СПОСОБ ЗАЩИТЫ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА РАСТЕНИЙ ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к микробиологическим средствам защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами.

Основной ущерб сельскохозяйственным культурам причиняется вирусными, бактериальными и грибными патогенами. Грибы-патогены по вредоносности занимают первое место среди прочих возбудителей заболеваний. Например, эффективное возделывание картофеля ограничивается болезнями: фитофторозным увяданием (Phytophthora infestans), несколькими разновидностями бактериоза (кольцевая гниль, бурая бактериальная гниль (Erwinia carotovora), парша (Pseudomonas marginata)). Возделывание земляники ограничивается заболеваниями: фитофторозом (Phytophthora fragariae), пятнистостью листьев (Mycospharella fragariae), вертициллярным увяданием (Verticillium alboatrum), листовым ожогом (Diplocarpon earliana), серой гнилью (Botrytis cinerea), мучнистой росой (Sphaerotheca humuli).

В современном сельском хозяйстве защита от фитопатогенов достигается различными комплексными подходами. С одной стороны, методами традиционной селекции выводятся сорта, обладающие повышенной устойчивостью к определенным расам грибов. Недостатком классического селекционно-генетического метода является большая продолжительность времени, для получения одного сорта необходимо в среднем 10 лет. За это время патогены могут мутировать, и новый сорт теряет свою устойчивость. С другой стороны, используется способ защиты растений с помощью генетической инженерии. Этот метод позволяет переносить в растения отдельные гены резистентности и получать растения с повышенной устойчивостью к фитопатогенам за более короткие сроки.

Этот метод также имеет ряд недостатков. Применение генно-инженерных технологий позволяет ускорить процесс создания нового сорта растений по сравнению с традиционной селекцией и получить прогнозируемый эффект по определенному признаку. Однако вместе с таким признаком организм приобретает целый набор новых качеств, предсказать которые заранее невозможно из-за несовершенства генно-инженерных технологий. Этот метод предусматривает необходимость тщательной оценки риска и выгоды использования генетически модифицированных (ГМ) растений. В России пока нет разрешения на выращивание ГМ растений.

Наиболее эффективным и экологически чистым методом защиты растений от фитопатогенов может быть использование природных немодифицированных микроорганизмов, которые могут быть антагонистами фитопатогенных грибов и бактерий, а также микроорганизмами, ассоциированными с растениями и оказывающими положительное влияние на их рост и повышение устойчивости за счет синтеза различных метаболитов. Возможность применения микробиологических объектов для защиты растений исследуется уже около 70 лет.

Биологическая защита растений с помощью других организмов называется биологическим контролем фитопатогенов [1].

Известны способы защиты сельскохозяйственных растений путем обработки семян или культивируемых в открытом и закрытом грунте растений препаратами микроорганизмов-антагонистов фитопатогенов таких видов, как Bacillus species, Azotobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Frankia species.

Многие из этих микроорганизмов обитают в ризосфере растений и способны синтезировать регуляторы роста растений (фитогормоны), улучшать фосфорное питание растений, фиксировать атмосферный азот, индуцировать резистентность к фитопатогенам за счет синтеза антибиотиков и сидерофоров. Использование таких штаммов находит широкое применение в современной агробиотехнологии.

Известен способ защиты злаковых культур от грибных возбудителей путем обработки растений порошком, приготовленным путем высушивания культуры Bacillus species. Этот штамм продуцирует комплекс антибиотических веществ и литических ферментов, обуславливающих антагонизм к широкому спектру фитопатогенных грибов (хитиназы, 1-3 глюконазы, антибиотические пептиды). Использование этого препарата позволяет снизить заболевания растений корневыми гнилями и повысить урожай [2].

Известен способ предпосевной обработки семян ризосферным микроорганизмом Azotobacter vinelandii ИБ4. Этот штамм обладает способностью продуцировать цитокинины, проявляя при этом ростстимулирующую активность. Эти свойства позволяют использовать его для борьбы с грибными болезнями пшеницы и фасоли [3].

Известен способ, включающий предпосевную обработку бактериями рода Pseudomonas семян огурцов, капусты и картофеля. Бактерии этого рода обладают способностью синтезировать сидерофоры - желто-зеленые флуоресцирующие водорастворимые пигменты, обладающие ингибирующим действием на фитопатогены и стимулирующим действием на растения [4].

Применение этих методов защиты растений эффективно, но имеет ряд недостатков. Обработка растений микробиологическими препаратами приводит к кратковременным положительным эффектам и требует нескольких обработок растений в период вегетации, поскольку микроорганизмы, используемые в биопрепаратах, не способны установить прочную ассоциативную связь с растениями вследствие конкуренции с другими почвенными микроорганизмами в окружающей среде.

