Результат интеллектуальной деятельности: ДИГИДРОХЛОРИД 1-(3-МОРФОЛИНОПРОПИЛ)-2-ФЕНИЛИМИДАЗО[1,2-a]-БЕНЗИМИДАЗОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВА АНТАГОНИСТА ПУРИНОВЫХ P2Y-РЕЦЕПТОРОВ, АНТИАГРЕГАНТНУЮ И АНТИТРОМБОТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

Изобретение относится к новому 1,2-дизамещенному имидазо[1,2-а]бензимидазола, а именно к водорастворимому дигидрохлориду 1-(3-морфолинонопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I:

,

проявляющему P2Y₁-антагонистические, антиагрегантные и антитромботические свойства, который может стать основой для создания лекарственного препарата для терапии заболеваний, сопровождающихся увеличением тромбогенного потенциала крови: атеросклероза, ишемической болезни сердца, диабетической ангиопатии.

Нарушения регуляции функциональной активности тромбоцитов, ведущие к увеличению тромбогенного потенциала крови, могут быть причиной тромбоэмболии сосудов головного мозга, легких, почек (Духанин А.С., Губаева Ф.Р. Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1998. - №4. - С.66-71; Суслина З.А., Танашян М.М. Антиагрегантная терапия при ишемических цереброваскулярных заболеваниях: пособие для практикующих врачей. - М.: Медицина, 2003. - 268 с.). Показано участие тромбоцитарного звена в патогенезе заболеваний, сопровождающиеся диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови, а также атеросклероза (Панченко Е.П. Концепция атеротромбоза - основа патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний. Основные направления антитромботической терапии // Рус. мед. журн. - 2005. - Т.13, №7. - С.433-438), ишемической болезни сердца (Лупанов В.П. Применение ацетилсалициловой кислоты с целью вторичной профилактики коронарной болезни сердца // Рус.мед. журн. - 2005. - Т.13, №15. - С.1053-1056), диабетической ангиопатии (Балаболкин М.И. Диабетология. - М., 2000. - 672 с.).

В настоящий момент установлено, что на мембране тромбоцитов имеются три подтипа пуринорецепторов: P2X₁, P2Y₁ и P2Y₁₂. P2Y₁-рецепторы, которые играют ключевую роль в тромбообразовании и представляют собой мишень для создания препаратов, препятствующих реализации данного процесса на стадии обратимой агрегации тромбоцитов для терапии ряда заболеваний, сопровождающихся увеличением тромбогенного потенциала крови (Kunapuli S.P. Multiple P2 receptor subtypes on platelets: A new interpritation of their function // Trends Pharmacol. Sci. - 1998. - V.19. - P.391-394). В настоящее время в клинической практике препаратов с подобным механизмом действия нет, однако используются антиагреганты - блокаторы P2Y₁₂-рецепторов: тиклопидин и клопидогрель (Регистр лекарственных средств России. РЛС Энциклопедия лекарств. Выпуск 15. - Издательство: РЛС-2007. - 2006. - С.1488).

Препаратом сравнения выбран тиклопидин. Его основными побочными эффектами являются тромбоцитопеническая пурпура, лейкоцитоз, агранулоцитоз (Quinn M.J., Fitzgerald D.J. Ticlopidine and clopidogrel // Circulation. - 1999. - V.100. - P.1667-1672), что требует обязательного лабораторного контроля и представляет потенциальную угрозу для жизни больного (Аверков О.В., Атарщикова М.В. Антитромботические средства и чрескожные коронарные вмешательства: спорные вопросы применения клопидогреля // Фарматека. - 2004. - №14. - С.32-38). К другим побочным эффектам относятся желудочно-кишечные кровотечения, кожная сыпь, диарея, диспептические расстройства, тошнота, гастрит, нарушения функции печени (Yim H.B., Lieu P.K., Choo P.W. Ticlopidine induced cholestatic jaundice // Singapure Med. J. - 1997. - V.38. - P.132-133; Skurnik Y.D. et al. Ticlopidine-induced cholestatic hepatitis // Ann. Pharmacother. - 2003. - V.37. - P.371-375). Слабым местом препарата является его фармакокинетика, а именно достаточно позднее развитие основного антитромбоцитарного действия, что связано с биотрансформацией исходного вещества в печени с участием цитохрома С450 до активных метаболитов (Savi P. et al. The antiaggregating activity of clopidogrel is due to a metabolic activation by the hepatic cytochrome P450-1A // Thromb. Haemostasis. - 1994. - V.72. - P.313-317). Для достижения полного эффекта при использовании стандартного режима дозирования (250 мг 2 раза в день) требуется от нескольких дней до 2 недель (Аверков О.В., Атарщикова М.В. Антитромботические средства и чрескожные коронарные вмешательства: спорные вопросы применения клопидогреля // Фарматека. - 2004. - №14. - С.32-38).

