СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОГО ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИДАНТ/АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к области электрохимических методов анализа, в частности к анализу поверхности биологических тканей (в т.ч. кожи) на предмет определения интегральной оксидант/антиоксидантной активности объекта исследования.

Известен способ оценки антиоксидантного состояния кожи [Международная публикация WO 2007/077360]. Измерения проводят методом вольтамперометрии с использованием рабочего электрода, электрода сравнения и противоэлектрода, помещенных в контактирующий с кожей раствор.

Недостатком этого способа является использование контактирующего с кожей раствора, питающего потенциостата и тока в качестве источника информации. Последний не является однозначной функцией содержания антиоксидантов в объекте исследования. Он зависит, наряду с другими, не поддающимися учету параметрами, также от температуры и состояния поверхности рабочего электрода.

Известен способ определения уровня каротиноидов в поверхностном слое биологических тканей как показателя их антиоксидантного состояния. В основе измерения лежит принцип Рамановской спектроскопии. Световой луч определенной длины волны отражается от молекул каротиноидов, при этом происходит смещение из голубой в зеленую часть спектра [Патент США №6205354].

Недостатком этого метода является то, что он позволяет оценить только антиоксидантную активность, обусловленную каротиноидами, которые являются лишь одним из видов большого количества антиоксидантов, содержащихся, в частности, в коже, то есть их концентрация не позволяет судить об общем содержании антиоксидантов в поверхностном слое биологической ткани.

Наиболее близким техническим решением по способу и устройству, выбранным в качестве прототипа, является способ неинвазивного потенциометрического определения оксидант/антиоксидантной активности биологических тканей, включающий введение исследуемого объекта в контакт с электропроводящим раствором, содержащим Fe(III) или систему I₂/NaI, и оценку оксидант/антиоксидантной активности по изменению потенциалов на электродах, введенных в электропроводящий раствор. Способ реализуют с помощью устройства, включающего прибор для измерения потенциалов, открытую с одной стороны и заполненную электропроводящим раствором емкость с рабочим электродом и электродом сравнения, соединенными с прибором для измерения потенциалов [Международная публикация WO/1996/013193].

Данные способ и устройство имеют следующие недостатки.

Для определения количества оксидантов и антиоксидантов используют разные тестовые растворы, т.е. для определения количества оксидантов и антиоксидантов в исследуемом объекте необходимо проводить два измерения, меняя используемый раствор. В качестве компонента тестового раствора для определения суммарного количества антиоксидантов используют раствор Fe(III) или ADP-Fe(III). Отсутствие восстановленной формы железа в растворе при определении антиоксидантов не позволяет измерить начальный потенциал исследуемой системы. Единственный измеряемый потенциал зависит от ряда неучитываемых факторов поскольку является не равновесным, а стационарным. Использование в качестве источника информации единственного потенциала, определяемого в конце процедуры измерения, вносит неопределенность, связанную с начальным состоянием системы. Результат измерения выражают в виде потенциала, определяемого в конце процедуры измерения. Не оценивается собственно величина активности антиоксидантов, что затрудняет интерпретацию результатов. Используется кислый раствор (рН 2), что травмирует кожу. Исследование включает много стадий: установку устройства на кожу, заполнение его раствором, введение в него электродов и лишь затем измерение.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является повышение достоверности и точности получаемых результатов.

Технический результат, обеспечиваемый настоящим изобретением, заключается в возможности достоверно определять как начальный, так и конечный потенциал измеряемой системы и определять интегральные значения антиоксидантной и оксидантной активности в одном измерении, что повышает точность и достоверность получаемой информации.

Технический результат и решение поставленной задачи достигаются тем, что в качестве электропроводящей среды используется гель, содержащий медиаторную систему, включающую окисленную и восстановленную формы (Ox/Red пара соединений одного и того же элемента). Измерительный электрод непосредственно контактирует с исследуемым объектом через гель, оксидант/антиоксидантную активность рассчитывают, используя разность конечного и начального потенциалов.