Не всегда достигается положительный эффект защиты растений против болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами, что может быть связано как с потерей жизнеспособности клеток (микроорганизмов), так и с низкой степенью приживаемости полезных микроорганизмов на растениях. Недостаточная эффективность закрепления защитно-стимулирующих веществ на поверхности семян и растений в значительной мере влияет на поражение рассады почвенными фитопатогенами и, в конечном счете, на урожай. Кроме того, возникают необходимость специального оборудования для нанесения препаратов на объекты обработки, а также высокие нормы расхода препаратов и, как следствие, завышенные затраты.

Известно применение штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ51 для защиты пшеницы от заболеваний, вызываемых грибными фитопатогенами. В качестве препарата против заболеваний пшеницы использовали суспензию, полученную при культивировании данного штамма, ею обрабатывали семена пшеницы in vivo. Препарат подавляет развитие заболеваний пшеницы, вызываемых твердой головней и корневыми гнилями [5].

Недостатком метода является его малая эффективность за счет того, что семена обрабатывались в условиях in vivo, т.е. в присутствии других различных микроорганизмов, которые могут препятствовать установлению ассоциативной связи с растением, в случае, если этот штамм является колонизатором. Поэтому в этом случае сложно контролировать степень защиты и ее временной период.

Известен способ микроразмножения растений in vitro, который включает следующие стадии:

1. Стерилизация растительного материала: срезают молодые, полностью развернувшиеся листья, выращенные в теплице, дезинфицируют их, обработав 5% раствором гипохлорита натрия, содержащим 0,5% Твин 20, в течение 10 мин, затем ополаскивают трижды в стерильной дистиллированной воде.

2. Разрезают листья (стебли) на кусочки длиной 5-10 мм и помещают их на питательную среду МС, содержащую необходимые добавки и регуляторы роста.

3. Инкубируют при 25-29°С, 16-часовом световом дне и освещенности 1000 лк. Придаточные побеги или регенеранты образуются из экспланта через 4 недели.

4. Делят каждую культуру и через 4 недели переносят на ту же среду. Эту процедуру продолжают до получения необходимого числа растений.

5. Укореняют побеги, перенеся их на агаризованную среду МС, содержащую ауксины (например, 1 мг/л нафтилуксусной кислоты).

6. Укоренившиеся побеги пересаживают в почву [6].

Этот метод широко применяется в современной биотехнологии. Он имеет ряд преимуществ перед обычным вегетативным способом:

- быстрый способ размножения, обеспечивающий получение в течение нескольких месяцев тысяч растений, идентичных материнской линии;

- получение здорового посадочного материала, свободного от патогенных микроорганизмов (грибы и бактерии), а также возможность элиминации патогенных форм вирусов и выращивание безвирусного материала;

- отсутствие сезонности в работе и возможность производства посадочного материала в любое время года;

- экономия значительных площадей и ресурсов, которые обычно требуются для выращивания и поддержания здорового маточного материала;

- для многих видов растений - возможность консервации избыточно произведенного посадочного материала;

- минимальные требования к производственным площадям и количеству квалифицированного персонала.

Недостатком метода является то, что обычно микроразмноженные in vitro растения при переносе в естественные условия роста не имеют «иммунитета» и часто не способны противостоять фитопатогенам и неблагоприятным условиям внешней среды.

Известен способ микробной колонизации растений табака, пшеницы, льна, картофеля штаммами метилобактерий Methylovorus mays и метанотрофными бактериями Methyomonas methanica in vitro, который заключается в том, что 15-дневные черенки стерильных растений табака, выращенных в культуре in vitro на агаризованной питательной среде, инокулировали бактериальными штаммами. Для этого штаммы метило- или метанобактерий выращивали в течение ночи в жидкой среде Канеда [7] на качалке (180 об/мин) при комнатной температуре. Полученную суспензию разводили до концентрации 10³-10⁶ клеток на мл и наносили стерильной кисточкой на листья стерильных растений табака. Растения инкубировали при 22-24°С в термальной комнате. Через каждые три недели растения черенковали, пересаживали на свежие среды и тестировали на наличие ассоциативности микроорганизмов с растениями.

Содержание клеток в листьях составляет 1-3 тыс. колониеобразующих единиц на 1 см². При последующих размножениях ассоциативные микроорганизмы сохраняются в межклетниках растений и участвуют в метаболизме растений как симбионты, поставляя растениям регуляторы роста, витамины, полисахариды и другие полезные соединения. Это указывает на прочную ассоциативную связь бактерий с растениями. Наличие ассоциативной связи используемых микроорганизмов с растениями оказывало положительное влияние на рост и морфогенез растений [7].

