Результат интеллектуальной деятельности: ЭКСТРАКТ SALIX, ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И КОМПОЗИЦИИ, ЕГО СОДЕРЖАЩИЕ

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к экстракту Salix spp, получаемому с помощью фракционирования на смоле, и к способу его приготовления.

Экстракт изобретения характеризуется высоким содержанием производных салицина, сниженным содержанием высокомолекулярных танинов и содержанием проантоцианидинов, достаточным для ингибирования некоторых тканевых металлопротеаз. Продукт составляют в маслах, богатых ω-3 и ω-6 кислотами, которые обеспечивают лучшее всасывание активных компонентов, а также синергически усиливают их действие.

Уровень техники

Экстракты коры и ветвей различных разновидностей Salix использовались с незапамятных времен для лечения суставных ревматических состояний и подагры. От экстрактов Salix, однако, по существу отказались в конце 19-го века, когда был синтезирован аспирин с помощью ацетилирования салициловой кислоты, получаемой с помощью окисления присутствующих в Salix соединений. Однако аспирин и экстракты Salix имеют существенные различия в отношении механизмов действия и воздействия на костные суставы. Экстракты действуют на фермент COX 2, в то время как аспирин, главным образом, действует на COX 1, что приводит к известным побочным эффектам со стороны желудочно-кишечного тракта и свертывания крови, которые строго ограничивают его длительное применения, которое наоборот является необходимым в случае таких хронических дегенеративных патологий, как артроз и ревматоидный артрит.

Из литературы известно, что экстракты Salix имеют чрезвычайно непостоянное содержание производных салицина, которые составляют в среднем до 15%, и содержание танина в пределах от 8 до 20%. Танины, присутствующие в экстрактах Salix, как и все галлиевые и катехиновые танины, имеют сильное сходство с белками и протеогликанами, которое приводит к повреждениям ткани в случае длительного лечения.

Поэтому имеется потребность в удобном способе, который является легко применимым в промышленности и предоставляет экстракты со стандартизированным содержанием активных компонентов.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения новых экстрактов Salix spp, характеризующихся высоким содержанием производных салицина, сниженным содержанием высокомолекулярных танинов и достаточным для ингибирования некоторых тканевых металлопротеаз содержанием проантоцианидинов.

Неожиданно обнаружено, что экстракция коры или ветвей Salix при соответствующих условиях и определенной очистке получающегося экстракта позволяет получить экстракты с содержанием производных салицина до 50%, содержанием танина не выше 5% и содержанием олигомерных процианидинов выше 5%.

Преимущество использования экстрактов Salix, особенно экстрактов согласно настоящему изобретению по сравнению с только лишь производными салицина связано с присутствием проантоцианидинов, сильных акцепторов радикалов и мощных ингибиторов металлопротеаз, которые активируются в артритических условиях из-за оверэкспрессии лейкоцитарного ИЛ₁.

Способ по изобретению для получения экстрактов Salix отличается от способов из предшествующего уровня техники содержанием в экстракте салицина и его производных и использованием матриц, которые обеспечивают избирательное снижение содержания танина, в то же время сохраняя терапевтически полезные проантоцианидины в экстракте.

Способ по изобретению включает четыре главных стадии:

a) экстракцию ветвей и коры Salix spp соответствующими растворителями, которые делают растворимыми желаемые продукты (общий экстракт);

b) удаление не растворимых в воде (или плохо растворимых) танинов;

c) удаление водорастворимых танинов;

d) увеличение содержания производных салицина посредством очистки на колонке с адсорбционной смолой.

Стадию (a) выполняют с помощью экстракции растительного материала, состоящего из коры и ветвей растения 1-3 атомным спиртом или ацетоном, или смесями этих растворителей, или водных растворов этих растворителей, или только водой. Предпочтительным является 30% в объемном отношении водно-этаноловый раствор.

Температура экстракции может варьировать от 10 до 80°C, предпочтительно составляет 25°C.

Стадия (b) позволяет удалить не растворимые в воде, особенно высокомолекулярные танины из экстракта.

Стадия (c) позволяет удалить большинство водорастворимых танинов из экстракта. Она является необязательной стадией, которая может быть выполнена для удаления любых танинов, все еще присутствующих в экстракте после стадии (b). Эти метаболиты могут быть удалены с помощью использования поливинилполипирролидона (PVPP).

