ШТАММ БАКТЕРИЙ Lactobacillus reuteri ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОДУКТА И ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРОДУКТ, ЕГО СОДЕРЖАЩИЙ

Уровень техники изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к определенным штаммам молочнокислых бактерий, выбранных по способности повышать уровни цитокина IL-10, для профилактики и/или лечения колик, к способу отбора таких штаммов и к продуктам, содержащим такие штаммы.

Описание предшествующего уровня техники

Несмотря на значительную распространенность и болезненность, природа и причины детской колики остаются слабо изученными. Описание этого состояния матерью представляет собой следующее: ребенок, который был весел в течение всего дня, начинает хмуриться, лицо краснеет, он вытягивает ножки, кричит и продолжает плакать на протяжении приблизительно 2-20 мин, после чего приступ неожиданно заканчивается. Противоречия возникают даже в терминах, используемых для описания этого состояния. К терминам относятся «детская колика», «вечерняя колика», потому что боль в основном приурочена к вечеру, и «трехмесячная колика», так как она исчезает приблизительно через три месяца после рождения (Illingworth RS. Difficulties in breastfeeding. In Ronald S. Illingworth, ed. The Normal Child. 10^th edn. Harcourt (India) Pvt. Ltd. 1997; 39-44). Разные авторы используют разные определения. Вессел (Wessels) определяет колику как приступ плача на протяжении трех или более часов в день в течение трех дней или более в неделю на протяжении хотя бы трех недель, и это определение наиболее принято в литературе (Sondergaard C, Skajaa E, Henriksen TB. Fetal growth and infantile colic. Arch Dis Child Fetal-Neonatal Ed 2000; 83 (1): F44-47). На сегодняшний день главные возможные (причинные факторы) разделены на три группы: психосоциальные, желудочно-кишечные и нервные нарушения развития.

Психосоциальные факторы включают варианты нормального плача, влияние на поведение атипичного воспитания и проблемы во взаимоотношениях родителей и детей.

Гастроинтестинальные нарушения связывают с коликой при определенном положении ног младенца и кривлянии во время приступа плача. Гастроинтестинальные факторы коротко изложены ниже.

Неправильные способы кормления, такие как кормление из бутылочки, кормление в горизонтальном положении или недостаточное срыгивание после кормления, рассматривают как причинные факторы. Грудное вскармливание в первые шесть месяцев считают единственным профилактическим фактором. Риск детской колики в 1,86 раз выше у детей на искусственном вскармливании (Saavedra MA, Dacosta JS, Garcias G, Horta BL, Tomasi E, Mendoca R. Infantile colic incidence and associated risk factors: a cohort study. Pediatr (Rio J) 2003; 79(2): 115-122). Lothe et al. показали, что колика происходит из-за чувствительности к сывороточному белку коровьего молока (Lothe L, Lidberg T. Cow's milk whey protein elicits symptoms of infantile colic in colicky formula -fed infants: A double-blind cross over study. Pediatrics 1989; 83: 262).

В недавнем исследовании было сделано заключение, что пищевая гиперчувствительность может расцениваться как причина лишь в незначительном количестве случаев детской колики (Hill DJ, Hosking CS. Infantile colic and food hypersensitivity. Pediatr Gastreenterol Nutr 2000; 30 (Suppl): S67-76). Недавно Buchanan показал, что испытание гипоаллергенного молока при детской колике не подкреплено достаточным количеством данных (Buchanan P. Effectiveness of treatment for infantile colic. Trial of hypoallergenic milk is not supported by strong enough evidence. BMJ 1998; 317(7170): 1451-1452). Считается, что младенцы с детскими коликами имеют больший риск аллергических заболеваний. Однако в недавнем исследовании было показано, что маркеры атопии, аллергического ринита, астмы, стридора и изменчивости максимального объема выдоха сравнимы у младенцев, страдающих детской коликой и без нее (Castro-Rodriguez JA, Stern DA, Halonen M, Wright AL, Holberg CJ et al. Relationship between infantile colic and Asthma/ atopy: A prospective study in an unselected population. Pediatrics 2001; 108(4): 878-882).

Авторы описывали мальабсорбцию лактозы на основании проб на содержание водорода во выдыхаемом воздухе (Hyams J, Geerstama M, Etienne N, Treem W. Colonic hydrogen production in infants with colic. J Pediatr 1989; 115: 592). Не было отмечено различий в концентрации водорода в стуле младенцев, страдающих детской коликой или без нее. Однако было обнаружено, что у детей с более высоким уровнем метана колики проявляются в меньшей степени, что предполагает роль продукции метана в ее смягчении (Belson A, Shetty AK, Yorgin PD, Bujanover Y, Peled Y, Dar MH, Riaf S. Colonic hydrogen elimination and methane production in infants with and without infantile colic syndrome. Dig Dis Sci 2003; 48(9): 1762-1766).