Таким образом, поиск новых безопасных и высокоэффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов являются актуальными для современной медицины.

Наиболее близким по структуре является дигидрохлорид 1-(2-морфолиноэтил)-2-трет-бутилимидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющий в том числе антиагрегантную активность (патент США №5639756, C07D 487/00, 1987 г.).

В ряду 1,2-дизамещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола неизвестны соединения, проявляющие одновременно свойства антагонистов пуриновых P2Y₁-рецепторов, антитромботическую и антиагрегантную активность.

Техническим результатом изобретения является новое соединение в ряду 1,2-дизамещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющее наряду с антиагрегантной активностью новые для данного ряда свойства, а именно P2Y₁-антагонистическую и антитромботическую активность.

Технический результат изобретения достигается дигидрохлоридом 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I.

Синтез соединения заключается во взаимодействии гидрохлорида 1-(3-хлорпропил) - (способ А) или гидробромида 1-(3-бромпропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола (способ Б) с морфолином. Можно также получить это соединение в результате реакций 1-фенацил-2-хлорбензимидазола (способ В) или 1-фенацилбензимидазол-2-сульфокислоты (способ Г) с 3-морфолинопропиламином. Полученное одним из этих способов основание затем переводят в водорастворимый дигидрохлорид I обычными методами, используя концентрированную HCl или ее растворы в изопропиловом спирте или эфире.

Ниже приведены методики синтезов предлагаемого соединения:

Пример. Дигидрохлорид 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола (I).

А. Смесь 3,46 г (10 ммоль) гидрохлорида 2-фенил-1-(3-хлорпропил)-имидазо[1,2-а]бензимидазола (Анисимова В.А., Спасов А.А., Левченко М.В., Александрова Е.А.. Хим.-фарм. ж., 1995, №10, с.18) и 10 мл морфолина кипятят 4 ч. Охлаждают, выливают в воду и экстрагируют хлороформом. Экстракт пропускают через слой оксида алюминия, элюируя 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазол хлороформом. После упаривания элюата остается густое масло (3,2 г, 88,9%), которое обрабатывают эфирным раствором HCl. Выпавший белоснежный осадок дигидрата дигидрохлорида отфильтровывают, сушат при 110°С. Выход 3,4 г (88,5%). Т.пл. 180-181°С (разл., из спирта).

Найдено, %: С 56,7; Н 6,5; Cl 15,2; N 12,1.

C₂₂H₂₄N₄O·2 HCl·2 H₂O.

Вычислено, %: С 56,3; Н 6,4; Cl 15,1; N 11,9.

Спектр ПМР (DMSO-d₆+CCl₄), δ, м.д.: 2,94 (2Н, кв., СН₂ СН ₂СН₂); 3,17 (4Н, т., O(СН₂)₂); 3,26 (2Н, т., NCH₂); 3,95 (4Н, т., N(CH₂)₂); 4,40 (2Н, т., N_ArCH₂); 7,30-7,75 (8Н, м., H_Ar); 7,90 (1Н, д., 6-Н); 8,04 (1Н, д., 7-Н); 8,28 (1Н, с., 3-Н); N⁺H в обмене.

ИК-спектр (вазел. масло), см^-1: 1660 (C=N⁺<), 2500-2730 (N⁺H, широкая полоса), 3200-3470 (N⁺Н, широкая полоса).

