспендированных в гомогенизированном молоке, подвергнутом пастеризации при ультравысокой температуре, при использовании проточного цитометра

(1) Получение образцов

К 1 мл 1,1×10⁷ КОЕ/мл суспензии Escherichia coli (живые клетки), полученной таким же способом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл коммерчески доступного гомогенизированного коровьего молока (подвергнутого пастеризации при ультравысокой температуре (130°С, 2 секунды), здесь также называемого «UHT гомогенизированное молоко») для 10-кратного разбавления суспензии, и разбавленную суспензию последовательно разбавляли таким же образом с получением UHT гомогенизированного молока, инокулированного от 1,1×10² до 1,1×10⁶ КОЕ/мл Escherichia coli (живые клетки). Было показано, что упомянутое выше UHT гомогенизированное молоко не образует колонии при инкубировании при 37°С в течение 48 часов и при 25°С в течение 72 часов при использовании агаровой среды.

Затем, UHT гомогенизированное молоко, в различной степени разбавления инокулированное Escherichia coli (живые клетки), и UHT гомогенизированное молоко, не инокулированное Escherichia coli, подвергали такой же процедуре обработки липазой и протеиназой К (LP обработка), как и в контрольном примере 1. Процедура состоит в том, что каждую из проб UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки), и UHT гомогенизированного молока, не инокулированного Escherichia coli, в объеме 1 мл помещали в микропробирку 2 мл. К образцу добавляли 100 мкл липазы (E.C. 3.1.1.3, Sigma), доведенной физиологическим солевым раствором до 189 ед./мл, и суспензию инкубировали при 37°С в течение 30 минут для проведения обработки липазой.

К каждому образцу, подвергнутому обработке липазой, добавляли раствор 20 мкл 1250 ед./мл протеиназы К (E.C. 3.4.21.64, Sigma) и смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут для осуществления обработки протеиназой К.

После обработки липазой и обработки протеиназой К к каждому образцу добавляли 880 мкл физиологического солевого раствора и образец подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. Липидный слой, существующий в верхнем слое, полностью удаляли тампоном и водный слой, существующий в средней части, также удаляли. К оставшемуся нижнему слою добавляли 2 мл физиологического солевого раствора, смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут для промывки, собирали осадок после центрифугирования и к осадку после центрифугирования добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора.

(2) Способ теста

К каждому образцу LP-обработанного UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки), и LP-обработанного UHT гомогенизированного молока, приготовленного выше и переведенного в объем 300 мкл, добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию оставляли протекать при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения каждого образца. Для указанных образцов проводили измерения при использовании FCM измерительной аппаратуры FACS Calibur (Becton Dickinson). Условия измерения были такими же, как и в контрольном примере 1, за тем исключением, что время измерения составило 5 минут.

(3) Результаты теста

Результаты данного теста показаны на фиг. 2.

Хотя число точек на графике в SYTO9(+)·PI(-) области изменяется в зависимости от инокулированной концентрации Escherichia coli (живые клетки), в данной области присутствует множество точек на графике, даже в случае если LP-обработанное UHT гомогенизированное молоко не инокулировано Escherichia coli (живые клетки), и отличие от Escherichia coli (живые клетки) было затруднительным. Предполагалось, что указанные контаминанты состоят из соматических клеток и клеток, изначально присутствующих в коровьем молоке и поврежденных нагреванием. Предполагалось, что, однако, поскольку клеточные мембраны соматических клеток и клеточные стенки клеток, изначально присутствующих в молоке, в значительной степени не повреждены стерилизацией при ультравысокой температуре, SYTO9 проникает в клетки, но PI не будет в них проникать. В качестве сравнения результаты, полученные путем вычитания числа точек на графике в SYTO9(+)·PI(-) области для LP-обработанного UHT гомогенизированного молока, не инокулированного Escherichia coli (живые клетки), из каждого числа точек на графике в той же области для LP-обработанного UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки), показаны в таблице 1. Согласно результатам, считается, что предел детектирования Escherichia coli (живые клетки) составляет 1,1×10⁴ КОЕ/мл при условиях указанного теста.

Контрольный пример 3

Детектирование живых клеток и поврежденных клеток Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis (LP-обработанные), суспендированных в негомогенизированном молоке, подвергнутом длительному времени пастеризации при низкой температуре (LTLT), при использовании проточного цитометра

(1) Получение образцов

К 1 мл каждой из 1,5×10⁷ КОЕ/мл суспензий Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки), полученных таким же способом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл коммерчески доступного не подвергавшегося гомогенизации коровьего молока (негомогенизированное коровье молоко, подвергнутое длительному времени пастеризации при низкой температуре (63°С, 30 минут), здесь также называемое «LTLT негомогенизированное молоко») для 10-кратного разбавления суспензий, и разбавленную суспензию последовательно разбавляли таким же образом с получением LTLT негомогенизированного молока, инокулированного от 1,5×10² до 1,5×10⁶ КОЕ/мл Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки). Было показано, что упомянутое выше LTLT негомогенизированное молоко не образует колонии при инкубировании при 37°С в течение 48 часов и при 25°С в течение 72 часов при использовании агаровой среды.

Дополнительно к 1 мл каждой из 1,8×10⁸ КОЕ/мл суспензий Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки), полученных таким же способом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл не подвергавшегося гомогенизации LTLT коровьего молока для 10-кратного разбавления суспензий, и разбавленные суспензии последовательно разбавляли таким же образом с получением LTLT негомогенизированного молока, инокулированного от 1,8×10² до 1,8×10⁷ КОЕ/мл Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки).

Затем LTLT негомогенизированное молоко, инокулированное Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки) с различной степенью разбавления, LTLT негомогенизированное молоко, инокулированное Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки) с различной степенью разбавления, и LTLT негомогенизированное молоко, не инокулированное бактериями, подвергали той же обработке липазой и протеиназой К (LP обработка), как и в контрольном примере 1. Процедура состоит в том, что каждую из проб LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки), LTLT негомогенизированного молока с Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки) и LTLT негомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, в объеме 1 мл помещали в микропробирку объемом 2 мл. К образцу добавляли 100 мкл липазы (E.C. 3.1.1.3, Sigma), доведенной физиологическим солевым раствором до 189 ед./мл, и образец инкубировали при 37°С в течение 30 минут для проведения обработки липазой.

К каждому образцу, подвергнутому обработке липазой, добавляли раствор 20 мкл 1250 ед./мл протеиназы К (E.C. 3.4.21.64, Sigma) и образец инкубировали при 37°С в течение 30 минут для осуществления обработки протеиназой К.

После обработки липазой и обработки протеиназой К к каждому образцу добавляли 880 мкл физиологического солевого раствора и образец подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. Липидный слой, существующий в верхнем слое, полностью удаляли тампоном и водный слой, существующий в средней части, также удаляли. К оставшемуся нижнему слою добавляли 2 мл физиологического солевого раствора, смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут для промывки, собирали осадок после центрифугирования и к осадку после центрифугирования добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора.

(2) Способ теста

К каждому образцу LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки), LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки), и LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, приготовленному выше и переведенному в объем 300 мкл, добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию оставляли протекать при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения каждого образца. Для указанных образцов проводили измерения при использовании FCM измерительной аппаратуры FACS Calibur (Becton Dickinson). Условия измерения были такими же, как и в контрольном примере 1, за тем исключением, что время измерения составило 5 минут.

(3) Результаты теста

Результаты данного теста показаны на фиг. 3.

В SYTO9(+)·PI(-) области наблюдается множество точек на графике для LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, и они ухудшают пределы детектирования Escherichia coli (живые клетки) и Staphylococcus epidermidis (живые клетки). Точки на графике для Escherichia coli (поврежденные клетки) и Staphylococcus epidermidis (поврежденные клетки) были скрыты точками на графике, возникающими из-за LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, не инокулированного бактериями.

Поскольку LTLT негомогенизированное молоко изначально содержало поврежденные клетки и мертвые клетки в концентрации от 10³ до 10⁵ КОЕ/мл, высока вероятность того, что точки на графике поврежденных клеток, вновь инокулированных в контрольном примере 3, будут замаскированы точками изначально содержащихся клеток. Дополнительно, с точки зрения расположения точек на графике для LP-обработанных суспензий Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis (поврежденные клетки), которые видны из результатов контрольного примера 1, показанных на фиг. 1, предполагается, что с большой вероятностью точки на графике вновь инокулированных поврежденных клеток будут скрыты точками на графике, возникающими из-за LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока.

Число точек на графике в области графика SYTO9(+)·PI(-), удовлетворяющих условию, что интенсивность ≥7×10³, показаны в таблице 2 для LP-обработанного LTLT

негомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки), и LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока. Полагается, что при условиях настоящего теста предел детектирования способа LP-обработки для Escherichia coli (живые клетки) в LP-обработанном LTLT негомогенизированном молоке составляет 1,5×10⁵ КОЕ/мл.

Дополнительно, число точек на графике в области графика SYTO9(+)·PI(-), удовлетворяющих условию, что интенсивность ≥7×10³, показаны в таблице 3 для LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые клетки), и LP-обработанного LTLT негомогенизированного молока. Полагается, что при условиях настоящего теста предел детектирования способа LP-обработки для Staphylococcus epidermidis (живые клетки) в LP-обработанном LTLT негомогенизированном молоке составляет 1,8×10⁶ КОЕ/мл.

