Результат интеллектуальной деятельности: Консорциум штаммов бактерий для очистки сточных вод от масложировых загрязнений

Изобретение относится к биотехнологии и экологии и может быть использовано для очистки сточных вод от масложировых загрязнений.

Жиры и масла попадают в окружающую среду со сточными водами, образующимися в результате деятельности пищевой промышленности, ресторанов и аварийных разливов масел. Серьезной проблемой для предприятий является удаление отложений жиров в трубах, отстойниках, жироуловителях, из-за чего снижается общая интенсивность аэробного процесса очистки сточных вод. Очистка сточных вод представляет одну из самых важных экологических проблем, и в этом направлении существует множество разнообразных технологических приемов, в основе которых лежат физико-химические или биохимические процессы деградации различных компонентов сточных вод. Необходимость экономного использования водных ресурсов и высокая потребность промышленности в воде определяют необходимость разработки эффективных технологий для совершенствования систем очистки.

Для решения этой проблемы в последнее время все чаще используют методы биоремедиации, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов масложировых отходов.

Известен биопрепарат для очистки сточных вод от жиров на основе штамма бактерий Serratia marcescens ИБ 2-2, проявляющего активность по деструкции твердых жиров животного и растительного происхождения. Для культивирования штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 с целью получения липазы применяют питательную среду следующего состава, г/л: соевая мука - 5; дрожжевой экстракт - 60; К₂НРО₄ - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,0. Время выращивания 40 час. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0×10⁹ Колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл, а деструкция кулинарного жира - 100% (патент RU 2310686 С1, опубл. 20.11.2007).

Недостатком данного биопрепарата является узкий спектр условий, дающих возможность его использовать только для биодеструкции жиров при рН 7.0 и температуре 28°C.

Известен биопрепарат на основе комплекса бактериальных штаммов Acinetobacter species М-2, Acinetobacter species М-3, Arthrobacter species M-4, Rhodococcus species M-5 с содержанием живых клеток бактерий-декструкторов масел и жиров 10⁸ - 10¹¹ кл/г сухого препарата. Выращивание штаммов бактерий проводят в аппарате интенсивного массообмена в периодическом и в непрерывном режиме (D=0,2 час^-1) на минеральной среде (NH₄H₂PO₄ - 10 г/л, K₂НPO₄ - 10 г/л, MgSO₄×7H₂O - 0,7 г/л, ZnSO₄×7H₂O, FeSO₄×7H₂O, MnSO₄×7H₂O - по 12,5 мг/л) при рН 7.0, температуре 30°C в течение 24 часов. После процесса выращивания полученную бактериальную суспензию сепарируют, а затем сгущенную биомассу высушивают на распылительной сушильной установке. Очистку загрязненных стоков от пищевых масел и жиров осуществляют путем засева бактериальной биомассы штаммов Acinetobacter species М-2, Acinetobacter species М-3, Arthrobacter species M-4, Rhodococcus species M-5 с добавлением в стоки минеральных компонентов. Процесс ферментации ведут при рН 7.0 и температуре 15, 30, 45, 50°C до полной деструкции масел и жиров в стоке (патент RU 2161595 С2, опубл. 10.01.2001).

Недостатками данного биопрепарата является узкий спектр условий, дающих возможность использовать его только при рН 7.0, а также недостаточная эффективность в отношении биодеструкции жиров животного происхождения, в следствии чего необходимо дополнительно добавлять в стоки «жидкое мыло», либо подвергать жиры обработке ультразвуком.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению - прототипом, является биопрепарат «Липойл», содержащий лиофилизованную смесь штаммов бактерий Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702, взятых в равном соотношении с конечной численностью живых клеток бактерий не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г сухого биопрепарата, который может быть использован для очистки сточных вод от масложировых загрязнений. Применение биопрепарата реализуют путем внесения в промышленные стоки суспензии микроорганизмов с численностью 10⁷ КОЕ/мл, полученной путем растворения в воде лиофилизированного биопрепарата (1:1000 по массе).

Недостатком биопрепарата «Липойл» является его узкий спектр потребляемых микроорганизмами веществ, поскольку входящие в его состав штаммы бактерий (микроорганизмы) не обладают одновременно и липолитической активностью и способностью к продукции поверхностно-активных веществ. Наличие обоих свойств у препарата увеличивает его возможности действовать более эффективно в отношении большинства гидрофильных веществ, повышая растворимость малорастворимых компонентов.