Б. Кипятят 2,93 г (7,5 ммоль) гидробромида 2-(3-гидроксипропиламино)-1-фенацилбензимидазола (Анисимова В.А., Спасов А.А., Левченко М.В., Александрова Е.А. Хим.-фарм. ж., 1995, №10, с.18) в 30 мл 48% HBr (т.кип. 127°С) 5-6 ч. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. Получают 3,0-3,16 г (92-97%) практически чистого гигроскопичного гидробромида 1-(3-бромпропил)-2-фенилимидазо [1,2-а]бензимидазола. Вода теряется при высушивании соли при 110-115°С. Белоснежные блестящие иголочки, т.пл. 213-214°С (разл., этанола).

Найдено, %: С 49,5; Н 3,8; Br 36,8; N 9,9.

C₁₈H₁₆BrN₃·HBr.

Вычислено, %: С 49,7; Н 3,9; Br 36,7; N 9,7.

Спектр ¹Н ЯМР (DMSO-d₆ - CCl₄), δ, м.д.: 2,31 (2Н, кв., J₁ 13,77, J₂ 7,25, -CH₂-); 3,46 (2Н, т., J 6,37, CH₂Br); 4,48 (2Н, т., J 4,48, NCH₂); 7,38-7,65 (7H, м., H_Ar); 7,78 (1Н, д., J 4,44, 6-Н); 8,10 (1Н, м., J 3,95, 7-Н); 8,38 (1Н, с, 3-Н); N⁺Н в обмене.

ИК-спектр (вазелин, масло), см^-1: 1500, 1595, 1605 (С=С), 1665 (С=N⁺<).

Смесь 1,3 г (3 ммоль) полученного гидробромида 1-бромпропил-замещенного и 5 мл морфолина кипятят 1-1,5 ч. Морфолин испаряют, остаток обрабатывают водой, осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат на воздухе, получая 0,86-0,92 г (79,9-85,4%) основания 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола. После кристаллизации из изооктана и высушивании при 75-80°С т.пл. его 107-108°С.

Найдено, %: С 73,4; Н 6,7; N 15,7.

C₂₂H₂₄N₄O.

Вычислено, %: С 73,3; Н 6,7; N 15,5.

Дигидрохлорид, идентичный описанному в методе А, получен подкислением ацетонового раствора вышеописанного основания конц. HCl.

В. Смесь 4,05 г (15 ммоль) 1-фенацил-2-хлорбензимидазола [Кочергин П.М., Пономарь B.C. Способ получения производных имидазо[1,2-а]бензимидазола. Авт. свид. №230827 (1968)] и 6,49 г (45 ммоль) 3-морфолинопропиламина нагревают до 150-155°С и выдерживают при этой температуре 2 часа. Охлаждают, вливают в воду и выделившийся осадок экстрагируют хлороформом. Экстракт пропускают через колонку с оксидом алюминия (элюент - хлороформ). Полукристаллическое масло, оставшееся после испарения хлороформа из элюата и представляющее собой 1-морфолинопропил-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазол, переводят в дигидрохлорид I, как описано выше в методике А, получая 5,68 г (81,9%) дигидрата соли.

Г. Смесь 10 ммоль бензимидазол-2-сульфокислоты и 20 ммоль КОН в 5 мл воды нагревают до образования раствора. После охлаждения к полученному раствору приливают 30 мл ацетона, выпавший белый осадок дикалиевой соли бензимидазол-2-сульфокислоты отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают на воздухе. Выход 80-85%.

Суспензию 4,11 г (15 ммоль) полученной дикалиевой соли и 2,98 г (15 ммоль) фенацилбромида в 15 мл диметилформамида перемешивали при 90-100°С 3 ч. Смесь охлаждали, разбавляли водой и подкисляли конц. HCl до рН 1. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали холодной водой и ацетоном. Выход 4,0 г (85%).

Смесь 1,58 г (5 ммоль) 1-фенацилбензимидазол-2-сульфокислоты и 2,16 г (15 ммоль) 1-(3-аминопропил)морфолина нагревают при перемешивании при 140-150°С 1 ч. По охлаждении реакционную массу обрабатывают водой и экстрагируют 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазол хлороформом. Далее поступают так, как описано в методике В. Выход 1,85-1,90 г (79-81%).