Пример 1

Детектирование в обработанных этидий моноазидом (ЕМА) суспензии Escherichia coli и суспензии Staphylococcus epidermidis (LP-обработанные) при использовании проточного цитометра

(1) Получение образцов

Каждую из суспензий Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки, 4×10⁶ КОЕ/мл) и суспензий Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки, 4×10⁷ КОЕ/мл), полученных таким же способом, как и в контрольном примере 1, в объеме 1 мл помещали в микропробирки объемом 2 мл и затем подвергали обработке липазой и обработке протеиназой К (LP обработка) таким же способом, как и в контрольном примере 1, и затем подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. После того как удаляли верхний водный слой, к клеткам нижнего слоя (осадок) добавляли 1 мл физиологического солевого раствора для суспендирования клеток.

Этидий моноазид (здесь далее также обозначаемый аббревиатурой «ЕМА», Sigma, номер в каталоге: E2028) растворяли в стерилизованной воде при концентрации 1000 мкг/мл и фильтровали через 0,45-мкм микрофильтр. Указанный водный раствор ЕМА в объеме 10 мкл добавляли к указанной выше LP-обработанной суспензии клеток и суспензию оставляли при 4°С в течение 30 минут при экранировании света. Затем суспензию помещали на лед и облучали видимым светом от лампы 500 Вт (FLOOD PRF, 100 В, 500 Вт, Iwasaki Electric Co., Ltd.), расположенной на расстояния 20 см от суспензии, в течение 10 минут. Указанную процедуру добавления раствора ЕМА и облучения видимым светом также обозначают как «ЕМА обработка». Затем к суспензии добавляли 990 мкл физиологического солевого раствора и суспензию подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. После того как верхний водный слой удаляли, к осадку после центрифугирования нижнего слоя добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора, затем к смеси добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию проводили в течение 15 минут при комнатной температуре при экранировании света для получения каждого образца.

(2) Способ теста

FCM измерения проводили для каждого из полученных выше образцов (время измерения: 30 секунд) таким же образом, как и в контрольном примере 1.

(3) Результаты теста

Результаты данного теста показаны на фиг. 4.

Как показано на фиг. 1, ссылка на которую приведена выше, живые клетки и поврежденные клетки Escherichia coli не могут быть четко различены, если проводится только LT-обработка. Однако, как ясно видно из результатов данного теста, если после LP обработки проводят ЕМА обработку, то становится возможным четко различать живые клетки и поврежденные клетки Escherichia coli. Дополнительно, такие же результаты были также получены для Staphylococcus epidermidis. Предполагается, что полученный результат был обусловлен тем, что ЕМА, обладающий низкой проницаемостью клеточных стенок, не проникает через клеточные стенки живых клеток, но проникает через клеточные стенки поврежденных клеток, в которых повреждение не слишком значительно.

ЕМА, проникающий в поврежденные клетки, беспорядочно интеркалирует в хромосомную ДНК в клетках поврежденных бактерий, затем превращается в нитрен под действием облучения видимым светом и связывается с хромосомной ДНК при помощи ковалентного связывания. Поскольку активность ДНК-гиразы или топоизомеразы сохраняется в клетках после короткого времени пастеризации, наблюдается расплетание цепей ДНК для транскрипции генов в ходе метаболизма и, таким образом, происходит расщепление и повторное лигирование хромосомной ДНК. В то же время повторное лигирование ДНК под действием указанных выше ферментов ингибируется в результате ковалентного присоединения нитрена, полученного из ЕМА, и в результате усиливается фрагментация хромосомной ДНК. Если дают возможность SYTO9 действовать на поврежденные клетки, содержащие фрагментированную хромосомную ДНК, то интенсивность его флуоресценции значительно уменьшается по сравнению с интенсивностью, наблюдаемой перед ЕМА обработкой. Считается, что это обусловлено тем, что фрагментация ДНК уменьшает эффективность интеркаляции SYTO9 в ДНК. Тем не менее, поскольку ЕМА не может проникать через клеточные стенки живых клеток, на хромосомную ДНК живых клеток воздействие не оказывается. Таким образом, полагается, что даже если проводят ЕМА обработку, живые клетки не проявляют изменений интенсивности флуоресценции за счет SYTO9.

Пример 2

Детектирование живых клеток Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis (LP-обработанные), суспендированных в UHT гомогенизированном молоке, обработанных этидий моноазидом (ЕМА), при использовании проточного цитометра

(1) Получение образцов

К 1 мл 6×10⁷ КОЕ/мл суспензии Escherichia coli (живые клетки), полученной таким же способом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл UHT гомогенизированного молока, использованного в контрольном примере 2, для 10-кратного разбавления суспензии, и разбавленную суспензию последовательно разбавляли таким же образом с получением UHT гомогенизированного молока, инокулированного от 6×10¹ до 6×10⁵ КОЕ/мл Escherichia coli (живые клетки).

Дополнительно, к 1 мл 1,9×10⁸ КОЕ/мл суспензии Staphylococcus epidermidis (живые клетки), полученной таким же способом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл UHT гомогенизированного молока для 10-кратного разбавления суспензии, и разбавленную суспензию последовательно разбавляли таким же образом с получением UHT гомогенизированного молока, инокулированного от 1,9×10² до 1,9×10⁷ КОЕ/мл Staphylococcus epidermidis (живые клетки). Отдельно также приготовляли UHT гомогенизированное молоко, не инокулированное бактериями.

Каждый из образцов UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки), UHT гомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые клетки), и UHT гомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, в объеме 1 мл помещали в микропробирку объемом 2 мл и подвергали такой же процедуре обработки липазой и протеиназой К (LP обработка), как и в контрольном примере 1. К суспензии добавляли 880 мкл физиологического солевого раствора и смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. Верхний липидный слой удаляли тампоном и водный слой, существующий в средней части, также удаляли. Затем добавляли 1 мл физиологического солевого раствора к клеткам нижнего слоя (осадок) для суспендирования клеток. К каждой LP обработанной суспензии клеток и UHT гомогенизированному молоку, не инокулированному бактериями, добавляли 10 мкл 1000 мкг/мл водного раствора ЕМА, использованного в примере 1, смесь оставляли при 4°С в течение 5 минут при экранировании света и облучали видимым светом 500 Вт на льду от лампы (FLOOD PRF, 100 В, 500 Вт, Iwasaki Electric Co., Ltd) в течение 5 минут (ЕМА обработка). Затем к образцу добавляли 990 мкл физиологического солевого раствора и образец подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. Затем верхний водный слой удаляли, добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора к осадку после центрифугирования нижнего слоя, затем к смеси добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения каждого образца.

(2) Способ теста

FCM измерения проводили для каждого из полученных выше образцов (время измерения: 5 минут) таким же образом, как и в контрольном примере 1.

(3) Результаты теста

Результаты данного теста показаны на фиг. 5.

Как показано в контрольном примере 2, указанном выше, в результатах, показанных на фиг. 2, когда живые Escherichia coli детектировали в UHT гомогенизированном молоке при использовании способа LT-обработки, большое число точек на графике для контаминирующих соматических клеток и поврежденных клеток присутствовало в области SYTO9(+)·PI(-), данная область отвечает присутствию Escherichia coli (живые клетки), в результате предел обнаружения достигал 1,1×10⁴ КОЕ/мл.

Однако, как четко видно из результатов данного теста, в SYTO9/PI графике для LP-обработанного и EMA-обработанного UHT гомогенизированного молока, не инокулированного Escherichia coli, SYTO9 интенсивность уменьшается от 1×10¹ до 5×10¹, и результаты было трудно представить на графике в области SYTO9(+)·PI(-), отображающей наличие живых клеток.

Более того, число точек на графике в области SYTO9(+)·PI(-) изменяется в зависимости от инокулированной концентрации Escherichia coli (живые клетки). Число точек на графике в данной области для каждой инокулированной концентрации показано в таблице 4. Считается, что при условиях данного теста предел детектирования для Escherichia coli (живые клетки) в UHT гомогенизированном молоке, подвергаемом LP обработке и EMA обработке (LPE обработка), составляет 6,0×10² КОЕ/мл.

Дополнительно проводили указанную выше LP обработку и EMA обработку сходным образом за исключением того, что использованный объем образца для указанной выше LP обработки и EMA обработки изменяли с 1 мл на 10 мл (концентрации липазы, протеиназы К и ЕМА были теми же) и измерения проводили при использовании проточного цитометра. Результаты измерений числа точек на графике в SYTO9(+)·PI(-) области показаны в таблице 5. Считается, что при условиях данного теста предел детектирования Escherichia coli (живые клетки) в UHT гомогенизированном молоке составляет 6,0×10¹ КОЕ/мл. По сравнению с пределом детектирования, полученным при использовании LP обработки, указанной в контрольном примере 2, 1,1×10⁴ КОЕ/мл, предел детектирования для Escherichia coli (живые клетки) был улучшен до такой низкой концентрации как примерно 1/(1,8×10²).

