Результат интеллектуальной деятельности: Способ количественного определения содержания дубильных веществ с учетом их групповой принадлежности в лекарственных растительных препаратах

Изобретение относится к способам количественного определения дубильных веществ в лекарственных растительных препаратах, в частности к спектрофотометрическим способам определения дубильных веществ с осаждением кожным порошком. Изобретение может быть использовано для контроля качества лекарственных растительных препаратов.

Дубильные вещества представляют собой водорастворимые полифенолы, обладающие вяжущим вкусом, способные осаждать белки и имеющие молекулярную массу в пределах от полутысячи до нескольких тысяч а.е.м. [1].

По химической структуре дубильные вещества могут быть разделены на две группы: гидролизуемые и конденсированные. Гидролизуемые дубильные вещества представляют собой гликозиды галловой и эллаговой кислот и их производных. Конденсированные дубильные вещества являются полимерами флаван-3-ол производных [1].

Химическая структура дубильных веществ важна, так как она обуславливает разницу в фармакологическом действии между разными группами дубильных веществ [2, 3].

Как правило, растения накапливают одну группу дубильных веществ в гораздо большем количестве, чем другую группу. Групповая принадлежность дубильных веществ является устойчивой характеристикой растения и может быть определена по данным литературы или с помощью качественных реакций [4].

Аналогом заявляемого изобретения является способ определения дубильных веществ с осаждением бычьим сывороточным альбумином [5]. Из лекарственного растительного препарата готовят водное извлечение, из водного извлечения осаждают бычьим сывороточным альбумином дубильные вещества, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в смеси растворов триэтиламина и натрия додецил сульфата, к полученному раствору прибавляют раствор хлорида железа, через 15 мин определяют оптическую плотность при длине волны 510 нм; в качестве стандартного образца используют таниновую кислоту.

Недостатками аналога являются:

- пересчет на один стандартный образец независимо от групповой принадлежности извлекаемых дубильных веществ;

- наличие зависящей от времени цветной реакции, что затрудняет количественное определение одновременно в большом количестве образцов;

- трудоемкость, так как требуется приготовление растворов для получения окрашенных продуктов реакции.

Также аналогом заявляемого изобретения является способ определения дубильных веществ в растительном сырье с осаждением дубильных веществ подкисленным раствором коллагена (Патент RU 2439568 С1). Из растительного сырья готовят водное извлечение, определяют оптическую плотность водного извлечения при длине волны 277 нм, к аликвоте водного извлечения добавляют 1% раствор коллагена в 1% уксусной кислоте, снова измеряют оптическую плотность; по разности оптических плотностей определяют содержание дубильных веществ.

Недостатками аналога являются:

- пересчет на один стандартный образец независимо от групповой принадлежности извлекаемых дубильных веществ;

- после добавления раствора коллагена к водному извлечению иногда может образовываться мелкодисперсная взвесь, которая плохо оседает на фильтрах, и влияние которой на оптическую плотность раствора не изучено;

- деление дубильных веществ на осаждаемые и неосаждаемые противоречит общепринятому определению дубильных веществ [6];

- использование удельного показателя поглощения галловой кислоты вместо измерения оптической плотности раствора стандартного образца понижает точность расчетов.

Прототипом заявляемого изобретения является способ, включенный в Государственную фармакопею XIII издания [6]. Из лекарственного растительного препарата готовят водное извлечение, из водного извлечения осаждают дубильные вещества кожным порошком, раствор над осадком фильтруют, к полученному фильтрату и к водному извлечению прибавляют фосфорномолибденововольфрамовый реактив, через 30 мин измеряют оптическую плотность при длине волны 760 нм, содержание дубильных веществ рассчитывают по разности оптических плотностей водного извлечения и фильтрата; в качестве стандартного образца используют пирогаллол.

Недостатками прототипа являются:

- пересчет на один стандартный образец независимо от групповой принадлежности извлекаемых дубильных веществ;

- наличие зависящей от времени цветной реакции, что затрудняет количественное определение одновременно в большом количестве образцов;

- трудоемкость, так как требуется приготовление растворов для получения окрашенных продуктов реакции.

Задачей изобретения является количественное определение содержания дубильных веществ с учетом их групповой принадлежности в лекарственных растительных препаратах, упрощение пробоподготовки и сокращение времени анализа.