В этой работе не показана возможность влияния такой колонизации на повышение устойчивости растений к фитопатогенам.

Задачей предлагаемого изобретения являлось создание способа защиты посадочного материала растений от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами.

Технический эффект, который может быть получен при использовании предлагаемого изобретения, заключается в том, что он обеспечивает повышение устойчивости растений к фитопатогенам.

Это происходит за счет получения стабильной ассоциации "целевой микроорганизм-растение".

Поставленная задача решается тем, что посадочный материал культивируемых in vitro растений колонизируют штаммом бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM B-2188 Д.

Оптимальными условиями достижения технического результата являются:

- использование микроклонально размноженных гнотобиотических растений;

- использование для колонизации облигатных микроорганизмов, не обладающих фитотоксическим действием;

- использование ассоциативных непатогенных микроорганизмов для колонизации с титром клеток 10³-10⁵.

Следует обратить внимание на то, что для колонизации in vitro важно использовать именно облигатные штаммы, поскольку они не конкурируют с растениями за источники питания.

Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2188 Д. депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Указанный штамм был выделен и определен до вида в 1992 г. Описание штамма представлено в работе [8].

Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM B-2188 Д не патогенен для теплокровных животных и человека, не обладает фитотоксическим действием, отличается способностью растворять труднодоступные фосфаты, выделять физиологические активные вещества и соединения, обладающие фунгистатическим действием.

Ранее штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM B-2188 Д был использован для разработки биопрепарата Псевдобактерин-2, который допущен к использованию на территории Российской Федерации в качестве средства защиты растений [8].

Штамм Pseudomonas aureofaciens ВS1393 выращивают на среде LB, содержащей 10 г бактотриптона (Difco, США), 5 г дрожжевого экстракта (Difco), 10 г NaCl, воды дистиллированной до 1 л, рН 7.5. При исследовании антагонистических свойств штамма по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям использовали глюкозо-картофельный агар (20% глюкозы, экстракционная вытяжка из 70 г картофеля, дистиллированная вода до 300 мл, агар 20 г/л, рН 7,2), а также среды Кинга В [9] и М9 с глюкозой [10].

Основным отличительным признаком используемого штамма является его способность подавлять рост фитопатогенных грибов и бактерий. Результаты исследований представлены в Таблицах 1 и 2.

Штамм подавляет рост грибов Gaeumannomyces graminis, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Fusarium heterosporum, Fusarium culmorum, Fusarium nivale, Sclerotinia sclerotiorum, Rhyzoctonia solani, Rhizoctonia abemoldii, Rhizoctonia cerealis, Pythium altum, Bipolaris sorokiniana, Verticillium dahliae, Verticillium alboatrum, Altemaria solani, Altemaria brassicicola, Helminthosporium sativum, Helminthosporium avenae, Colletotrichum lagenarium, Botrytis cinerea (Таблица 1). Это выражалось в наличии вокруг лунок с бактериями зоны полного отсутствия роста грибного мицелия (стерильная зона), или очень слабого подроста в зоне задержки грибного роста (подавление роста). Диаметр зоны ингибирования грибов варьирует в пределах 10-21 мм.

Кроме того, используемый штамм подавляет рост фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora, Erwinia atroseptica, Erwinia amilovora, Xanthomonas campestris, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens (Таблица 2).

Представленные в таблицах результаты показывают, что способность штамма Pseudomonas aureofaciens BKM B-2188 Д ингибировать развитие широкого круга почвенных фитопатогенов может быть использована для биологической защиты растений от широкого круга заболеваний, вызываемых этими фитопатогенами.

Для проверки устойчивости колонизированных растений к фитопатогенным микроорганизмам проводили искусственное заражение растений патогенными бактериями и грибами.

К исследуемым патогенам относятся: бактериальный штамм эрвиний (Erwinia carotovora В 15), грибные патогены - склеротиния (Sclerotinia sclerotiorum) и фитофтора (Phytophthora infestans).

Возможность осуществления предлагаемого способа подтверждается представленными примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1.

Культивирование и микроклональное размножение гнотобиотических растений картофеля проводят на агаризованной безгормональной среде Мурасига - Скуга (МС) [11], содержащей стандартный набор солей и включающей 7 г/л агара и 30 г/л сахарозы (рН 5,8). Растения выращивают при температуре 22-24°С, 16-часовом дне и освещении 2 клк в прозрачных сосудах. Черенкование растений проводят 1 раз в месяц.