Число точек на графике в SYTO9(+)·PI(-) области, подсчитанное для Staphylococcus epidermidis, показано в таблице 6. Согласно результатам, предел обнаружения для Staphylococcus epidermidis (живые клетки) в UHT гомогенизированном молоке составил 1,9×10⁴ КОЕ/мл. Причинами более высокого предела обнаружения по сравнению с Escherichia coli считают чрезвычайно сильную тенденцию Staphylococcus epidermidis адсорбироваться на липидном слое, образованном в середине LP обработки, и значительное уменьшение числа точек на графике для LP-обработанного Staphylococcus epidermidis (живые клетки) в области SYTO9(+)·PI(-), выступающей в качестве области живых клеток, по сравнению с точками на графике в области SYTO9(+)·PI(-), наблюдаемыми для необработанного Staphylococcus epidermidis (живые клетки), которые отвечают большинству клеток.

Пример 3

Детектирование живых клеток и поврежденных клеток Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis (LP-обработанные), суспендированных в LTLT негомогенизированном молоке, обработанных этидий моноазидом (ЕМА), при использовании проточного цитометра

(1) Получение образцов

К каждой из 1 мл 1,5×10⁷ КОЕ/мл суспензий Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки), полученной таким же способом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл LTLT негомогенизированного молока, использованного в контрольном примере 2, для 10-кратного разбавления суспензии, и разбавленную суспензию последовательно разбавляли таким же образом с получением LTLT негомогенизированного молока, инокулированного от 1,5×10² до 1,5×10⁶ КОЕ/мл Escherichia coli (живые клетки и поврежденные клетки).

Дополнительно к каждой из 1 мл 1,8×10⁸ КОЕ/мл суспензий Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки), полученной таким же способом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл LTLT негомогенизированного молока, использованного в контрольном примере 2, для 10-кратного разбавления каждой суспензии, и разбавленную суспензию последовательно разбавляли таким же образом с получением LTLT негомогенизированного молока, инокулированного от 1,8×10² до 1,8×10⁷ КОЕ/мл Staphylococcus epidermidis (живые клетки и поврежденные клетки). Отдельно также приготовляли LTLT негомогенизированное молоко, не инокулированное бактериями.

Каждый из образцов LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки), LTLT негомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые клетки), и LTLT негомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, подвергали той же обработке липазой и протеиназой К (LP обработка), а также ЕМА обработке, таким же образом, как и обработки в примере 2. Затем к образцу добавляли 990 мкл физиологического солевого раствора и смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. После того как верхний липидный слой удаляли, добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора к осадку после центрифугирования нижнего слоя, затем к смеси добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения каждого образца.

(2) Способ теста

FCM измерения проводили для каждого из полученных выше образцов (время измерения: 5 минут) таким же образом, как и в контрольном примере 1.

(3) Результаты теста

Результаты данного теста показаны на фиг. 6 и 7. Как показано в указанном выше контрольном примере 3, согласно результатам, показанным на фиг. 3, когда живые Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis детектировали в LP-обработанном LTLT негомогенизированном молоке, большое число точек на графике для контаминирующих соматических клеток и поврежденных клеток присутствовало в области SYTO9(+)·PI(-), данная область отвечает присутствию Escherichia coli (живые клетки) и Staphylococcus epidermidis (живые клетки), и в результате предел детектирования Escherichia coli составил 1,5×10⁵ КОЕ/мл, и предел обнаружения Staphylococcus epidermidis составил 1,8×10⁶ КОЕ/мл, оба из которых представляли собой высокий уровень.

Однако, как четко видно из результатов данного теста, в SYTO9/PI графике для LP-обработанного и EMA-обработанного (LPE-обработанного) LTLT негомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, SYTO9 интенсивность уменьшается до уровня 5×10², и результаты было трудно представить на графике в области SYTO9(+)·PI(-), отображающей наличие живых клеток.

Более того, число точек на графике в области SYTO9(+)·PI(-) изменяется в зависимости от инокулированной концентрации Escherichia coli (живые клетки). Число точек на графике в данной области для каждой инокулированной концентрации показано в таблице 7. Считается, что при условиях данного теста предел детектирования для Escherichia coli (живые клетки) в LTLT негомогенизированном молоке, подвергаемом LP обработке и EMA обработке (LPE обработка), составляет 1,5×10⁴ КОЕ/мл. Более того, LTLT негомогеннизированное молоко, инокулированное Escherichia coli (поврежденные клетки) при плотности 1,5×10⁶ КОЕ/мл, подвергали LPE обработке и исследовали число точек на графике в области SYTO9(+)·PI(-), указывающей на наличие живых клеток. В результате, точки на графике практически не присутствовали в данной области. Исходя из этого, LPE обработка делает возможным четкое разделение живых клеток и поврежденных клеток Escherichia coli.

Результаты измерений числа точек на графике в области SYTO9(+)·PI(-) для Staphylococcus epidermidis показаны в таблице 8. Согласно результатам, предел обнаружения Staphylococcus epidermidis (живые клетки) в UHT гомогенизированном молоке составил 1,8×10⁵ КОЕ/мл. Считается, что причины более высокого предела обнаружения по сравнению с Escherichia coli являются сходными с причинами, указанными в примере 2.

Пример 4

Исследование влияния различных ядов топоизомеразы и ядов ДНК-гиразы

Проводили исследование детектирования при использовании проточного цитометра Escherichia coli (живые клетки) и Staphylococcus epidermidis (живые клетки), суспендированных в коммерчески-доступном коровьем молоке, при использовании соединений, относящихся к другим ядам топоизомеразы (амсакрин, эллиптицин, камптотецин) и соединениям, относящимся к ядам ДНК-гиразы (ципрофлоксацин), активность которых сходна с активностью этидий моноазида, использованного в примерах 1 и 2.

(1) Получение образцов

К 1 мл 7,5×10⁷ КОЕ/мл суспензии Escherichia coli (живые клетки), полученной сходным образом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл UHT гомогенизированного молока для 10-кратного разбавления суспензии и, таким образом, получали UHT гомогенизированное молоко, инокулированное 7,5×10⁶ КОЕ/мл Escherichia coli (живые клетки).

Дополнительно к 1 мл 2,0×10⁸ КОЕ/мл суспензии Staphylococcus epidermidis (живые клетки), полученной сходным образом, как и в контрольном примере 1, добавляли 9 мл UHT гомогенизированного молока для 10-кратного разбавления суспензии и, таким образом, получали UHT гомогенизированное молоко, инокулированное 2,0×10⁷ КОЕ/мл Staphylococcus epidermidis (живые клетки). Отдельно также приготовляли UHT гомогенизированное молоко, не инокулированное бактериями.

Каждый из образцов UHT гомогенизированного молока, инокулированного Escherichia coli (живые клетки), UHT гомогенизированного молока, инокулированного Staphylococcus epidermidis (живые клетки), и UHT гомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, объемом 1 мл помещали в микропробирку объемом 2 мл и подвергали обработке липазой и протеиназой К (LP обработка) таким же образом, как и в контрольном примере 1. К образцу добавляли 880 мкл физиологического солевого раствора и образец подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. Липидный слой, существующий в верхнем слое, удаляли тампоном и водный слой, существующий в средней части, также удаляли. Затем к клеткам нижнего слоя (осадку) добавляли 1 мл физиологического солевого раствора для получения каждой LP-обработанной суспензии.

Каждую LP-обработанную суспензию подвергали обработке растворами а) амсакрина, b) эллиптицина, с) камптотецина и d) ципрофлоксацина и к суспензии добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента для получения каждого образца для FCM измерения. Конкретные процедуры описаны ниже с а) по d).

а) Обработка амсакрином

К каждой LP-обработанной суспензии добавляли 10 мкл раствора амсакрина (Sigma, каталожный номер: А9809), растворенного в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 1 мг/мл, и смесь оставляли при 37°С в течение 10 минут. Затем к смеси добавляли стерилизованную воду с получением общего объема 2 мл и смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. После того как водный слой верхнего слоя удаляли, добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора к осадку после центрифугирования нижнего слоя, затем к смеси добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения образца.

b) Обработка эллиптицином

К каждой LP-обработанной суспензии добавляли 5 мкл раствора эллиптицина (Sigma, каталожный номер: Е3380), растворенного в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 1 мг/мл, и смесь оставляли при 37°С в течение 30 минут. Затем к смеси добавляли стерилизованную воду с получением общего объема 2 мл и смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. После того как водный слой верхнего слоя удаляли, добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора к осадку после центрифугирования нижнего слоя, затем к смеси добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения образца.

с) Обработка камптотецином

К каждой LP-обработанной суспензии добавляли 10 мкл раствора камптотецина (Sigma, каталожный номер: С9911), растворенного в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 1 мг/мл, и смесь оставляли при 37°С в течение 30 минут. Затем к смеси добавляли стерилизованную воду с получением общего объема 2 мл и смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. После того как водный слой верхнего слоя удаляли, добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора к осадку после центрифугирования нижнего слоя, затем к смеси добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения образца.

d) Обработка ципрофлоксацином

К каждой LP-обработанной суспензии добавляли 8 мкл раствора ципрофлоксацина (Fluka, каталожный номер: 17850), растворенного в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 0,5 мг/мл, и смесь оставляли при 37°С в течение 30 минут. Затем к смеси добавляли стерилизованную воду с получением общего объема 2 мл и смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут. После того как водный слой верхнего слоя удаляли, добавляли 300 мкл физиологического солевого раствора к осадку после центрифугирования нижнего слоя, затем к смеси добавляли 0,9 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения образца.