Стадия (d) позволяет фракционировать экстракт с удалением наиболее бесполезных метаболитов (сахаров и т.п.), в то же время сохраняя желаемые второстепенные метаболиты, то есть производные салицина и олигомерные проантоцианидины. Эта стадия заключается в хроматографическом разделении посредством адсорбции на полимерной смоле. Примерами соответствующих смол для этой цели являются смолы Styrene-DVB, такие как AmberliteHP20^® или Rohm and Haas XAD1180^®, и акриловые смолы, такие как Rohm and Haas XAD7HP^®.

Во время стадии фракционирования на колонке с использованием соответствующих смесей растворителей свободный салицин может быть отделен от его производных с получением фракций, богатых свободным салицином со сниженными количествами его производных и фракций с полностью различными составами.

Общий экстракт, полученный из коры и ветвей Salix с 30% этанолом, выпаривают до сухого остатка в пределах от 5 до 50% вес/вес, предпочтительно 25% вес/вес, и оставляют при температуре от 1 до 20°C, предпочтительно при 4°C, не перемешивая в течение времени от 1 часа до 24 часов, предпочтительно 16 часов.

Полученную суспензию центрифугируют при 4°C для удаления остаточного осадка, содержащего высокомолекулярные производные и танины, из очищенного водного раствора.

Содержащиеся в общем экстракте не растворимые в воде или плохо растворимые танины удаляют с помощью водной очистки, которая может быть дополнительно улучшена с помощью необязательной обработки (стадия c) поливинилполипирролидоном (PVPP). Частичная водная очистка (стадия b) может удалить только часть танинов (около 50% вес/вес присутствующих танинов), в то время как очистка PVPP удаляет остаточные танины в пределах значений ниже 5% конечной массы экстракта.

Поэтому очищенный водный раствор после стадии b) обрабатывают PVPP (от 1 до 50% вес/вес, предпочтительно 1:30, наиболее предпочтительно 1:20 в расчете на сухой остаток водного экстракта для обработки), непрерывно перемешивая в течение 1 или более часов.

Раствор фильтруют от PVPP и адсорбированных танинов. Затем водный раствор адсорбируют на смоле, тщательно промывая субстрат водой для удаления нежелательных растворимых веществ. Незадержанный раствор удаляют.

Продукт элюируют водно-спиртовым раствором (1-3 атомные спирты, предпочтительно этанол), с содержанием воды в пределах от 50% объем/объем до 0% объем/объем, предпочтительно 10% объем/объем. В качестве альтернативы также может использоваться водно-ацетоновый раствор с содержанием воды в пределах от 50% объем/объем до 0% объем/объем, предпочтительно 10% объем/объем. Водно-этаноловый раствор выпаривают до сухого состояния или распыляют. Полученный экстракт может быть приготовлен в обычных фармацевтических твердых формах или как масляная суспензия в капсулах, особенно в маслах, богатых ω-3/ω-6 полиненасыщенными жирными кислотами; особенно предпочтительными являются масло Enothera biennis и рыбий жир и его производные.

Активные дозировки для лечения артроза и ревматоидного артрита у людей варьируют от 100 до 1000 мг ежедневно, соответственно тяжести заболевания, в отношении которого проводится лечение.

Изобретение подробно описано в следующих примерах.

Пример 1

Экстракция ветвей и коры Salix водно-этаноловым раствором (стадия a).

На этой стадии получают общий экстракт, который может использоваться как стартовый материал для последующего разделения при помощи колоночной хроматографии.

1000 грамм ветвей и коры Salix заливают 1,5 литрами 30% объем/объем этанола при 20°C на 4 часа в статическом перколяторе. Спустя 4 часа перколят извлекают и снова экстрагируют 6 раз при тех же самых условиях, но с использованием 1 литра растворителя на экстракцию для получения приблизительно 7 литров общего перколята. Объединенные перколяты фильтруют для удаления примесей и растительных остатков. Этот раствор (продукт 1) имеет общий сухой остаток 154 грамма, выход по отношению к стартовому материалу составляет 15,4% вес/вес.

Определенное HPLC содержание свободного салицина составляет 4,63%; определенное HPLC содержание общего салицина составляет 15,4% вес/вес. Содержание танина составляет 16,26% вес/вес.

Пример 2

Экстракция ветвей и коры Salix водно-ацетоновым раствором (стадия a).