Было показано, что гастроинтестинальные гормоны (GIT), такие как мотилин, вазоактивный интестинальный пептид, имеют патологически высокий уровень у младенцев с коликами. Lothe et al. показали повышение уровней с первых дней жизни у детей, у которых позже развивались колики, предполагая патологическую физиологию GIT при детской колике (Lothe L, Ivasson SA, Ekman R, Lindberg T. Motilin and infantile colic: A prospective study. Acta Pediart Scand 1990; 79(4) 410-416).

Основываясь на нарушениях развития нервной системы, было сделано предположение, что абдоминальное защемление и колика могут быть результатом гиперперистальтики. Эта теория подтверждается тем, что при приеме антихолинергических средств симптомы колики снижаются (Gupta SK. Is colic a gastrointestinal disorder? Curr Opin Pediatr 2002; 14:588-92).

Тот факт, что у большинства младенцев колики проходят к четырехмесячному возрасту, подтверждает нейрогенную причину колик (Barr RG. Colic and crying syndromes in infants. Pediatrics 1998; 102(5 suppl E): 1282-6).

Пробиотик, по общепринятому определению, представляет собой живую бактериальную кормовую добавку, которая оказывает благоприятное влияние на животное-хозяина, улучшая бактериальный баланс кишечника. Несмотря на то, что пробиотики первоначально относятся к добавкам, к животным кормам для сельскохозяйственных животных, их определение также можно применять и для человека. Основное потребление пробиотиков людьми происходит в форме молочных продуктов питания, содержащих кишечные виды лактобактерий и бифидобактерий. В определении пробиотиков указано, что их потребление влияет на состав кишечной микрофлоры.

Было сделано предположение, что такой эффект пробиотиков на кишечную экосистему благотворно воздействует на потребителя. Количество вероятных преимуществ, являющихся результатом изменений кишечной среды благодаря пробиотикам, было описано в статьях и к ним относятся: повышенная устойчивость к инфекционным заболеваниям, в частности к кишечным, сниженная продолжительность диареи, снижение кровяного давления, снижение концентрации холестерина в сыворотке, уменьшение аллергии, стимулирование фагоцитоза лейкоцитами периферической крови, модулирование экспрессии гена цитокина, адъювантный эффект, регрессия опухолей и снижение продукции канцерогенов или соканцерогенов.

Christensen et al. были первыми, кто сообщил о том, что пробиотические молочнокислые бактерии проявляют свои иммуномодулирующие эффекты путем модуляции Th1/Th2/Th3/Tr1/Treg-стимулирующей способности дендритных клеток (ДК). Они показали, что при одновременном культивировании мышиных ДК и разных видов Lactobacillus, включая Lactobacillus reuteri, у них избирательно модулировалась продукция цитокинов IL-6, IL-10, IL-12 и TNF-α и активация поверхностных маркеров зависимым от концентрации образом. Все поверхностные маркеры МНС класса II и CD86, активированные лактобактериями, являются показатели созревания ДК. В частности, значительным в этих исследованиях было то, что L.reuteri (штамм 12246) являлся слабым индуктором IL-12, но при одновременном культивировании с L.johnsonii или L.casei он избирательно ингибировал продукцию провоспалительных сигнальных цитокинов IL-12, IL-6 и TNF-α, которые стимулировали два других вида. Продукция IL-10 оставалась неизменной при этих условиях.

Эти обнружения привели к выводам о том, что «L.reuteri может вносить вклад в экзогенную модуляцию размножения дендритных клеток кишечника, что способствует устойчивости к антигенам, не несущим «сигнал опасности», при этом не влияя на способность отвечать на патогены, распознаваемые через такой сигнал опасности, как LPS, что «L.reuteri может являться потенциальной мишеневой терапией, эффективной для ингибирования продукции IL-12 и TNF-α (и IL-6), и при этом индуцировать противовоспалительный IL-10, предоставляя, таким образом, альтернативный терапевтический подход для компенсации провоспалительной среды цитокинов кишечника», и, таким образом, «существует возможность регулировки Th1/Th2/Th3-стимулирующих способностей кишечника, исходя из состава кишечной микрофлоры, включая потребляемые пробиотики» (Christensen HR, Frokiaer H, Pestka JJ (2002) Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells. J Immunol 168 171-178).