(2) Способ теста

FCM измерения проводили для каждого из полученных выше образцов (время измерения: 5 минут) таким же образом, как и в контрольном примере 1.

(3) Результаты теста

Результаты данного теста показаны на фиг. 8.

Для образцов, подвергаемых только LP обработке, область на графике Escherichia coli (живые клетки) и области контаминантов (соматические клетки, поврежденные клетки, продукты неполного разложения мицелярного казеина, вызванного LP обработкой), происходящие из UHT гомогенизированного молока, располагались рядом одна с другой и частично перекрывались (интенсивность SYTO9 LP-обработанного UHT гомогенизированного молока, не инокулированного бактериями, из-за контаминантов может значительно превышать 10³, в зависимости от типа, производителя и т.д. коровьего молока, и в этом случае области на графике живых клеток и контаминантов значительно перекрываются одна с другой) и, таким образом, Escherichia coli (живые клетки) не могут быть явно распознаны. Однако, когда после LP обработки была проведена обработка раствором а) амсакрина, b) эллиптицина, с) камптотецина или d) ципрофлоксацина, области на графике Escherichia coli (живые клетки) и контаминанты легко разделялись, и в результате облегчалось детектирование Escherichia coli (живые клетки). Более того, сходные результаты также наблюдались для Staphylococcus epidermidis.

С высокой вероятностью амсакрин и камптотецин при концентрациях, использованных в примере 3, и в течение времени реакции, указанном выше (10 минут и 30 минут соответственно), не проникали через клеточные стенки Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis (живые клетки), тогда как они проникали через клеточные мембраны соматических клеток, которые превращались в мертвые клетки под действием мгновенной пастеризации, и клеточные стенки поврежденных клеток. Считается, что два типа указанных выше агентов, проникающих в соматические клетки и поврежденные клетки, хаотично связываются с хромосомной ДНК за счет ковалентного присоединения с ингибированием повторного лигирования ДНК топоизомеразой II или топоизомеразой I в соматических клетках или топоизомеразой IV, топоизомеразой I, или топоизомеразой III в поврежденных клетках или ДНК-гиразой, и, таким образом, хромосомная ДНК фрагментируется, приводя к уменьшению интенсивности флуоресценции SYTO9. С другой стороны, указанные агенты не влияют на хромосомную ДНК живых клеток, и, таким образом, интенсивность флуоресценции SYTO9 в живых клетках не уменьшается. Исходя из этого, их области на графике были четко разделены.

С высокой вероятностью эллиптицин и ципрофлоксацин при концентрациях, использованных в примере 3, и в течение времени реакции, указанном выше (30 минут), также не проникали через клеточные стенки живых клеток, тогда как они проникали через клеточные мембраны соматических клеток и клеточные стенки поврежденных клеток, сходным образом с указанным выше. Хотя считается, что эллиптицин использует действие топоизомеразы II в соматических клетках и ДНК-гиразы в поврежденных клетках или топоизомеразы IV, он не ингибирует повторное лигирование ДНК под действием указанных ферментов, но промотирует расщепление цепочек ДНК под действием указанных ферментов, приводящее к фрагментированию хромосомной ДНК. Напротив, считается, что ципрофлоксацин с высокой вероятностью ингибирует повторное лигирование цепочек ДНК под действием ДНК-гиразы в поврежденных клетках и также ингибирует повторное лигирование цепочек ДНК под действием топоизомеразы II в соматических клетках.

Пример 5

Распознавание живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток на основе электрофоретического спектра хромосомных ДНК, полученных после ЕМА обработки четырех типов грамотрицательных бактерий (бактерии Escherichia coli DH5α, Klebsiella, Citrobacter и Salmonella) и грамположительной бактерии (Staphylococcus epidermidis), использованных в качестве тестовых материалов

(1) Получение образцов

1-1) Получение суспензий четырех типов грамотрицательных бактерий (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки)

Escherichia coli DH5α, Klebsiella oxytoca JCM 1665 (здесь далее также обозначаемая как «Klebsiella»), Citrobacter koseri JCM 1658 (здесь далее также обозначаемая как «Citrobacter») и Salmonella enteridis IID 604 (здесь далее также обозначаемая как «Salmonella») культивировали при 37°С в питательной среде BHI и 40 мл каждой среды, в которых клетки находились в последней стадии фазы логарифмического роста, подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 8000×g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость удаляли, затем к остатку добавляли 40 мл физиологического солевого раствора, смесь перемешивали и подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях. Надосадочную жидкость удаляли и к остатку добавляли 10 мл физиологического солевого раствора для получения суспензии живых клеток. Число живых клеток в этих суспензиях живых клеток составляло: Escherichia coli: 3,2×10⁸ КОЕ/мл, Klebsiella: 4,8×10⁸ КОЕ/мл, Citrobacter: 6,7×10⁷ КОЕ/мл и Salmonella: 1,9×10⁸ КОЕ/мл. Дополнительно 1 мл каждой суспензии живых клеток помещали в микропробирку 1,5 мл, микропробирку погружали в кипящую воду на 50 секунд и затем быстро охлаждали путем погружения в ледяную воду для получения суспензии поврежденных клеток. Кроме того, для Escherichia coli отдельно получали суспензию мертвых клеток из 1 мл суспензии живых клеток путем погружения в кипящую воду на 12 минут и быстрого охлаждения в ледяной воде. Подтверждали, что как суспензии поврежденных клеток, так и мертвых клеток не образуют колонии на агаровой среде L.

1-2) Получение суспензий грамположительной бактерии (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки)

Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus epidermidis штамм KD) культивировали при 37°С в питательной среде BHI и 40 мл среды, в которой клетки находились в последней стадии фазы логарифмического роста, подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 8000×g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость удаляли, затем к остатку добавляли 40 мл физиологического солевого раствора, смесь достаточно перемешивали и подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях. Надосадочную жидкость удаляли и к остатку добавляли 10 мл физиологического солевого раствора для получения суспензии живых клеток. Число живых клеток в указанной суспензии живых клеток составляло 1,9×10⁸ КОЕ/мл. Дополнительно, 1 мл суспензии живых клеток помещали в микропробирку 1,5 мл, микропробирку погружали в кипящую воду на 50 секунд и затем быстро охлаждали путем погружения в ледяную воду для получения суспензии поврежденных клеток. Кроме того, отдельно получали суспензию мертвых клеток из 1 мл суспензии живых клеток путем погружения в кипящую воду на 12 минут и быстрого охлаждения в ледяной воде. Подтверждали, что как суспензии поврежденных клеток, так и мертвых клеток не образуют колонии на агаровой среде L.

Для того чтобы получить зависимость времени погружения в кипящей воде от температуры жидкости заранее, 1 мл физиологического солевого раствора помещали в микропробирку 1,5 мл при комнатной температуре и полностью герметизировали крышкой, в крышке проделывали небольшое отверстие и в отверстие помещали температурный датчик типа термопары (TX10, Yokogawa M & C). Затем микропробирку в значительной степени полностью помещали в кипящую воду и измеряли температуру воды с течением времени.

(2) Время тестирования

2-1) Стадии обработки этидий моноазидом и облучения видимым светом

В объеме 1 мл каждую суспензию грамотрицательных бактерий (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки) и грамположительной бактерии (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки) подвергали ЕМА обработке таким же образом, как и в примере 3. После добавления ЕМА раствора к суспензиям, суспензии грамотрицательных бактерий оставляли при 4°С на 30 минут при экранировании света и суспензии грамположительной бактерии оставляли при 4°С в течение 5 минут при экранировании света, пока их не подвергали облучению видимым светом.

Отдельно к 1 мл каждой суспензии грамотрицательных бактерий (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки) и грамположительной бактерии (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки) вместо ЕМА добавляли 10 мкл стерилизованной воды и затем подвергали той же процедуре, использованной для упомянутой выше ЕМА обработки (ЕМА-необработанные).

2-2) Стадия экстракции ДНК

Каждую микропробирку, содержащую живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки грамотрицательных бактерий и грамположительной бактерии (ЕМА-необработанные и обработанные), подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000×g в течение 10 минут и удаляли надосадочную жидкость. К каждой микропробирке добавляли 1 мл физиологического солевого раствора, смесь достаточно перемешивали, весь объем смеси перемещали в микропробирку 2 мл и подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000×g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли для получения осадка клеток после центрифугирования.

В случае грамположительной бактерии ДНК экстрагировали следующим образом. К каждому осадку клеток после центрифугирования добавляли 0,5 мМ этилендиаминуксусной кислоты (EDTA) и добавляли 20 мкл раствора ахромопептидазы, заранее полученного в 5 мг/мл 10 мМ водном растворе NaCl (Wako Pure Chemical Industries, каталожный номер: 014-09661), и смесь оставляли при 50°С в течение 30 минут. Затем к смеси добавляли 0,5 мл 10 мМ Tris-HCl (рН 8,0), добавляли 20 мкл 1250 ед./мл протеиназы К (Sigma, каталожный номер: Е.C. 3.4.21.64), добавляли 400 мкл SDS раствора, заранее приготовленного в концентрации 10% (мас./об.) в стерилизованной воде, и реакцию оставляли в течение ночи при 50°С.