, причем

, причем

где ΔЕ - разница между начальным потенциалом системы и значением потенциала, установившегося в конце измерения, C_Ox - концентрация окисленной формы медиаторной системы, М; C_Red - концентрация восстановленной формы медиаторной системы, М; АОА - антиоксидантная активность, мМ-экв; OA - оксидантная активность, мМ-экв.

Технический результат по способу достигается также тем, что изменение разности потенциалов фиксируют от момента установления контакта геля и электрода с исследуемым объектом и до истечения 5-15 мин.

Предлагаемое устройство обеспечивает достижение технического результата тем, что в качестве электропроводящей среды используют гель, а рабочий электрод выполнен в виде пластины, установленной со стороны открытой части емкости и частично перекрывающей ее.

Указанные отличительные признаки существенны.

Медиаторная система, состоящая из пары соединений с химическим элементом в разных степенях окисления обеспечивает возможность окислять все известные антиоксиданты биологических объектов и восстанавливать продукты окисления и гидропероксиды, что позволяет определять интегральные антиоксидантную и оксидантную активности в одном измерении. Кроме того, наличие одновременно двух компонентов медиаторной системы позволяет достоверно определить как начальный, так и конечный потенциал исследуемой системы. Применение геля в качестве электропроводящей среды, заполняющего пространство с электродами, изначально исключает попадание кислорода воздуха в исследуемую систему, что повышает точность определения начального и конечного потенциалов, а выполнение рабочего электрода в виде пластины создает возможность непосредственного контакта электрода с исследуемым объектом через гель.

На фиг.1 изображен общий вид устройства для реализации способа.

На фиг.2 представлен общий вид толстопленочного платинового электрода.

На фиг.3 приведена зависимость потенциала медиаторной системы в геле на поверхности кожи от времени. Время измерения составляет 10 минут. Уменьшение потенциала свидетельствует об антиоксидантной активности объекта.

На фиг.4 приведена зависимость потенциала медиаторной системы в геле на поверхности кожи от времени для случая, когда выражена оксидантная активность. Время измерения составляет 7 минут. Увеличение потенциала свидетельствует об оксидантной активности объекта.

На фиг.5 приведены значения антиоксидантной активности кожи здоровых людей 18-20 лет (n=20).

На фиг.6 приведены результаты определения антиоксидантной активности кожи добровольцев, принимавших орально аскорбиновую кислоту (АК) в количестве 1000 мг. Измерена антиоксидантная активность кожи через 60 и 180 мин после приема.

Реализация способа заключается в следующем.

Электропроводный гель с введенной в него медиаторной системой в виде пары соединений химического элемента в разных степенях окисления K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] наносится на поверхность биологической ткани (кожи человека), на которой размещают также рабочий электрод, который контактирует с гелем, содержащим медиаторную систему. В контакт с гелем вводят электрод сравнения и измеряют изменение потенциала системы с использованием цифрового анализатора. При этом взаимодействие с антиоксидантами кожи описывается следующей схемой:

a·Fe(III)+b·АО(в коже)=a·Fe(II)+b·AO_Ox (в коже),

где АО - антиоксиданты в коже, AO_Ox - продукты окисления антиоксиданта в коже; a, b - стехиометрические коэффициенты реакции.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Электропроводный гель с введенной в него медиаторной системой, содержащей 0,001М K₃[Fe(CN)₆]+0,00001М K₄[Fe(CN)₆], наносится на поверхность кожи человека, на которой размещают также рабочий электрод, который контактирует с указанным гелем. В контакт с гелем вводят электрод сравнения и измеряют начальный потенциал системы, который оказывается равным 281 мВ, значение потенциала, измеренное через 5 минут, составляет 258 мВ. Антиоксидантную активность рассчитывают по формуле:

, причем ,

где ΔЕ - разница между начальным потенциалом системы и значением потенциала, установившегося в конце измерения, C_Ox - концентрация окисленной формы медиаторной системы, М; C_Red - концентрация восстановленной формы медиаторной системы, М; АОА - антиоксидантная активность, мМ-экв.