На этой стадии получают общий экстракт, который может использоваться как стартовый материал для последующего разделения при помощи колоночной хроматографии.

1000 грамм ветвей и коры Salix экстрагируют 1,5 литрами 80% объем/объем ацетона при 20°C в течение 4 часов в статическом перколяторе. Спустя 4 часа перколят извлекают и снова экстрагируют 6 раз при тех же самых условиях, но с использованием 1 литра растворителя на экстракцию для получения приблизительно 7 литров общего перколята. Объединенные перколяты фильтруют горячей фильтрацией и упаривают с помощью роторного испарителя при 60°C при сниженном давлении. Этот экстракт имеет общий сухой остаток 143 грамма, выход по отношению к стартовому материалу составляет 14,3% вес/вес.

Определенное HPLC содержание свободного салицина составляет 4,3%; определенное HPLC содержание общего салицина составляет 15,7% вес/вес. Содержание танина составляет 15,42% вес/вес.

Пример 3

Экстракция ветвей и коры Salix водой (стадия a).

На этой стадии получают общий экстракт, который может использоваться как стартовый материал для последующего разделения при помощи колоночной хроматографии.

1000 грамм маленьких ветвей и коры Salix заливают 1,5 литрами воды при 20°C на 4 часа в статическом перколяторе. Спустя 4 часа перколят извлекают и снова экстрагируют 6 раз при тех же самых условиях, но с использованием 1 литра растворителя на экстракцию для получения приблизительно 7 литров общего перколята. Объединенные перколяты фильтруют со всасыванием и упаривают с помощью роторного испарителя при 60°C при сниженном давлении. Этот экстракт имеет общий сухой остаток 167 грамм, выход по отношению к стартовому материалу составляет 16,7% вес/вес.

Определенное HPLC содержание свободного салицина составляет 3,94%; определенное HPLC содержание общего салицина составляет 13,6% вес/вес. Содержание танина составляет 6,8% вес/вес.

Пример 4

Экстракция ветвей и коры Salix метанолом (стадия a).

На этой стадии получают общий экстракт, который может использоваться как стартовый материал для последующего разделения при помощи колоночной хроматографии.

1000 грамм ветвей и коры Salix заливают 1,5 литрами метанола при 20°C на 4 часа в статическом перколяторе. Спустя 4 часа перколят извлекают и снова экстрагируют 6 раз при тех же самых условиях, но с использованием 1 литра растворителя на экстракцию для получения приблизительно 7 литров общего перколята. Объединенные перколяты фильтруют и упаривают с помощью роторного испарителя при 60°C при сниженном давлении. Этот экстракт имеет общий сухой остаток 101 грамм, выход по отношению к стартовому материалу составляет 10,1% вес/вес.

Определенное HPLC содержание свободного салицина составляет 5,9%; определенное HPLC содержание общего салицина составляет 19,9% вес/вес. Содержание танина составляет 14,5% вес/вес.

Пример 5

Очистка экстракта ветвей и коры Salix (стадия b): удаление нерастворимых в воде веществ.

Раствор 1, полученный в конце отработки, описанной в Примере 1 (стадия a), упаривают с помощью роторного испарителя при 60°C при сниженном давлении для получения водной суспензии с сухим остатком 25% вес/вес общей водной суспензии, общий вес вышеуказанного раствора составляет 615 г.

Получающуюся водную суспензию охлаждают при 4°C и оставляют в этих условиях на 16 часов, затем все еще холодную водную суспензию центрифугируют при 3000 g в течение 20 минут для отделения осажденного остатка от очищенного водного раствора. Этот осадок, имеющий сухой остаток 16,3 г, является богатым танинами и высокомолекулярными продуктами и удаляется.

Получающийся очищенный раствор (раствор 2) имеет сухой остаток, эквивалентный 137 г частично очищенного экстракта, имеющего определенное HPLC содержание свободного салицина 5,0% и определенное HPLC содержание общего салицина 16,7% вес/вес. Содержание танина составляет 6,9% вес/вес.

Весовой выход по отношению к стартовому материалу составляет 13,7% вес/вес.

Пример 6

Очистка экстракта ветвей и коры Salix (стадия c).

Очищенный водный раствор, полученный в конце способа частичной очистки стадии b (Пример 5, раствор 2), имеющий сухой остаток 137 г, обрабатывают для удаления водорастворимых танинов.