Задачей изобретения является разработка более эффективного микробного консорциума для биологической очистки жиросодержащих вод в широком диапазоне значений рН и температур среды, на основе штаммов бактерий, обладающих как липолитической активностью, так и способностью к продукции поверхностно-активных веществ.

Технический результат: повышение эффективности и расширение спектра условий применения микробного консорциума для биологической очистки жиросодержащих вод.

Поставленная задача достигается предлагаемым консорциумом непатогенных штаммов бактерий Pseudomonas species (sp.) 7 (обладает липолитической активностью) и Bacillus species (sp.) 2 (продуцирует поверхностно-активные вещества), взятых в соотношении 1:1 (по массе), с конечной концентрацией колониеобразующих единиц бактерий в концентрированной суспензии не менее 1×10⁹ КОЕ/г. Важной особенностью разработанного консорциума является наличие у микроорганизмов способности продуцировать биологические поверхностно-активные вещества (биоПАВ), которые обеспечивают эмульгирование гидрофобных субстратов, что, в свою очередь, значительно увеличивает скорость биокаталитических реакций с участием гидролаз (липаз), а соответственно, и разрушение жиросодержащих отходов.

Входящие в консорциум штаммы бактерий Pseudomonas species 7 и Bacillus species 2, являются новыми.

Штамм бактерий Pseudomonas species 7 депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки ФИЦ «Биологических исследований РАН» Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ В-3287Д.

Штамм бактерий Bacillus species 2 депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки ФИЦ «Биологических исследований РАН» Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ В-3288Д. Виды подгруппы Bacillus amyloliquefaciens и вид Pseudomonas koreensis не значатся в списках 1-4 групп патогенности в соответствии с Приложением 1 «Классификация микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний…» к Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. Дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N 86.

Характеристика используемых штаммов.

Штамм бактерий Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д выделен из образцов жиросодержащих пищевых отходов г. Новосибирска.

Культурально-морфологические признаки.

Морфология - подвижные палочки. Реакция по Граму - грамотрицательная. Колонии - круглые колонии с неровными краями, бежевого цвета. На среде Кинга Б образует желто-зеленый флюоресцирующий пигмент. При культивировании на среде Кинга А отсутствует пигмент. Неспорообразующий.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Каталазоположительный. Оксидазоположительный. Способен к росту в жидкой среде М9 со следующими субстратами - маргарин, соевое масло, горчичное масло, растительное масло, оливковое масло, кокосовое масло, сливочное масло, льняное масло, рыбий жир, свиной жир, миндальное масло. Способен к росту в температурном диапазоне 10-42°C, в диапазоне рН 5-8. Штамм способен продуцировать лецитиназу при росте на агаризованной желточно-солевой среде.

Штамм бактерий Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д выделен из образцов жиросодержащих пищевых отходов г. Новосибирска.

Культурально-морфологические признаки.

Морфология - подвижные палочки. Колонии - округлой формы с волнистыми краями, сухая и бархатистая структура колоний, покрыта мелкими морщинками неровными краями. Реакция по Граму - грамположительная. При культивировании на агаризованной среде Лурия-Бертани через 24-30 часов при температуре 28°C штамм образует белые матовые колонии диаметром 3-5 мм. Через 72 часа роста на указанной питательной среде штамм образует споры. Свободные споры имеют эллиптическую форму, спорангий нераздутый. Размер спор 0,5×1,2 мкм.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Каталазоположительный. Оксидазоположительный. Способен к росту в жидкой среде М9 со следующими субстратами - маргарин, растительное масло, сливочное масло, горчичное масло, льняное масло, свиной жир, кокосовое масло. Способен к синтезу биоПАВ при росте в жидкой среде М9 с гидрофобными субстратами, что подтверждено измерением поверхностного натяжения, составившего 38,7 мН/м. Способен к росту в температурном диапазоне 10-42°C, в диапазоне рН 5-8.

Получение консорциума штаммов реализуется путем раздельного глубинного культивирование каждого из штаммов бактерий Bacillus species 2 и Pseudomonas species 7 на питательной среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу, набор минеральных солей. Процесс ведут по контролю оптической плотности культуральной жидкости. Критерием завершения процесса является прекращение прироста оптической плотности в течение 2-4 часов. Культуральную жидкость остужают в аппарате до 13°C и передают на центрифугирование.

Отделение микробной биомассы выращенных бактериальных культур Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ - 3288Д проводят на центрифуге при скорости вращения ротора 4500 об/мин и температуре 5°C в течение 30 мин.