Фармакологические свойства соединения I.

А. P2Y₁-антагонистическая активность соединения I на тромбоцитах in vitro

Изучение влияния соединения I на пуриновые рецепторы тромбоцитов проводили с использованием метода малоуглового светорассеяния (Сакаев М.Р., Миндукшев И.В., Лесиовская Е.Е. и др. Оценка эффективности действия пуриновых нуклеотидов на Р2-рецепторы тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - №.3. - С.65-69).

Эксперименты проводили на лазерном анализаторе малоуглового светорассеяния «Лайт-скан» («Люмекс ЛТД», Россия) в солевой среде, содержащей 140 мМ NaCl; 10 мМ трис-HCl буфера; 5 мМ ЭДТА (рН 7,8), с разбавлением плазмы, обогащенной тромбоцитами (концентрация тромбоцитов не превышала 10⁷ клеток/мл). Для экспериментов использована плазма 6 кроликов породы «Шиншилла» массой 4-4,5 кг. В качестве индукторов активации тромбоцитов использовались динатриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) («Реанал», Венгрия) и селективный агонист P2Y₁-рецепторов 2-метилтио-АТФ («Sigma», США). В качестве препарата сравнения взят тиклопидин (Тиклид, "Sanofi-syntelabo", Франция).

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием парного критерия Стьюдента при предварительной проверке выборки на нормальность распределения.

Соединение I в концентрации 10^-6 М достоверно подавляло АДФ-индуцированную активацию тромбоцитов в бескальциевой среде на - 22,1±2,1%, в то время как тиклопидин не проявил ингибирующей активности.

При использовании в качестве индуктора активации тромбоцитов селективного P2Y₁-агониста 2-метилтио-АТФ, соединение I в концентрациях 10^-4-10^-5 М выраженно подавляло активацию тромбоцитов (табл.1), в отличие от тиклопидина, показавшего статистически незначимый эффект.

Б. Влияние соединения I на агрегацию тромбоцитов в условиях ex vivo

Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов "Биола" (Россия) по методу G.Born в модификации Габбасова З.А. (Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов / З.А.Габбасов [и др.] // Лабораторное дело. - 1989. - №10. - С.15-18) на образцах плазмы 36 половозрелых нелинейных белых крыс обоего пола массой 270-320 г. В качестве индукторов агрегации использовали АДФ («Реанал», Венгрия) (5 мкМ) и коллаген ("Sigma", США) (50 мг/кг). Исследуемое соединение I и препарат сравнения тиклопидин (Тиклид, "Sanofi-syntelabo", Франция) вводили перорально в дозе, эквимолярной 6 мг/кг тиклопидина, за 2 часа до забора крови под эфирным наркозом.

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием критерия Манна-Уитни.

При исследовании влияния на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов обнаружено, что по угнетению степени агрегации соединение I превосходит тиклопидин в 2,4 раза, а по влиянию на скорость агрегации - в 1,9 раз (табл.2).

Исследование влияния на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов обнаружило, что по угнетению степени агрегации соединение I незначительно превосходит тиклопидин (табл.3).

В. Антитромботические свойства соединения I

Антитромботическую активность соединений на модели артериального тромбоза, индуцированного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) (Kurz K.D., Main B.W., Sandusky G.E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride // Thromb. Res. - 1990. - V.15. - P.269-280), оценивали по времени, необходимому для достижения 50%-ного уровня кровотока, времени полной окклюзии сонной артерии, а также по средней объемной и средней линейной скорости артериального кровотока.

Эффективность соединений на модели артериального тромбоза, индуцированного постоянным электрическим током (12 В, 50 мА) (Guglielmi G. et al. Electrothrombosis of saccular aneurysms via endovascular approach. Part 1: Electrochemical basis, technique, and experimental results // J. Neurosurg. - 1991. - V.75. - P.1-7) оценивали по интервалу времени от момента начала стимуляции до полной окклюзии каротидной артерии.