Каждую обработанную суспензию помещали в две микропробирки объемом 2 мл, в каждую на половину объема, к суспензии добавляли 0,5 мл насыщенного фенола и смесь аккуратно перемешивали в течение 15 минут. Затем к смеси добавляли 0,5 мл хлороформа и смесь аккуратно перемешивали в течение 5 минут. Смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 6000×g в течение 10 минут, водный слой верхнего слоя переносили в новую пробирку объемом 2 мл, к смеси добавляли 70 мкл ацетата натрия 3М (рН 5,2) и 1,21 мл холодного этанола 99,5% и смесь аккуратно перемешивали. Смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000×g в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляли и затем остаток промывали 0,4 мл 70% холодного этанола (указанную выше процедуру также обозначают как «экстрация фенолом/хлороформом»). К осадку после центрифугирования добавляли 0,5 мл ТЕ буфера (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ этилендиаминуксусной кислоты (EDTA)·2Na) и смесь оставляли на ночь при 4°С для растворения ДНК.

Заранее полученный раствор 5 мкл рибонуклеазы (Sigma, каталожный номер: E.C. 3.1.27.5) с концентрацией 10 мг/мл в стерилизованной воде добавляли к указанному выше раствору ДНК и смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа. К смеси добавляли 0,25 мл смеси фенол/хлороформ (1/1) и смесь аккуратно перемешивали в течение 10 минут, к смеси дополнительно добавляли 0,25 мл хлороформа и смесь аккуратно перемешивали в течение 5 минут. Смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 6000×g в течение 10 минут, водный слой верхнего слоя переносили в новую микропробирку объемом 2 мл, к смеси добавляли 50 мкл 3 М водного раствора ацетата натрия и 1 мл 99,5% холодного этанола и смесь аккуратно перемешивали. Смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000×g в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляли, затем остаток промывали 0,4 мл 70% холодного этанола и осадок после центрифугирования сушили (указанную выше процедуру также обозначают как «обработка рибонуклеазой»). К высушенному осадку после центрифугирования добавляли 125 мкл ТЕ буфера и смесь оставляли на ночь при 4°С для растворения ДНК. Концентрацию очищенного раствора ДНК измеряли на основе поглощения при 260 нм (УФ), OD₂₆₀ (50 мкг ДНК/мл рассматривали как OD=1, длина кюветы: 1 см) и чистоту очищенного ДНК оценивали на основе OD₂₆₀/OD₂₈₀.

Для грамотрицательных бактерий ДНК экстрагировали при использовании следующего способа. К указанному выше осадку клеток после центрифугирования добавляли 0,5 мл 10 мМ Tris-HCl (рН 8,0), добавляли 10 мкл 1250 ед./мл протеиназы К (Sigma, каталожный номер: Е.C. 3.4.21.64) и добавляли 200 мкл SDS раствора, заранее приготовленного в концентрации 10% (мас./об.) в стерилизованной воде, и реакцию оставляли в течение ночи при 50°С. Затем проводили экстракцию ДНК сходным образом с экстракцией ДНК грамположительных бактерий.

2-3) Электрофорез экстрагированной ДНК в агарозном геле

Получали 0,8% агарозный гель из Seakem GTG агарозы (FMC, каталожный номер: 50070) и ТАЕ буфера (4,84 г/л Tris, 1,142 мл уксусной кислоты, 0,149 г/л этилендиаминуксусной кислоты (EDTA)·2Na), и λ-EcoT14I гидролизат (Takara Shuzo, code: 3401) и 100 bp (пар нуклеотидов) DNA Ladder (Takara Shuzo, code: 3407А) использовали в качестве маркеров. Для каждой из грамотрицательных бактерий и грамположительной бактерии ЕМА-необработанную суспензию живых клеток, ЕМА-обработанную суспензию живых клеток, ЕМА-необработанную суспензию поврежденных клеток и ЕМА-обработанную суспензию поврежденных клеток помещали в лунки в указанном порядке в количестве примерно 1 мкг и подвергали электрофорезу при 100 В. После того как в гель мигрировало примерно 90% бромфенолового синего (BPB), электрофорез завершали. Отдельно для Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis также подвергали сходной процедуре электрофореза ЕМА-необработанную суспензию мертвых клеток и ЕМА-обработанную суспензию мертвых клеток.

Гель, на котором проводили электрофорез, погружали в водный раствор 1 мкг/мл этидий бромида на 20 минут и дважды промывали Milli-Q водой, и затем степень расщепления хромосомной ДНК наблюдали при использовании УФ трансиллюминатора (254 нм).

(3) Результаты теста

Зависимость между временем погружения в кипящую воду и температурой жидкости показана на Фиг. 9. Было подтверждено, что по крайней мере тепловая обработка путем погружения в кипящую воду на 50 секунд отвечает обработке пастеризацией несколько более сильной, чем пастеризация в течение короткого промежутка времени (HTST пастеризация, от 72 до 75°С, от 15 до 16 секунд). Таким образом было подтверждено, что указанная выше тепловая обработка эквивалентна тепловой обработке такой же степени, как и стерилизация с точки зрения подавления денатурации пищевых продуктов, т.е. низкотемпературной пастеризации в течение длительного времени (LTLT пастеризация) и пастеризации при ультравысокой температуре (UHT пастеризация). Таким образом, поврежденные клетки, полученные при использовании способа, описанного в (1) Получение образцов, указанного выше, представляют собой биохимические и ферментативные эквиваленты мертвых клеток в пищевых продуктах, умерщвленных в целях подавления денатурации ингредиентов пищевых продуктов, и физические повреждения также представляют собой эквиваленты. Для мертвых клеток, полученных при использовании способа, описанного в (1) Получение образцов, указанного выше, поскольку температуру жидкости поддерживали при 100°С в течение 10 минут, после того как температура достигала 100°С, и суспензию также нагревали в течение двух минут, перед тем как температура достигала 100°С, согласно зависимости, показанной на Фиг. 9, большинство ферментов в мертвых клетках было инактивировано, и повреждение стенок клеток было также настолько значительным, что часть хромосомной ДНК выходила из клеток.

Далее, результаты различения живых клеток и поврежденных клеток для каждой грамотрицательной бактерии показаны на Фиг.10, результаты различения поврежденных клеток и мертвых клеток Escherichia coli на Фиг.11 и результаты различения живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток для грамположительной бактерии Staphylococcus epidermidis показаны на Фиг.12. На Фиг. 10 была отмечена чрезвычайно длинная полоса (LL полоса), отвечающая хромосомной ДНК, локализованная незначительно ниже маркера λ-EcoT14I гидролизата 19329 bp, и было принято, что наличие этой полосы обозначали как (+) и отсутствие этой полосы обозначали как (-). Результаты для четырех типов грамотрицательных бактерий с точки зрения этой полосы представляли собой, в порядке ЕМА-необработанные и ЕМА-обработанные образцы, (+)·(+) картина для живых клеток и (+)·(-) картина для поврежденных клеток. Дополнительно, картины для поврежденных клеток и мертвых клеток Escherichia coli, приведенные на Фиг. 11, представляли собой (+)·(-) картину и (-)·(-) картину соответственно. Таким образом, ЕМА сделала возможным одновременное различение живых клеток, поврежденных и мертвых клеток. На фиг. 12 сходным образом показано, что различение живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток также возможно для грамположительной бактерии, такой как Staphylococcus epidermidis.

EMA действует, в частности, на топоизомеразу II в опухолевых клетках человека, проявляющих высокую скорость митоза, в качестве яда топоизомеразы II в клетках млекопитающих, и из действий фермента, состоящих в расщеплении ДНК и повторном лигировании, ингибирует повторное лигирование ДНК. Таким образом, ЕМА предполагается в качестве антиракового агента, многократно расщепляющего хромосомную ДНК раковых клеток для уничтожения раковых клеток. Изначально ЕМА проявлял низкую проницаемость клеточных мембран и, в применениях в области бактериологии, его оценивали исключительно как так называемый ДНК-сшивающий агент, который не может проникать через клеточные стенки живых бактерий, но может проникать через клеточные стенки мертвых бактерий для сшивания хромосомной ДНК мертвых бактерий, как описано в международной заявке на патент, нерассмотренная публикация заявки Японии № 2003-530118. Также в настоящем примере не наблюдалось, чтобы хромосомные ДНК живых клеток, оставленных на 30 минут, специфически расщеплялись под действием ЕМА, как показано на Фиг. 10, и для хромосомных ДНК поврежденных клеток, оставленных на тот же период времени, наблюдалось значительное расщепление под действием ЕМА. Таким образом, было предположено, что ЕМА в значительной степени не проникает через клеточные стенки живых клеток, но проникает через большую часть клеточных стенок поврежденных клеток. Что следует в особенности отметить, это то, что, несмотря на то, что ЕМА изначально ингибирует действие топоизомеразы II клеток млекопитающего с точки зрения повторного лигирования и, таким образом, вызывает многократное расщепление хромосомной ДНК, приводя к смерти клеток млекопитающего, ЕМА не влияет на живые клетки в настоящем примере, что позволяет предполагать то, что ЕМА ингибирует активность бактериальной ДНК-гиразы и/или топоизомеразы IV, активность которых сохраняется в клетках и вызывает многократное расщепление хромосомной ДНК поврежденных клеток.