Полученную концентрированную суспензию каждого микроорганизма по отдельности стерильно смешивают в соотношении 1:1 (по массе) с защитной средой на основе 0,05М натрий-калиевого фосфатного буфера, содержащего 20 г/л тиомочевины; 50 г/л сахароза; 0,5 мл/л твин 80; 40 г/л полиглюкина.

Полученные концентрированные биомассы микроорганизмов Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д смешивают между собой в соотношении 1:1 (по массе) и получают микробный консорциум с конечной концентрацией колониеобразующих единиц бактерий не менее 1×10⁹ КОЕ/г концентрированной суспензии.

Полученный концентрат микробного консорциума хранят в сухом темном месте при температуре 2-8°C в течение 1 месяца.

Применение консорциума штаммов бактерий, обладающих липолитической активностью и способностью к продукции поверхностно-активных веществ, реализуют путем внесения в промышленные стоки суспензии микроорганизмов, полученной путем его растворения в воде в соотношении 1:100 (по массе).

Определяющим существенным отличием заявляемого консорциума, по сравнению с прототипом, является то, что в качестве микроорганизмов - деструкторов пищевых масел и жиров используют штамм бактерий Pseudomonas species 7, обладающий липолитической активностью и штамм бактерий Bacillus species 2, способный к продукции поверхностно-активных веществ, взятые в соотношении 1:1 (по массе), с конечной концентрацией колониеобразующих единиц бактерий в концентрированной суспензии не менее 1×10⁹ КОЕ/г, что позволяет повысить эффективность микробного консорциума и расширить спектр условий его применения за счет способности у микроорганизмов продуцировать биологические поверхностно-активные вещества (биоПАВ), которые обеспечивают эмульгирование гидрофобных субстратов, что, в свою очередь, значительно увеличивает скорость биокаталитических реакций с участием гидролаз (липаз).

В состав консорциума входят непатогенные штаммы бактерий, способные утилизировать пищевые масла и жиры в широком диапазоне рН (5-8) и температур среды (10-42°C).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение консорциума штаммов бактерий Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д

Для получения биомассы бактерий Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ-3288Д проводили глубинное культивирование каждого из микроорганизмов раздельно на питательной среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу, набор минеральных солей.

Культивирование бактерий Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ-3288Д поводили в ферментерах объемом 10 л, с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментеры оснащены фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, рН, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию. В ферментер вносили 200 мл посевного материала (инокулята) в виде микробной суспензии с концентрацией не менее 1×10⁹ КОЕ/мл на 60 л питательной среды, содержащей: дрожжевой пептон - 7 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л; глюкоза - 25 г/л; сульфат магния - 0,3 г/л; сульфат марганца - 0,1 г/л; гидрофосфат калия - 2 г/л; сульфат аммония - 1 г/л; пеногаситель - 0,5 мл/л. Конечный объем доводили водопроводной водой до 6 л.

В течение культивирования бактерий показатель рН поддерживали автоматически на уровне 7,0-7,2 путем подачи 15% раствора гидроксида аммония, при непрерывном перемешивании. Технологические параметры процесса культивирования микроорганизмов: температура 28°C; расход воздуха на аэрацию - от 0 до 4 часов - 1,5 л/мин, от 4 до 20 часов - 6 л/мин; скорость перемешивания - 400 об/мин. Продолжительность культивирования 20 часов.

Процесс вели по контролю оптической плотности культуральной жидкости. Критерием завершения процесса является прекращение прироста оптической плотности в течение 2-4 часов. Культуральную жидкость остужали в аппарате до 13°C и передавали на центрифугирование.

Отделение микробной биомассы выращенных бактериальных культур Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ - 3288Д проводили на центрифуге при скорости вращения ротора 4500 об/мин и температуре 5°C в течение 30 мин.

Полученную концентрированную суспензию каждого микроорганизма по отдельности стерильно смешивали в соотношении 1:1 (по массе) с защитной средой на основе 0,05М натрий-калиевого фосфатного буфера, содержащего 20 г/л тиомочевины; 50 г/л сахароза; 0,5 мл/л твин 80; 40 г/л полиглюкина.

Полученные концентрированные биомассы микроорганизмов Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д смешивали между собой в соотношении 1:1 (по массе) и получали микробный консорциум с конечной концентрацией колониеобразующих единиц бактерий не менее 1×10⁹ КОЕ/г концентрированной суспензии.

Пример 2. Оценка эффективности деградации растительных и животных жиров штаммами микроорганизмов Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д в лабораторных условиях.

