Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМОПСИНА, РИБОНУКЛЕАЗЫ И ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ

Известны способы получения химонсина, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы из поджелудочной железы, заключающиеся в ее измельчении, отделении балластных белков высаливанием, фильтровании, высаливании химопсина, активации, обессоливании, стерилизации и лиофилизации. Однако при этом не удается получить рибонуклеазу и дезоксирибонуклеазу в едином технологическом цикле вместе с химопсином.

В предлагаемом способе, в отличие от известных, после отделения белкового сырья для производства дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы осуществляют автолиз и освобождают химопсин от сульфата аммония пропусканием белкового раствора через колонку с катионитом.

Такое ведение процесса позволяет утилизировать отходы производства и повысить выход химопсина.

Пример. 100 кг свежезамороженной поджелудочной железы измельчают, суспендируют в 200 л 0,25 н. серной кислоты в течение 16-l7 час при температуре не выше 5°С. Осадок отделяют центрифугированием и подвергают повторной экстракции. Объединенные экстракты насыщают кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,37, белковую суспензию отфильтровывают и используют для получения дезоксирибонуклеазы.

В фильтрат вновь добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,70, и выделившийся осадок используют для получения химопсина путем автолиза в течение 6 час при 20-25°С. Осадок после автолиза растворяют в трехкратном количестве дистиллированной воды и на каждый литр полученного раствора добавляют 0,587 л насыщенного раствора сульфата аммония. Выделившийся осадок отделяют центрифугированием.

Для высаливания ферментов к измеренному объему центрифугата добавляют 1,1 - кратное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Осадок растворяют в воде и активируют в присутствии ионов кальция при рН 7,6 и комнатной температуре в течение 20-24 час. Затем ионы кальция удаляют высаливанием кристаллическим сульфатом аммония при рН 3,0 в количестве 242 г/л. Из фильтрата после отделения сульфата кальция выделяют химопсин введением дополнительно 202 г/л сульфата аммония.

Для удаления основной массы сульфата аммония в течение 8-10 час проводят диализ, а затем остаток сульфат-ионов удаляют титрованием хлористым барием. Прозрачный раствор после удаления сульфата бария пропускают через колонку с крупнозернистым катионитом KУ-2 или KУ-1 в Н-форме. Катионированный раствор обрабатывают анионитом. ЭДЭ-10П в ОН-форме в количестве 10-30 г/л в течение 30 мин, фильтруют, разбавляют до необходимой концентрации дистиллированной водой, стерильно фильтруют, разливают по флаконам, замораживают и сублимируют.

Фильтрат после выделения белков для получения химопсина насыщают кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,8, оставляют на 36-48 час, фильтруют и используют для получения рибонуклеазы известным способом.

Белковую суспензию, полученную после добавления сульфата аммония до степени насыщения 0,37, смешивают с 230 л дистиллированной воды, подкисленной 1,67 л серной кислоты (уд. вес. 1,87) и охлажденной до 5°С. Перемешивание ведут 1 час, после чего суспензию насыщают кристаллическим сульфатом аммония в количестве 145 г/л. После 30 мин перемешиваний к суспензии добавляют едкий натр до рН 4,5 и оставляют на 48 час.

Надосадочную жидкость сифонируют, а осадок фильтруют через сукно. В прозрачном фильтрате, объединенном с промывными водами, снижают рН до 1,7-1,9 добавлением 5 н. серной кислоты, оставляют на 24 час при 5°С и сифонируют надосадочную жидкость.

Фильтрат с отсифонированной частью раствора насыщают сульфатом аммония в количестве 123 г/л, перемешивают 1 час и оставляют на 48 час при температуре не выше 5°С. Отстоявшуюся прозрачную часть сифонируют и отбрасывают, а осадок суспендируют в двух объемах воды, охлажденной до 2-5°С.

Нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием и отбрасывают, а к прозрачному раствору добавляют насыщенный раствор сульфата аммония в количестве 205 мл/л. Образовавшуюся суспензию отделяют после отстаивания в течение суток на холоду и вновь суспендируют в 10 объемах дистиллированной воды, охлажденной до 2-5°С.

Через 2-3 час белковую суспензию отделяют центрифугированием и отбрасывают осадок. Раствор диализуют против 0,01 н. соляной кислоты в течение двух суток. После обессоливания и определения сухого остатка белковый раствор разбавляют до необходимой концентрации, охлаждают, стерильно фильтруют, разливают во флаконы и сублимируют. Получают 20-30 г дезоксирибонуклеазы, кроме полученных, как это описано выше, 300 г химопсина и 15 г рибонуклеазы.