Поставленная задача решается благодаря:

- использованию разных стандартных образцов: для гидролизуемых дубильных веществ - пирогаллол, для конденсированных дубильных веществ - (+)-катехин;

- применению метода прямой спектрофотометрии, что упрощает пробоподготовку и сокращает время анализа.

В заявляемом изобретении около 2,0 г (точная навеска) измельченного лекарственного растительного препарата с известной влажностью, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы препарата не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм, отбрасывая первые 50 мл фильтрата.

Раствор А. Фильтрат в объеме 1,0 мл помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора A (A₁) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ) в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Раствор Б. К 5,0 мл фильтрата прибавляют 0,05 г кожного порошка, перемешивают полученную смесь в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм. Полученный фильтрат в объеме 1,0 мл помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора Б (А₂) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ) в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Раствор стандартного образца (далее - РСО). 0,1 г (точная навеска) пирогаллола (для гидролизуемых дубильных веществ) или (+)-катехина (для конденсированных дубильных веществ) с заявленным содержанием действующего вещества (Р) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. Измеряют оптическую плотность РСО (А₃) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ) в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на пирогаллол или (+)-катехин в абсолютно сухом лекарственном растительном препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:

где

A₁ - оптическая плотность раствора А;

А₂ - оптическая плотность раствора Б;

А₃ - оптическая плотность РСО;

а - навеска лекарственного растительного препарата, г;

а₀ - навеска пирогаллола или (+)-катехина, г;

Р - содержание действующего вещества в стандартном образце, %;

W - влажность лекарственного растительного препарата, %.

Примечание. После каждого измерения оптической плотности растворов А, Б и РСО кювету необходимо последовательно промыть 70% спиртом и водой.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:

Пример 1. Определение содержания дубильных веществ в дуба коре

2,03365 г измельченной коры дуба с влажностью 12,6%, просеянной сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы препарата не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм, отбросив первые 50 мл фильтрата.

Раствор А. Фильтрат в объеме 1,0 мл помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора A (A₁) на спектрофотометре при длине волны 266 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Раствор Б. К 5,0 мл фильтрата прибавляют 0,05 г кожного порошка, перемешивают полученную смесь в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм. Полученный фильтрат в объеме 1,0 мл помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора Б (А₂) на спектрофотометре при длине волны 266 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

РСО. 0,10317 г пирогаллола с заявленным содержанием действующего вещества 99,7% помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. Измеряют оптическую плотность РСО (А₃) на спектрофотометре при длине волны 266 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на пирогаллол в абсолютно сухом лекарственном растительном препарате в процентах (X) вычисляют следующим образом:

Х=3,42%

Расчет приведен для Образца №1 (Таблица 1).

Аналогичным образом определяют содержание дубильных веществ в этом же образце дуба коры еще из 9 навесок, а так же еще в двух навесках двух других образцов дуба коры. Дополнительно содержание дубильных веществ определяют в этих же навесках способом прототипа. Результаты представлены в Таблицах 1 и 2.

Таким образом, данный пример показывает пригодность использования заявляемого способа для количественного определения содержания гидролизуемых дубильных веществ в дуба коре.

Пример 2. Определение содержания дубильных веществ в кровохлебки корневищах и корнях

2,03574 г измельченных кровохлебки корневищ и корней с влажностью 10,5%, просеянных сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы препарата не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм, отбросив первые 50 мл фильтрата.

Раствор А. Фильтрат в объеме 1,0 мл помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора А (A₁) на спектрофотометре при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Раствор Б. К 5,0 мл фильтрата прибавляют 0,05 г кожного порошка, перемешивают полученную смесь в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм. Полученный фильтрат в объеме 1,0 мл помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора Б (А₂) на спектрофотометре при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

РСО. 0,10229 г (+)-катехина с заявленным содержанием действующего вещества 99,8% помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. Измеряют оптическую плотность РСО (А₃) на спектрофотометре при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на (+)-катехин в абсолютно сухом лекарственном растительном препарате в процентах (X) вычисляют следующим образом:

Х=2,51%

Расчет приведен для Образца №1 (Таблица 3).