Пример 6

Одновременное различение ЕМА-обработанных живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis при использовании FCM

(1) Получение образцов

1-1) Получение суспензий Escherichia coli (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки)

Согласно способу примера 5, (1) Получение образцов, 1-1), получали живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки Escherichia coli (число живых клеток: 4×10⁶ КОЕ/мл, число поврежденных клеток: 4×10⁶ КОЕ/мл, число мертвых клеток: 4×10⁶ КОЕ/мл).

1-2) Получение суспензий Staphylococcus epidermidis (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки)

Согласно способу примера 5, (1) Получение образцов, 1-2), получали живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки Staphylococcus epidermidis (число живых клеток: 4×10⁷ КОЕ/мл, число поврежденных клеток: 4×10⁷ КОЕ/мл, число мертвых клеток: 4×10⁷ КОЕ/мл).

(2) Способ теста

2-1) Обработка этидий моноазидом и стадия облучения видимым светом

К каждому образцу 1 мл указанных выше суспензий живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток Escherichia coli добавляли 10 мкл водного раствора ЕМА 1000 мкг/мл и суспензию оставляли при 4°С на 30 минут при экранировании света. Затем суспензию помещали на лед и облучали видимым светом 500 Вт от лампы (FLOOD PRF, 100 В, 500 Вт, Iwasaki Electric Co., Ltd), расположенной на расстоянии 20 см от суспензии, в течение 10 минут. Живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки Staphylococcus epidermidis подвергали такой же обработке.

2-2) Окрашивание ядер и FCM измерения

Каждую из указанных выше суспензий, обработанных ЕМА, подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000×g в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости к остатку добавляли 1 мл физиологического солевого раствора, смесь достаточно перемешивали и подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях. Надосадочную жидкость удаляли и добавляли к остатку 1 мл физиологического солевого раствора. К смеси добавляли 3 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента (LIVE/DEAD BacLight^TM Bacterial Viability kit, Molecular Probes, SYTO9/PI = 1/1 смесь) и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения каждого образца суспензии. Для указанных образцов проводили измерения при использовании FCM измерительной аппаратуры FACS Calibur (Becton Dickinson). Условия измерения были такими же, как и условия в контрольном примере 1.

(3) Результаты теста

Результаты теста при использовании FCM для живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток Escherichia coli до и после ЕМА обработки показаны на фиг. 13 и такие же результаты для Staphylococcus epidermidis показаны на фиг. 14.

Граничная величина интенсивности окрашивания SYTO9 определяется как интенсивность 10³, результаты, превышающие это значение, представлены как SYTO9(+), и результаты ниже указанного значения представлены как SYTO9(-). Граничная величина интенсивности окрашивания PI определяется как интенсивность 2×10², результаты, превышающие это значение, представлены как PI(+), и результаты ниже указанного значения представлены как PI(-). Живые клетки Escherichia coli до ЕМА обработки в основном распределены в SYTO9(+)·PI(-) области, поврежденные клетки также в основном распределены в SYTO9(+)·PI(-) области, и мертвые клетки в основном распределены в SYTO9(+)·PI(+) области. Таким образом, для клеток, не обработанных ЕМА, живые клетки и поврежденные клетки не могут быть различены, но поврежденные клетки и мертвые клетки могут быть различены даже в том случае, когда клетки не обработаны ЕМА. Более того, после ЕМА обработки распределение живых клеток не изменилось, т.е. они распределены в SYTO9(+)·PI(-) области, но интенсивность окрашивания SYTO9 для поврежденных клеток значительно уменьшалась, сдвигая их основное распределение в SYTO9(-)·PI(-) область, и, таким образом, живые клетки и поврежденные клетки могли быть легко различены. Без обработки одновременное различение живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток было невозможно. Однако после ЕМА обработки, хотя основное распределение мертвых клеток сдвинулось из SYTO9(+)·PI(+) области в SYTO9(-)·PI(+) область, области, в которых живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки в основном распределении не перекрывались, и, таким образом, было возможно одновременно различать клетки.

В случае поврежденных клеток сохраняется ферментативная активность поврежденных клеток и также существует метаболическая активность. Таким образом, ЕМА проникает через клеточные стенки поврежденных клеток и сшивает хромосомную ДНК поврежденных клеток с ингибированием действия повторного лигирования бактериальной ДНК-гиразы в поврежденных клетках. В результате чего сохраняется такое состояние, что многократно расщепляется хромосомная ДНК и хромосомная ДНК значительно фрагментируется. Это в особенности приводит к уменьшению числа интеркалированного SYTO9, и, таким образом, уменьшается интенсивность окрашивания. В случае мертвых клеток метаболические функции прекращаются, и гены не транскрибируются. Однако предполагается, что, поскольку бактериальная ДНК-гираза и бактериальная топоизомераза IV обладают устойчивостью к нагреванию, часть их активности сохраняется, и, таким образом, указанные выше ферменты функционируют сами по себе. Таким образом, оценено, что, если проводится ЕМА обработка, интенсивность окрашивания SYTO9 значительно уменьшается.

Пример 7

Одновременное различение живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis H37RA, здесь далее также обозначаемый как «Mycobacterium tuberculosis») и Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes JCM 2873, здесь далее также обозначаемый как «Listeria») при использовании FCM

(1) Получение образцов

1-1) Получение суспензий Mycobacterium tuberculosis (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки)

Mycobacterium tuberculosis наносили на косой агар среды Огава и культивировали при 37°С в течение трех недель (в среде 20% кислорода и 5% диоксида углерода). Затем клетки инокулировали в жидкую среду Саутона, содержащую 0,05% Tween 80, и культивировали при 37°С в течение 3 недель при указанных выше аэробных условиях. Культивируемую среду последовательно разбавляли физиологическим солевым раствором, содержащим 0,05 Tween 80, и культивировали на чашках Петри с агаровой средой Middelbrook 7H10 для подтверждения, что число живых клеток составляло 7,7×10⁸ КОЕ/мл. Культивируемую среду в объеме 2 мл инокулировали в 200 мл свежеполученной жидкой среды Саутона, содержащей 0,05% Tween 80, добавляли 200 мкл раствора рифампицина 150 мг/мл (растворенного в стерилизованной воде) к культуре (конечная концентрация: 148,5 мкг/мл), дополнительно добавляли 100 мкл гидразида изоникотиновой кислоты 10 мг/мл (растворенного в стерилизованной воде) к среде (конечная концентрация: 5 мкг/мл) и клетки культивировали при 37°С в течение 3 месяцев при указанных выше аэробных условиях. После культивирования в течение 1 месяца число живых клеток Mycobacterium tuberculosis измеряли на 7Н10 среде, и было подтверждено, что клетки не образуют колоний.

Культивируемую среду после культивирования в течение 3 месяцев в объеме 200 мл подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 8000×g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость полностью удаляли, затем к остатку добавляли 200 мл физиологического солевого раствора, смесь перемешивали и подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях, как и указано выше, и надосадочную жидкость полностью удаляли. Процедуру промывания дополнительно проводили еще раз, и было подтверждено, что надосадочная жидкость не показывает коричневой окраски, обусловленной рифампицином. К осадку после центрифугирования, полученному центрифугированием при охлаждении, добавляли 20 мл физиологического солевого раствора, содержащего 0,005% Tween 80, для получения суспензии поврежденных клеток Mycobacterium tuberculosis.

Число клеток бактерий в указанной выше суспензии поврежденных клеток Mycobacterium tuberculosis измеряли при использовании следующего способа. Способ состоит в том, что 1 мл указанной выше культивируемой среды (живые клетки) 7,7×10⁸ КОЕ/мл Mycobacterium tuberculosis экстрагировали и подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000 об/мин в течение 10 минут. После того как надосадочную жидкость удаляли, к остатку добавляли 1 мл физиологического солевого раствора, содержащего 0,05% Tween 80, смесь перемешивали и подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях, как и указано выше, и надосадочную жидкость полностью удаляли. К осадку после центрифугирования добавляли 1 мл физиологического солевого раствора, содержащего 0,05% Tween 80, (суспензия живых клеток Mycobacterium tuberculosis 5,2×10⁸ КОЕ/мл). Для получения разбавленной суспензии суспензию дополнительно разбавляли в 10, 100, 1000 и 10000 раз физиологическим солевым раствором, содержащим 0,05% Tween 80, и для каждой суспензии измеряли поглощение видимого света 600 нм, OD_600нм. На графике откладывали плотность живых клеток Mycobacterium tuberculosis и значение OD для получения калибровочной кривой и концентрацию поврежденных клеток рассчитывали на основе OD значения указанной выше суспензии поврежденных клеток Mycobacterium tuberculosis (число поврежденных клеток в суспензии поврежденных клеток Mycobacterium tuberculosis: 6×10⁷ КОЕ/мл).