Для этого растение картофеля высотой 15-20 см делят на 4 части, оставляя на стебле 1-2 листа с междоузлиями и рассаживают в пробирки. Через месяц проводят очередное черенкование и таким образом растения размножают до нужного количества. Затем микроразмноженный in vitro посадочный материал из пробирок высаживают в закрытый грунт в условия in vivo для адаптации. Через 2 недели, когда растения укоренятся, их пересаживают в почву для продолжения вегетации.

Пример 2. Черенкование растений, размножаемых мутовками, в частности землянику, проводят 1 раз в месяц. Культивирование проводят на агаризованной безгормональной среде МС. Образовавшиеся мутовки разъединяют, листья укорачивают, удаляя при этом корни и боковые листья, затем помещают каждую мутовку в отдельную пробирку. Коэффициент микроразмножения составляет 4.

Пример 3. Для колонизации используют 15-дневные черенки стерильных растений картофеля и земляники, выращенных в культуре in vitro, как описано в примерах 1, 2.

Черенки однократно опрыскивают суспензией бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2188 Д с титром клеток 10³-10⁵. Через 4 недели после черенкования проводят тестирование на установление ассоциативной связи бактерий с растениями. Для этого из разных эксплантов (вновь выросших листьев, корней, стеблей) получают экстракты путем гомогенизации растительной ткани. Экстракт наносят на поверхность питательной среды LB в чашках Петри и инкубируют при температуре 22-24°С два дня.

Содержание бактерий в листьях в первом пассаже микроразмножения составляет 1-3 тыс. колониеобразующих единиц на 1 см², а в корнях 10-20 тыс. колониеобразующих единиц на 1 см², что указывает на ризосферную специфичность штамма.

В последующих пассажах микроразмножения содержание бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2188 Д в растительных эксплантах стабильно сохраняется.

Пример 4. Проверка устойчивости колонизированных растений к бактериальным фитопатогенным микроорганизмам.

Штамм Erwinia carotovora В15 выращивают в LB среде до плотности 10⁶ кл/мл и используют для инфицирования отдельных листьев и целых растений. Заражение отдельных листьев растений проводят методом укола иглой, смоченной в суспензии бактерий. Листья инкубируют в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при температуре 22-24°С.

Степень повреждения оценивают спустя 1-14 сут после заражения. Уже через сутки на контрольных листьях отмечается разрушение ткани мезофила. К концу вторых суток поражение контрольных листьев составляет 100% по площади. В то время как колонизированные листья остаются без признаков повреждения. Аналогичные симптомы наблюдаются при заражении целых растений. Колонизированные растения остаются неповрежденными в течение всего времени эксперимента, в то время как контрольные полностью сгнивают.

Пример 5. Проверка устойчивости колонизированных растений к грибным фитопатогенным микроорганизмам.

Фитопатогенные грибы для тестирования растений выращивают на глюкозо-картофельном агаре. Культуру грибов поддерживают при +4°С. Для определения устойчивости колонизированных растений к заражению грибными патогенами Sclerotinia sclerotiorum и Phytophthora infestans берут как целые растения, так и отдельные листья.

Для отдельных листьев используют метод заражения в чашках Петри. Заражение отдельных листьев растений проводят, помещая кусочки агара с мицелием на срез черешка листа. Листья инкубируют в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при температуре 22-24°С. Степень повреждения оценивают спустя месяц после заражения. Уже в первые дни эксперимента на неколонизированных листьях заметны признаки поражения - темные некротические пятна и в дальнейшем полная гибель.

У колонизированных листьев таких признаков нет, они остаются полностью здоровыми и неповрежденными.

Целые растения заражают грибами, помещая кусочки мицелия гриба в междоузлия листьев. Растения выращивают при температуре 22-24°С. Уже через неделю на контрольных листьях заметен некроз ткани. К концу второй недели поражение контрольных растений составляет 50% по площади, в то время как колонизированные растения остаются без признаков повреждения.

В течение 15-20 сут неколонизированные растения погибают от воздействия патогена, а колонизированные проявляют устойчивость.

Тестирование проростков in vitro на устойчивость к исследуемым патогенам показало их значительную устойчивость по сравнению с неколонизированными проростками. При пересадке колонизированных проростков из пробирок в грунт теплицы происходит их быстрая приживаемость в корневой зоне, активное развитие растений и устойчивость их к почвенным фитопатогенам за счет развития в тканях растений ассоциативных бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2188 Д.

На основании полученных результатов показано, что колонизация растений на стадии in vitro штаммом бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2188 Д способствует получению стабильной ассоциации микроорганизмов с растениями.