Моделирование генерализованного тромбоза (DiMinno G., Silver M.J. Mouse antithrombotic assay: a simple method for the evaluation of antithrombotic agents in vivo. Potentiation of antithrombotic activity by ethyl alcohol // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1983. - V.225. - P.57-60) проводили введением смеси растворов коллагена и адреналина (0,5 мг/кг и 0,06 мг/кг соответственно) в хвостовую вену мышей. В качестве критерия эффективности исследуемых соединений фиксировали количество выживших животных по сравнению с контрольной группой и наличие тромбов в сосудах легких.

Исследуемое соединение I и препарат сравнения тиклопидин (Тиклид, "Sanofi-syntelabo", Франция) вводили перорально в дозе, эквимолярной 6 мг/кг тиклопидина, за 2 часа до моделирования тромбоза. Воспроизведение моделей артериальных тромбозов проводили под нембуталовым (35 мг/кг) наркозом с регистрацией уровня кровотока с помощью ультразвукового допплерографа «Минимакс-Допплер-К» («СП Минимакс», С.-Петербург, Россия).

Антитромботическую активность изучали на 38 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах массой 330-440 г. Для моделирования генерализованного тромбоза использовали 35 белых нелинейных мышей - самцов массой 20-26 г.

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием критерия Манна-Уитни, ANOVA (Newman-Keuls test) и точного критерия Фишера.

На модели артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа, у крыс, получивших однократно соединение I, снижение уровня кровотока на 50% по сравнению с параметрами в неповрежденном сосуде отмечается примерно через 1,5 часа после нанесения повреждающего агента, что в 4,5 раза превышает аналогичный параметр в контрольной группе. В течение 2,5 часов не удается зарегистрировать момент полной окклюзии сонной артерии (табл.4).

В группе крыс, получивших тиклопидин, время достижения 50%-ного уровня кровотока составляет 29 мин (табл.4), что в 1,5 раза превышает аналогичный показатель в контрольной группе, но в 3,1 раза уступает по данному параметру соединения I. С этого момента снижение уровня кровотока происходит более интенсивно, и к 42 минуте после начала воздействия повреждающего фактора наблюдается полная окклюзия.

На модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током, однократное пероральное введение соединения I в дозе эквимолярной 6 мг/кг тиклопидина, приводит к достоверному увеличению времени кровотока в 2,4 раза по сравнению с контролем (табл.5). Время полной окклюзии сонной артерии в группе крыс, получивших соединение I, превышает аналогичный показатель на 85,7% по сравнению с группой крыс, которым был введен тиклопидин (р≤0,01).

В группе животных, получивших тиклопидин в дозе 6 мг/кг (per os, однократно), время регистрации полного артериального тромбоза превышает данный параметр в контрольной группе в среднем на 5,8 минут, что составляет 101,7% по отношению к контролю, однако различия статистически незначимы.

При изучении генерализованного коллаген-адреналинового тромбоза соединение I и тиклопидин, введенные перорально за 2 часа до моделирования генерализованного тромбоза, в разной степени уменьшали гибель животных.

При введении раствора, содержащего 0,5 мг коллагена и 0,06 мг адреналина из расчета на килограмм массы тела, в хвостовую вену животным контрольной группы, в течение 1-3 минут после введения индукторов тромбоза наблюдали гибель животных. Выживаемость в контрольной группе составила 6,3%. Соединение I достоверно уменьшало гибель мышей при моделировании системного коллаген-адреналинового тромбоза по сравнению с контролем. Выживаемость составила 55,6%. В экспериментальной группе у животных, получивших тиклопидин, выживаемость достоверно не отличалась от контрольной группы и составила 30,0%.

Таким образом, выживаемость животных в группе, получавших соединение I, в 8,9 раза превышала таковую в контрольной группе и в 1,9 раза - в группе у животных, получавших тиклопидин.

Г.Острая токсичность соединения I

Исследование острой токсичности проводили на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-22 г при внутрибрюшинном введении. Гибель животных регистрировали в течение двух недель. (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - с.170-204). Величину токсикологического показателя - LD₅₀ рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона.

По результатам изучения острой токсичности показатель ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении для соединения I составил 130,0 мг/кг, таким образом, оно является умеренно токсичным.