Вновь полученную суспензию живых клеток Mycobacterium tuberculosis разбавляли физиологическим солевым раствором, содержащим 0,05% Tween 80, таким образом, чтобы он имел то же значение OD, что и суспензия поврежденных клеток.

Дополнительно суспензию живых клеток Mycobacterium tuberculosis той же плотности, что и суспензия поврежденных клеток, погружали в кипящую воду на 12 минут для получения суспензии мертвых клеток Mycobacterium tuberculosis. Поскольку невозможно превратить клетки Mycobacterium tuberculosis в мертвые клетки, не повредив клетки, или нет уверенности в возможности превращения клеток Mycobacterium tuberculosis в мертвые клетки, не повредив клетки, путем длительного применения противотуберкулезного агента, с точки зрения механизма действия противотуберкулезного агента, мертвые клетки получали при использовании тепловой обработки.

1-2) Получение суспензий Listeria (живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки)

Listeria инокулировали в питательную среду L и культивировали при 30°С в течение 48 часов (3×10⁸ КОЕ/мл). Культивируемую среду в объеме 3 мл инокулировали в 300 мл питательной среды L, добавляли 1,5 мл раствора ампициллина 100 мг/мл (растворенного в стерилизованной воде) и 600 мкл раствора гентамицина 100 мг/мл (растворенного в стерилизованной воде) к культивированной среде (конечные концентрации: 500 мкг/мл и 200 мкг/мл соответственно) и клетки культивировали при 30°С в течение 3 недель. После культивирования было подтверждено, что клетки не образуют колоний на агаровой среде L. Культивируемую среду в объеме примерно 200 мл подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 8000×g в течение 15 минут и полностью удаляли надосадочную жидкость. К осадку после центрифугирования добавляли 300 мл физиологического солевого раствора, смесь перемешивали и затем подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях, надосадочную жидкость полностью удаляли и к осадку после центрифугирования добавляли 3 мл физиологического солевого раствора для получения суспензии поврежденных клеток Listeria. При использовании в значительной степени той же процедуры, что и для измерения числа поврежденных клеток Mycobacterium tuberculosis, измеряли число поврежденных клеток в суспензии поврежденных клеток Listeria (2×10⁸ КОЕ/мл).

Отдельно получали суспензию живых клеток Listeria согласно способу примера 6, (1) Получение образцов, 1-1), и разбавляли физиологическим солевым раствором до такой плотности, чтобы значение OD суспензии было бы таким же, как и значение OD суспензии поврежденных клеток Listeria.

Дополнительно суспензию мертвых клеток Listeria получали путем погружения суспензии живых клеток Listeria той же плотности, как суспензия поврежденных клеток, в кипящую воду на 12 минут.

(2) Способ теста

2-1) Стадии обработки этидий моноазидом и облучения видимым светом

К каждому образцу объемом 1 мл указанных выше суспензий живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток Mycobacterium tuberculosis и суспензий живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток Listeria добавляли 30 мкл объема водного раствора ЕМА 1000 мкг/мл для Mycobacterium tuberculosis (конечная концентрация: примерно 30 мкг/мл) или 10 мкл для Listeria (конечная концентрация: примерно 10 мкг/мл) и каждую суспензию оставляли при 4°С на 2,5 часа для Mycobacterium tuberculosis или при 4°С на 5 минут для Listeria при экранировании света. Затем суспензию помещали на лед и облучали видимым светом 500 Вт от лампы (FLOOD PRF, 100 В, 500 Вт, Iwasaki Electric Co., Ltd), расположенной на расстоянии 20 см от суспензии, в течение 5 минут.

2-2) Окрашивание ядер и FCM измерения

Каждую из указанных выше суспензий, обработанных ЕМА, подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000×g в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости к остатку добавляли 1 мл физиологического солевого раствора, содержащего 0,05% Tween 80, для Mycobacterium tuberculosis или 1 мл физиологического солевого раствора для Listeria, и смесь достаточно перемешивали и подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях. Надосадочную жидкость удаляли и добавляли к остатку 1 мл жидкой среды Саутона, содержащей 0,05% Tween 80, для Mycobacterium tuberculosis или 1 мл физиологического солевого раствора для Listeria. Для Mycobacterium tuberculosis клетки культивировали при 37°С в течение 24 часов, затем культуру подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 15000×g в течение 15 минут, надосадочную жидкость удаляли и затем к остатку добавляли 1 мл физиологического солевого раствора, содержащего 0,05% Tween 80.

К каждой обработанной смеси добавляли 3 мкл SYTO9/PI флуоресцентного окрашивающего реагента (LIVE/DEAD BacLight^TM Bacterial Viability kit, Molecular Probes, SYTO9/PI=1/1 смесь) и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света для получения каждого образца суспензии. Для указанных образцов проводили измерения при использовании FCM измерительной аппаратуры FACS Calibur (Becton Dickinson). Условия измерения были такими же, как и условия в контрольном примере 1.

(3) Результаты теста

Результаты теста при использовании FCM для живых клеток, поврежденных клеток, обработанных гидразидом изоникотиновой кислоты и рифампицином, и мертвых клеток Mycobacterium tuberculosis до и после обработки ЕМА показаны на Фиг. 15, и результаты для живых клеток, поврежденных клеток, обработанных ампициллином и гентамицином, и мертвых клеток Listeria до и после обработки ЕМА показаны на Фиг. 16.

Как и в примере 6, (3) Результаты теста, граничная величина интенсивности окрашивания SYTO9 определяется как интенсивность 10³, результаты, превышающие это значение, представлены как SYTO9(+), и результаты ниже указанного значения представлены как SYTO9(-). Граничная величина интенсивности окрашивания PI определяется как интенсивность 2×10², результаты, превышающие это значение, представлены как PI(+) и результаты ниже указанного значения представлены как PI(-). Из результатов, показанных на Фиг. 15, четко видно, что ЕМА обработка делает возможным различение живых клеток Mycobacterium tuberculosis и поврежденных клеток Mycobacterium tuberculosis, обработанных гидразидом изоникотиновой кислоты и рифампицином. Что касается мертвых клеток, распознавание их от живых клеток и поврежденных клеток уже было реализовано на основе SYTO9/PI до добавления ЕМА. Дополнительно, хотя из-за ЕМА обработки область, в которой в основном распределены мертвые клетки, сдвигается от SYTO9(+)·PI(+) области к области SYTO9(±)·PI(±), область не перекрывается с областями, в которых в основном распределены живые клетки и поврежденные клетки, обработанные ЕМА. Таким образом, становится возможным одновременное различение живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток. Интенсивность SYTO9 поврежденных клеток Mycobacterium tuberculosis под действием ЕМА обработки значительно сдвигается влево, и область сдвигается под действием ЕМА обработки от SYTO9(+)·PI(-) к SYTO9(-)·PI(-). Рифампицин связывается с β-субъединицей бактериальной ДНК-зависимой РНК-полимеразы, с ингибированием связывания ДНК-полимеразы с промотором ДНК. В результате предотвращается инициация транскрипции. Поскольку он не действует на РНК-полимеразу, уже связанную с промотором, уже инициированная реакция транскрипции не ингибируется. Таким образом, даже если клетки в результате добавления рифампицина становятся поврежденными клетками, которые потеряли способность к образованию колоний, сохраняется активность различных ферментов, продуцируемых до добавления рифампицина к живым клеткам Mycobacterium tuberculosis, таких как бактериальная ДНК-гираза и бактериальная топоизомераза IV, и стенки клетки также сохраняются с точки зрения механизма действия рифампицина. Несмотря на то, что гидразид изоникотиновой кислоты ингибирует синтез миколовой кислоты в клеточных стенках, он в значительной степени не действует на уже образованные клеточные стенки или, таким образом, не приводит к разрушению клеток в ходе деления клеток. Путем добавления ЕМА в таком состоянии, ингибируется повторное лигирование ДНК-гиразы и/или бактериальной топоизомеразы IV, в результате, процесс расщепления будет наблюдаться по всей хромосомной ДНК и, таким образом, ДНК фрагментируется. Полагают, что таким образом явно уменьшается эффективность интеркаляции SYTO9, и, таким образом, интенсивность окрашивания поврежденных клеток значительно сдвигается влево. В случае мертвых клеток интенсивность окрашивания SYTO9 значительно уменьшается согласно такому же механизму действия, как и для мертвых клеток, указанных в примере 6. Дополнительно, живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки Listeria также демонстрировали такую же реакцию, как и демонстрируемая Mycobacterium tuberculosis.