Эксперимент проведен в 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава (г, мл/л): К₂НРО₄ - 8,71 г, 5М р-р NH₄Cl - 1 мл, 0,1 М р-р Na₂SO₄ - 10,4 мл, 62 мМ р-р MgCl₂ - 1 мл, 1 мМ р-р CaCl₂ - 1 мл, FeCl₃ - 0.2 г, 0,005 мМ р-р (NH₄)₆Mo₇O₂₄×4H₂O - 1 мл, микроэлементы - 1 мл, NH₄NO₃ - 1,86 г, NaF - 1,437 г, пептон - 10 г/л, рН 8,2.

Состав раствора микроэлементов в 1% HCl, (г/л): ZnO - 0,41, FeCl₂×6H2O - 5,4, MnCl₂×4H₂O - 2,00, CuCl₂ - 0,20) с добавлением смеси пищевых масел и жиров в количестве 2% (об/об или масс/об) и со штаммами микроорганизмов Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д в количестве 10 мл с концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл, выдерживали в течении 10 суток при температуре 24°C. Смесь пищевых масел и жиров состояла из оливкового, льняного, подсолнечного, горчичного, миндального, соевого, кокосового и сливочного масел, а также рыбьего и свиного жира. Указанные масла и жиры были смешаны в равных пропорциях. Количественный химический анализ проводился по ПНД Ф 14.1:2.122-97 «Методика измерений массовой концентрации жиров в поверхностных и сточных водах гравиметрическим методом» (Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовой концентрации жиров в поверхностных и сточных водах гравиметрическим методом. ПНД Ф 14.1:2.122-97. МОСКВА 1997 г. (издание 2011 г.) B.C. Талисманов. С. 14). Эффективность утилизации смеси пищевых масел и жиров составила 98% в течение 10 суток при температуре 24°C.

Пример 3. Оценка эффективности удаления твердых жиросодержащих отходов штаммами микроорганизмов Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д в лабораторных модельных системах.

Для моделирования процесса использовали трубки длинной 25 см и диаметром 5 мм. В качестве материала трубочек использовалось стекло, так как данный материал устойчив к действию всевозможных химических реагентов и не подвергается адгезии микроорганизмов и загрязнителя (жиров). Данные трубочки наполняли на 15 см твердыми жироподобными отходами, отобранными из канализационной трубы предприятия пищевой промышленности. Трубочки вертикально размещали в колбе объемом 300 мл и фиксировали на верхнем отверстии колбы ватной марлевой пробкой. Использование ватной марлевой пробки необходимо для обеспечения поступления кислорода воздуха в систему. В колбу, содержащую 100 мл минеральной среды помещали 2 трубочки: одна трубочка - заполненная твердыми жирами являлась контрольной, во вторую трубочку вносили суспензию микробного консорциума с концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл.

По истечении 10 суток проводили химический анализ и количественный учет микроорганизмов, содержащихся в модельной экспериментальной системе. Количественный учет микроорганизмов проводили посредством использования метода стандартных серийных разведений с последующим высевом на чашки с богатой агаризованной средой Лурия-Бертани. Чашки выдерживали в термостате в течении 2 суток, далее проводили подсчет выросших штаммов микроорганизмов. Численность микроорганизмов к концу эксперимента составила 8,6×10⁹±1,2×10⁹ КОЕ/мл, что свидетельствует о приросте биомассы клеток штаммов бактерий.

Наблюдалось появление в загрязнителе бороздки (по сравнению с контрольной трубочкой), которая свидетельствует о процессе деградации жиров микроорганизмами консорциума. Степень деградации жироподобных отходов в лабораторных модельных системах внесенным микробным консорциумом составила 72,1%.

По истечении 10 суток также было выявлено устранение характерного канализационного запаха жироподобных отходов.

Таким образом, при проведении испытаний по оценке эффективности утилизации масложировых загрязнений сточных вод в лабораторных модельных системах штаммами бактерий консорциума наблюдалось разжижение масложировых отходов и отсутствие образования пробок из масложировых отходов в лабораторных трубочках, что свидетельствует об эффективности удаления твердых жиросодержащих отходов штаммами бактерий Pseudomonas species 7 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д и подтверждается данными прироста численности бактерий микробной ассоциации (увеличение на 2,5 порядка).

Предлагаемый консорциум штаммов бактерий Pseudomonas species 1 ВКМ В-3287Д и Bacillus species 2 ВКМ В-3288Д позволит эффективно очищать сточные воды, загрязненные пищевыми маслами и жирами, а также удалять отложения жиров в канализационных системах предприятий и утилизировать жиры в жироуловителях.