Таким образом, задача решалась путем использования комбинированного метода микробной колонизации и микроразмножения растений in vitro.

Метод колонизации растений in vitro благоприятствует образованию стабильной ассоциативной системы «растение-микроорганизм» в условиях отсутствия конкуренции полезной микрофлоры с нежелательными почвенными микроорганизмами. Комбинированное использование методов колонизации и микроразмножения in vitro позволяет значительно повысить «иммунитет» растений за счет образования стабильной ассоциативной системы «растение-микроорганизм».

Колонизация растений ассоциативным штаммом Pseudomonas aureofaciens BKM В-2188 Д способствует повышению устойчивости растений к бактериальному и грибному заражению растений.

Способность штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2188 Д стабильно колонизировать растения и одновременно защищать их от фитопатогенов была выявлена в процессе экспериментов по изучению взаимодействия микроорганизмов с растениями.

Заранее невозможно было предположить, что штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2188 Д будет оказывать положительное влияние на повышение устойчивости растений, не оказывая при этом отрицательного влияния на рост и морфогенез, поскольку многие штаммы рода Pseudomonas синтезируют антибиотики, феназины и др. соединения, обладающие токсическим действием на нежную структуру растительных эксплантов.

Штамм Pseudomonas aureofaciens BKM B-2188 Д синтезирует феназин-1-карбоновую кислоту, за счет чего обладает способностью ингибировать развитие широкого круга почвенных фитопатогенов. Синтезируемое ее количество в исследуемом штамме, по-видимому, не достаточно для оказания токсического действия на растения, а наоборот, способствует повышению устойчивости.

Использование бактерий для инокуляции культурных растений является одной из перспективных агротехнологий, которые могут обеспечить растения эффективной защитой от фитопатогенов и тем самым уменьшить использование пестицидов в сельском хозяйстве.

Литература

1. R.James Cook and Kenneth F.Baker. The nature and practice of biological control of plant pathogens. // APS PRESS. The American Phytopathological Society. - 1989. - P.1-133.

2. Мелентьев А.И., Усанов Н.Г., Логинов О.Н. Штамм бактерий Bacillus sp.739 для получения препаратов против грибных возбудителей болезней злаковых культур. // Патент РФ №1743019, БИ - №14, - 1994.

3. Barea J.M., Brown M.E. Effects of plant growth produced by Azoto-bacter paspali related to synthesis of plant growth regulating substances // J. Appl. Bacteriol. - 1974. - V.40. - P.583-599.

4. Ермолаева Н.И., Иванова Н.И., Скворцова Н.П. и др. Применение биометода в открытом и защищенном грунте: Использование ризосферных бактерий рода Pseudomonas для предпосевной обработки огурцов, капусты и картофеля. // Защита растений. - 1992. - №8. - С.24-25.

5. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами. // Патент РФ №2203945, БИ - №13, - 2003.

6. Биотехнология растений: культура клеток. Под редакцией Р.Г.Бутенко. М.: Агропромиздат. - 1989. С. - 280.

7. Каляева М.А., Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Захарченко Н.С., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Влияние аэробных метилотрофных бактерий на морфогенез пшеницы мягкой (Triticum aestivum) in vitro. 2003. II Физиология растений. - Т.50, - №3, - с.354-359.

8. Боронин A.M., Кочетков В.В. Эффективный биофунгицид для защиты растений. // АГРО XXI. - 2003. - №1-6, - с.64-66.

9. Е.О.King, М.K.Ward, D.E.Raney. Two simple media for the demonstration ofpyocyanin and fluorescin. // J. Lab. Clin. Med. 1954. - V.44. - P.301-307.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. - 1984. - С.84.

11. Murashige Т., Skooge F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures. // Physiol. Plant. - 1962. - V.15. - P.473-497.

Исследуемый штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2188Д выращивают в жидкой среде LB до плотности 10⁹ кл/мл.

0,1 мл культуры вносят в специально подготовленные лунки на чашки с глюкозо-картофельным агаром, уже содержащим предварительно внесенный мицелий индикаторного фитопатогенного гриба. Чашку инкубируют при комнатной температуре в течение 4-5 суток и визуально регистрируют зоны подавления грибного роста вокруг лунок.

На чашку со средой Кинга В или М9 с глюкозой высевают штрихом штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2188Д и выращивают при 30°С в течение 2-х суток. Затем на поверхность чашки наносят с помощью пульверизатора суспензию клеток (10⁸ кл/мл) индикаторных фитопатогенных бактерий. После инкубирования чашек в течение 24 часов при 30°С визуально регистрируют зоны подавления роста фитопатогенных бактерий вокруг штриха штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2188Д.