Концентрацию окисленной и восстановленной форм медиаторной системы определяют известными методами.

Расчет показывает, что для данных значений потенциалов и концентраций АОА равна 1,58·10^-5 М-экв.

Пример 2

В качестве объекта исследования выбрана поверхность кожи человека. Подготовку, измерения и расчет проводят, как в примере 1, но время выдержки между измерениями потенциалов составляет 10 мин. В результате измеренные величины потенциалов составляют E₁=280 мВ, Е₂=255 мВ. В результате расчетов получаем значения АОА=1,80·10^-5 М-экв.

Пример 3

В качестве объекта исследования выбрана поверхность кожи человека. Подготовку, измерения и расчет проводят, как в примере 1, но время выдержки между измерениями потенциалов составляет 15 мин. В результате измеренные величины потенциалов составляют E₁=280 мВ, Е₂=254 мВ. В результате расчетов получаем значения АОА=1,91·10^-5 М-экв.

Пример 4

В качестве объекта исследования выбрана поверхность кожи человека. Подготовку, измерения и расчет проводят, как в примере 1, но время выдержки между измерениями потенциалов составляет 5 мин. В результате измеренные величины потенциалов составляют E₁=280 мВ, Е₂=308 мВ.

Оксидантную активность рассчитывают по формуле:

, причем ,

где ΔЕ - разница между начальным потенциалом системы и значением потенциала, установившегося в конце измерения, C_Ox - концентрация окисленной формы медиаторной системы, М; C_Red - концентрация восстановленной формы медиаторной системы, М; OA - оксидантная активность, мМ-экв.

Расчет показывает, что для данных значений потенциалов и концентраций OA равна 6,88·10^-6 М-экв.

Пример 5

В качестве объекта исследования выбрана поверхность кожи человека. Подготовку, измерения и расчет проводят, как в примере 1, но время выдержки между измерениями потенциалов составляет 10 мин. В результате измеренные величины потенциалов составляют E₁=281 мВ, Е₂=312 мВ. В результате расчетов получаем значения АОА=7,25·10^-6 М-экв.

Способ реализуют с помощью устройства, которое включает рабочий электрод в виде пластины 1, установленной со стороны открытой части емкости 3 и частично перекрывающей ее, электрод сравнения 2 и соединенный с ними прибор для измерения потенциалов 7. На нижнюю часть емкости 3 нанесен клеящий слой 4, а сама емкость заполнена электропроводящим гелем 5. Рабочий электрод 1 и гель 5 контактируют с исследуемым объектом 6.

Пластина рабочего электрода 1 выполнена в виде керамической подложки 8 с контактной зоной платиносодержащего слоя 9 и отделенной от последней изолятором 10 рабочей зоной платиносодержащего слоя 11.

Устройство работает следующим образом.

Рабочий электрод 1 крепится на поверхности биологической ткани, в частности кожи (фиг.1), с помощью клейкого слоя 4. В качестве электрода сравнения 2 используется хлоридсеребряный электрод, вмонтированный в верхнюю часть емкости 3.

Электропроводный гель 5 с введенной в него медиаторной системой заполняет емкость 3 и наносится на поверхность кожи 6. Необходимым условием является нахождение хлоридсеребряного электрода и рабочей зоны платинового электрода в контакте с проводящим гелем.

Окислительное действие кислорода воздуха на медиаторную систему исключается за счет ее изоляции от внешних воздействий клеем 4 и гелем 5.

Установившийся в системе электрический потенциал измеряют с помощью прибора 7.

В качестве рабочего электрода используется толстопленочный платиновый электрод, изготовленный методом трафаретной печати, или любой плоский электрод, потенциал которого определяется составом медиаторной системы.

Окислительное действие кислорода воздуха на медиаторную систему исключается благодаря ее изоляции от внешних воздействий клеящим слоем 4.

Установившийся в системе электрический потенциал измеряют с помощью прибора 3.

Предлагаемые способ и устройство обеспечивают достоверное и точное определение оксидант/антиоксидантного состояния живой биологической ткани.