Контрольный пример 4

Получение и различение живых клеток, поврежденных клеток и мертвых клеток при использовании традиционных способов

Получение образцов и способы тестирования

1-1) Применения в санитарной пищевой инспекции

Получали суспензии живых клеток в физиологическом солевом растворе Escherichia coli (от 2,6×10³ до 2,6×10⁸ КОЕ/мл) и Staphylococcus epidermidis (от 6,7×10² до 6,7×10⁷ КОЕ/мл) (А), и их погружали в кипящую воду на 50 секунд и быстро охлаждали (В) или погружали в кипящую воду на 12 минут и быстро охлаждали (С). В указанных суспензиях (А), (В) и (С) живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки классифицировали при одинаковых плотностях клеток при использовании АТФ-способа и измерения эстеразной активности. Дополнительно оценивали как различные состояния бактерий, определенные как живые клетки, поврежденные клетки или мертвые клетки по способу настоящего изобретения примеров 5 и 6 соотносились с классификацией таких же клеток, определенных при использовании АТФ-способа (KIKKOMAN набор реагентов для измерения АТФ (ATP measurement reagent kit), Lucifer 250 Plus и KIKKOMAN набор реагентов для подавления АТФ (ATP eliminating reagent kit), Lucifer ATP Eliminating Reagent, KIKKOMAN CORP.) и эстеразного способа (Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 5209-5216).

1-2) Применение в клиническом тесте

Были получены суспензии живых клеток Mycobacterium tuberculosis в физиологическом солевом растворе, содержащем 0,05% Tween (D1, от 5,3×10³ до 5,3×10⁸ КОЕ/мл), и суспензии живых клеток Listeria в физиологическом солевом растворе (Е1, от 3,1×10⁴ до 3,1×10⁹ КОЕ/мл). При использовании указанных суспензий живых клеток получали Mycobacterium tuberculosis, обработанные гидразидом изоникотиновой кислоты (INH, конечная концентрация: 5 мкг/мл) и рифампицином (REF, 150 мкг/мл) в течение 3 месяцев (D2), Mycobacterium tuberculosis, обработанные стрептомицином (SM, 300 мкг/мл) и канамицином (КМ, 300 мкг/мл) в течение 3 месяцев (D3), Mycobacterium tuberculosis, обработанные REF (150 мкг/мл) и SM (300 мкг/мл) в течение 3 месяцев (D4) и Listeria monocytogenes обработанные гентамицином (200 мкг/мл) и ампициллином (500 мкг/мл) в течение 3 недель (Е2). D1 и E1 погружали в кипящую воду на 12 минут для получения мертвых клеток. Клетки во всех образцах, указанных выше, классифицировали как живые клетки, поврежденные клетки и мертвые клетки при одинаковых плотностях клеток при использовании АТФ-способа и измерения эстеразной активности и оценивали как различные состояния бактерий, определенные как живые клетки, поврежденные клетки или мертвые клетки по способу настоящего изобретения примера 6 соотносились с классификацией таких же клеток, определенных при использовании АТФ-способа и эстеразного способа.

(2) Результаты теста и обсуждение

Результаты теста показаны на фиг. 17 и 18. Результаты теста показывают, что при сравнении возможностей различения способа настоящего изобретения и АТФ способа их результаты полностью совпадают один с другим для Mycobacterium tuberculosis и Listeria, тогда как для Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis клетки, определенные при использовании АТФ способа, как находящиеся в состоянии мертвых клеток, были классифицированы как поврежденные клетки и мертвые клетки по способу настоящего изобретения. Таким образом считается, что точное различение поврежденных клеток и мертвых клеток может быть проведено при использовании способа настоящего изобретения с высокой чувствительностью.

Дополнительно, в случае эстеразного способа, эстеразная активность живых клеток Escherichia coli была ниже предела обнаружения, и эстеразная активность клеток Escherichia coli, погруженных в кипящую воду при 100°С на 12 минут и научным образом, определенных как мертвые клетки, была выше, чем предел обнаружения. Таким образом, считается, что сами по себе измерения являлись проблематичными. При сравнении способностей различения способа по настоящему изобретению и эстеразного способа для других бактерий было обнаружено, что результаты для Listeria в основном совпадали один с другим, тогда как клетки Staphylococcus epidermidis и Mycobacterium tuberculosis в состоянии, определенном как мертвые клетки на основе эстразного способа, были классифицированы как два типа состояния, поврежденные клетки и мертвые клетки, согласно способу по настоящему изобретению. Таким образом, считается, что способ по настоящему изобретению более пригоден для точного разделения поврежденных клеток и мертвых клеток.

Пример 8

Детектирование живых клеток в клинических образцах

(1) Получение образцов и способ теста

Гепаринизированную кровь (группа А) отбирали у здоровой человеческой особи и кровью разбавляли в 10 раз суспензию живых клеток Listeria 1,8×10⁶ КОЕ/мл. Суспензию дополнительно последовательно разбавляли кровью для получения крови, инокулированной от 1,8×10³ до 8×10⁷ КОЕ/мл Listeria monocytogenes (живые клетки).

Отбирали каждый образец крови, не инокулированный Listeria (живые клетки), и образец крови, инокулированный Listeria (живые клетки), объемом 1 мл, к каждому образцу крови добавляли 10 мкл водного раствора ЕМА 1000 мкг/мл и смесь поддерживали при 4°С в течение 5 минут при экранировании света. Затем каждый образец облучали видимым светом 500 Вт в течение 5 минут на льду. К каждому образцу добавляли 750 мкл физиологического солевого раствора, 200 мкл раствора липазы 189 ед./мл и 10 мкл раствора дезоксирибонуклеазы 1000 ед./мл и образец поддерживали при 30°С в течение 30 минут. Затем к образцу добавляли 40 мкл протеиназы К 1250 ед./мл и образец поддерживали при 30°С в течение 30 минут. Общий объем указанной выше ЕМА-обработанной крови аккуратно наносили на 2-мл фиколл-пак, предварительно помещенный в полипропиленовую трубку объемом 15 мл, и подвергали центрифугированию при 100×g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость экстрагировали в объеме 1 мл, подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут и надосадочную жидкость удаляли. К остатку добавляли 200 мкл физиологического солевого раствора и 0,6 мкл агента, окрашивающего ядра (SYTO9/PI=1/1), и смесь оставляли при комнатной температуре в течение 15 минут при экранировании света. Затем смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при 4°С и 14000×g в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляли, затем к остатку добавляли 1 мл физиологического солевого раствора, смесь подвергали центрифугированию при охлаждении при тех же условиях и к остатку добавляли 200 мкл физиологического солевого раствора для получения образца для FCM измерения.

Для получения образца для FCM-измерения также параллельно проводили процедуру (обозначаемую как «LNP-FP способ»), сходную с указанным выше способом (обозначаемым как «ЕМА-LNP-FP способ»), за тем исключением, что не проводили ЕМА обработку.

(2) Результаты теста

Результаты теста показаны на Фиг. 19. В способе ЕМА-LNP-FP и способе LNP-FP число точек на графике, отвечающих SYTO9(+) (интенсивность 2×10³ или выше) и PI(-), были пропорциональны концентрации инокулированной Listeria (живые клетки), и предел обнаружения Listeria monocytogenes (живые клетки) в крови считался равным 1,8×10⁴ КОЕ/мл. Дополнительно, поскольку точки контаминантов на графике, соответствующие SYTO9(-)·PI(-), не сдвигались влево при ЕМА обработке, то считалось, что они не представляли собой моноядерные клетки, такие как моноциты и лейкоциты или лимфоциты, носящие название гранулоциты. Поскольку лейкоциты не имеют клеточных стенок, а только клеточные мембраны, ЕМА проникает в них, даже если клетки не повреждены. Дополнительно, поскольку проникающий ЕМА ингибирует повторное лигирование хромосомной ДНК в клетках лейкоцитов при расщеплении и повторном лигировании хромосомной ДНК под действием топоизомеразы II, хромосомная ДНК многократно расщепляется, и такое состояние сохраняется. Таким образом, эффективность интеркалирования SYTO9 в хромосомную ДНК значительно уменьшается, и, в результате, точки на графике значительно смещаются влево. Однако в данном опыте указанное явление не наблюдалось.

Дополнительно, поскольку эритроциты, не содержащие хромосомную ДНК, среди клеток крови имели наиболее высокую удельную плотность, нельзя считать, что они контаминировали надосадочную жидкость даже после центрифугирования с низкой скоростью при использовании фиколл-пака, и в действительности они не давали точек контаминантов на графике при окрашивании SYTO9/PI, сходных с точками данного примера. Более того, поскольку образец обрабатывали липазой, нуклеазой и протеиназой К, липиды и составляющие, остающиеся в крови в небольших количествах, также не могут рассматриваться как элементы контаминантов.

Из вышесказанного, указанные контаминанты рассматриваются как фрагменты расщепления клеточных мембран, образованные при фагоцитозе бактериями Listeria части эритроцитов или гемолиза части эритроцитов. В настоящем примере живые клетки могут быть в определенной степени детектированы, даже если не проводилась ЕМА обработка. Однако размер и сложность внутренней структуры моноядерных клеток, таких как моноциты и лимфоциты, близки к размеру и сложности внутренней структуры бактерий, и они могут демонстрировать интенсивности SYTO9 и PI, сходные с бактериями (живые клетки). Таким образом, при контаминации они могут быть ошибочно определены как живые клетки. Таким образом, с точки зрения точности более предпочтительно проводить ЕМА обработку. Дополнительно, поскольку помимо живых клеток, например, в крови пациентов с сепсисом с нарушениями функции печени, присутствует множество поврежденных клеток, вызванных действием антибиотиков, с точки зрения данного аспекта требуется ЕМА обработка.