К раствору добавляют 14 г PVPP, соответствующие приблизительно 10% вес/вес сухого остатка экстракта для обработки. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре PVPP отделяют от раствора с помощью центрифугирования.

Полученный раствор (раствор 3) имеет сухой остаток, эквивалентный 125 г частично очищенного экстракта, имеющего определенное HPLC содержание свободного салицина 5,3% и определенное HPLC содержание общего салицина 8% вес/вес. Содержание танина составляет 1,2% вес/вес.

Весовой выход по отношению к стартовому материалу составляет 12,5% вес/вес.

Пример 7

Хроматографическая очистка экстракта ветвей и коры Salix (стадия d).

Водный раствор, полученный на стадии c (Пример 6, раствор 3), загружают в хроматографическую колонку, содержащую 1250 мл смолы Rohm and Haas XAD1180^®, увлажненной водой. Водно-спиртовой раствор адсорбируется на смоле, в то время как незадержанный раствор, выходящий из колонки, удаляют. Затем смолу промывают 1,25 литрами воды, также удаляя этот раствор, поскольку содержание желаемых компонентов в нем незначительно. Эти удаляемые водные растворы (продукт 1) фактически имеют общий сухой остаток 52,6 г, с определенным HPLC содержанием свободного салицина 0,87%, и определенным HPLC содержанием общего салицина 0,92% вес/вес.

Колонку элюируют 3,75 литрами 90% объем/объем водного этанола. Получающийся элюат извлекают и высушивают при 60°C при сниженном давлении для производства 72,4 грамма сухого продукта (продукт 2), что соответствует выходу по отношению к стартовому материалу 7,2% вес/вес. Определенное HPLC содержание свободного салицина составляет 8,95%, определенное HPLC содержание общего салицина составляет 30,0% вес/вес. Содержание олигомерных проантоцианидинов составляет 11,2% вес/вес, содержание танинов составляет 2,1% вес/вес.

Пример 8

Хроматографическая очистка экстракта ветвей и коры Salix (стадия d) и отделение свободного салицина от его производных.

Водный раствор, полученный на стадии c (Пример 6, раствор 3), загружают в хроматографическую колонку, содержащую 1250 мл смолы Rohm and Haas XAD1180^®, увлажненной водой. Водно-спиртовой раствор адсорбируется на смоле, в то время как незадержанный раствор, выходящий из колонки, удаляют. Затем смолу промывают 1,25 литрами воды, также удаляя этот раствор, поскольку содержание желаемых компонентов в нем незначительно. Эти удаляемые водные растворы (продукт 3) фактически имеют общий сухой остаток 51,7 г, с определенным HPLC содержанием свободного салицина 1,34% и определенным HPLC содержанием общего салицина 1,41% вес/вес.

Смолу промывают 2,5 литрами 10% объем/объем водного этанола для получения раствора (продукт 4) с сухим остатком 17,1 г (выход по отношению к стартовому материалу 1,7% вес/вес). Определенное HPLC содержание свободного салицина составляет 34,6%, определенное HPLC содержание общего салицина составляет 34,9% вес/вес.

Колонку элюируют 3,75 литрами 90% объем/объем водного этанола. Получающийся элюат извлекают и высушивают при 60°C при сниженном давлении, для производства 43,2 грамм сухого продукта (продукт 5), что соответствует весовому выходу по отношению к стартовому материалу 4,3% вес/вес. Определенное HPLC содержание свободного салицина составляет 0,45%, определенное HPLC содержание общего салицина составляет 39,7% вес/вес.

Пример 9

Состав экстракта в мягких желатиновых капсулах.

Состав экстракта Salix rubra в масляной суспензии для мягких желатиновых капсул.

Композиция стандартной формы:

Экстракт Salix rubra согласно Примеру 7 250 мг

Глицерил моностеарат 30 мг

Соевый лецитин 10 мг

Масло Enothera biennis q.s. до 700 мг

Приготовление.

1) Нагреть масло Enothera biennis до приблизительно 70°C и, перемешивая, растапливать в нем глицерил моностеарат.

2) Добавить соевый лецитин к получающемуся раствору.

3) Диспергировать экстракт Salix rubra в получающемся растворе, способствуя гомогенному распределению с помощью соответствующей перемешивающей системы. Перемешивая, постепенно охладить получающийся раствор.