Аналогичным образом определяют содержание дубильных веществ в этом же образце кровохлебки корневищ и корней еще из 9 навесок, а так же еще в двух навесках двух других образцов кровохлебки корневищ и корней. Дополнительно содержание дубильных веществ определяют в этих же навесках способом прототипа. Результаты представлены в Таблицах 3 и 4.

Таким образом, данный пример показывает пригодность использования заявляемого способа для количественного определения содержания конденсированных дубильных веществ в кровохлебки корневищах и корнях.

Пример 3. Использование разных стандартных образцов для пересчета результатов определения содержания дубильных веществ

Определяют содержание дубильных веществ с учетом их групповой принадлежности в образцах дуба коры и кровохлебки корневищ и корней способами заявляемого изобретения и прототипа. При этом при определении способом заявляемого изобретения оптическую плотность определяют при двух длинах волн и пересчитывают содержание дубильных веществ на пирогаллол и на (+)-катехин. Результаты представлены в Таблице 5.

Водный экстракт дуба коры содержит в основном гидролизуемые дубильные вещества (в качестве стандартного образца используется пирогаллол), водный экстракт кровохлебки корневищ и корней содержит конденсированные дубильные вещества (в качестве стандартного образца используется (+)-катехин).

В данном примере показано, что при использовании пирогаллола для определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном препарате, содержащем конденсированные дубильные вещества, получаются завышенные результаты; при использовании (+)-катехина для определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном препарате, содержащем гидролизуемые дубильные вещества, получаются заниженные результаты.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получать результаты количественного определения дубильных веществ с учетом групповой принадлежности определяемых дубильных веществ, достоверно отражающие содержание дубильных веществ в лекарственном растительном препарате.

Пример 4. Затраты времени на проведение испытания заявляемым изобретением с упрощенной пробоподготовкой и прототипом

При количественном определении содержания дубильных веществ способом прототипа на выполнение вспомогательных операций (в частности приготовление растворов) требуется как минимум 10 ч. В то время как для заявляемого способа приготовление этих растворов не требуется, что упрощает пробоподготовку.

Экстракция дубильных веществ занимает одинаковое время независимо от способа. Приготовление испытуемого раствора А и раствора стандартного образца занимает минимум на 30 мин больше по прототипу, так как это время проведения цветной реакции. Приготовление испытуемого раствора Б занимает минимум на 60 мин больше по прототипу, так как 30 мин необходимо на проведение цветной реакции, и на 30 мин дольше проводится осаждение дубильных веществ кожным порошком.

Из данного примера видно, что, благодаря использованию прямой спектрофотометрии, способ, описанный в заявляемом изобретении, является гораздо менее трудоемким и времязатратным, чем у прототипа.

Таким образом, заявляемый способ позволяет упростить пробоподготовку и сократить время анализа.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.

Список литературы

1. Haslam E. Plant Polyphenols: Vegetable Tannins Revisited. Cambridge: Cambridge University Press. 1989; 230 p.

2. Okuda Т., Kimura Y., Yoshida Т., Hatano Т., Okuda H., Arichi S. Studies on the Activities of Tannins and Related Compounds from Medicinal Plants and Drugs. I. Inhibitory Effects on Lipid Peroxidation in Mitochondria and Microsomes of Liver. Chemical and pharmaceutical bulletin. 1983; 31 (5): 1625-1631.

3. Kimura Y., Okuda H., Okuda Т., Yoshida Т., Hatano Т., Arichi S. Studies on the Activities of Tannins and Related Compounds of Medicinal Plants and Drugs. II. Effects of Various Tannins and Related Compounds on Adrenaline-Induced Lipolysis in Fat Cells. Chemical and pharmaceutical bulletin. 1983; 31 (7): 2497-2500.

4. Plant Polyphenols 2: Chemistry, Biology, Pharmacology, Ecology. Gross G.G., Hemingway R.W., Yoshida Т., editors; Branham S.J., associate editor. New York: Kluwer Academic / Plenum Publishers. 1999; 926 p.

5. Hagerman A.E., Butler L.G. Protein Precipitation Method for the Quantitative Determination of Tannins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1978; 26 (4): 809-812.

6. ОФС. 1.5.3.0008.15 «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание [Электронный ресурс]. URL: http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-5-3-0008-15-opredelenie-soderzhaniva-dubilnyh-veshhestv-v-lekarstvennom-rastitelnom-syre-i-lekarstvennyh-rastitelnyh-preparatah/