Smits et al. продолжили эти исследования и показали, что L. reuteri обладает способностью примировать ДК для стимуляции продукции регуляторных Т-клеток (TR). Они использовали три разных вида Lactobacillus, культивированных одновременно in vitro c ДК человека моноцитарного ряда дифференцировки. Использовали два вида молочнокислых бактерий, штамм L.reuteri (АТСС 53609) человека и L.casei, но не использовали штамм L.Plantarum, которые примировали ДК для стимуляции развития TR-клеток. Было показано, что эти TR-клетки продуцируют повышенные уровни IL-10 и способны ингибировать пролиферацию фоновых Т клеток IL-10-зависимым способом (Smits HH, Engering A, van der Kleij D, de Jong EC, Schipper K, van Capel TMM, Zaat BAJ, Yazdanbakhsh M, Wierenga EA, van Kooyk Y, Kapsenderg L (2005) Selective probiotic bacteria induce IL-10-producing regulatory T cells in vitro by modulating dendritic cell function through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin. J Allergy Clin Immunol 115 1260-1267).

Одним из первых доказательств, подтверждающих действие перорально поступающих L. reuteri на хозяина, по существу, являлось увеличенное соотношение CD4+/CD8+ клеток, наблюдавшееся в подвздошной кишке цыплят (Walter J. Dobrogosz, NUTRAfoods 2005 4(2/3) 15-28). Valeur et al. продолжили эти наблюдения, включив в них подвздошную кишку человека. Они получили прямые in situ доказательства у человека, показывающие (а) распределение индивидуальных специфичных для человека клеток L.reuteri АТСС 55730 по всему кишечнику человека и (б) выраженное участие L.reuteri АТСС 55730 в рекрутинге и/или пролиферации CD4+ Т клеток, в частности, в подвздошных областях кишечника. Ими был сделан вывод о том, что «введение L.reuteri вызывает рекрутинг CD4+ Т-хелперных клеток к эпителию человека. Этот рекрутинг может являться одним из факторов, объясняющих эффект пробиотиков этого штамма L.reuteri у человека» (Valeur N, Engel P, Carbajal N, Connolly E, Ladefoged K (2004) Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract, Appl Environ Microbiol 70 1176-1181).

Toll-подобные рецепторы (TLR) распознают бактериальные мотивы и активируют набор генов, что ведет к продукции цитокинов. Обычно TLR рассматриваются как сенсоры микробных инфекций, и их ролью является индукция воспалительного ответа. Однако мотивы, которые распознаются при помощи TLR, не являются уникальными для патогенов, но являются распространенными мотивами, общими для целых классов микроорганизмов, и не до конца понятно, каким образом иммунная система различает комменсальные и патогенные бактерии посредством TLR. Полученные недавно данные указывают, что TLR, помимо их роли в индукции воспалительного ответа, также играют роль в гомеостазе кишечника, распознавая комменсальную микрофлору (Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 2004 Jul 23; 118(2):229-41).

Штаммы различных видов Lactobacillus, включая L.reuteri, были использованы в композициях пробиотиков. L.reuteri является одним из природных обитателей желудочно-кишечного тракта животных, и обычно ее обнаруживают в кишечнике здоровых животных, включая людей. Известно, что она обладает антимикробной активностью. См., например, патенты США №№5439678, 5458875, 5534253, 5837238 и 5849289. Если клетки L.reuteri выращивают в анаэробных условиях в присутствии глицерина, то они продуцируют антибактериальное вещество, известное как β-гидрокси-пропиональдегид (3-НРА).

Существуют четкие и сложные взаимоотношения между кишечной иммунной системой и комменсальной флорой. Недавно было показано, что люминальная эндогенная флора может инициировать ключевой процесс бактериальной природы и адаптивный ответ хозяина путем активации toll-подобных рецепторов (TLR) и NOD-рецепторов, расположенных на клетках кишечного эпителия (Haller D, Jobin C. Interaction between resident luminal bacteria and the host: can a healthy relationship turn sour? J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 38: 123-36. Rakoff-Naholm S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 2004; 118: 229-241). На моделях человека цитокины могут инициировать гиперрефлекторную реакцию энтеральной мускулатуры посредством нервных и мышечных иммунных взаимодействий (Milla PJ. Inflammatory cells and the regulation of gut motility. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 39: S750).

В экспериментальных и клинических работах было показано, что специфические штаммы пробиотиков ингибируют пролиферацию Т-клеток и уменьшают секрецию как цитокина Th1, так и Th2, в то же время предпочтительно вырабатывая супрессорные цитокины, такие как IL-10 и TGF-β (Rautava S, Kalliomaki M, Isolauri E. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infants. J Allergy Clin Imunol 2002; 109: 119-121). Кроме того, у людей-добровольцев L. reuteri заселяет желудочно-кишечный тракт человека и способна проявлять иммуномодулирующую активность, включая ректутинг CD4+ Т-хелперных клеток в эпителии подвздошной кишки человека (Valeur N, Engel P, Carbajal N, Connoly E, Laderfoged K. Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reutery ATCC 55730 in the human gastrointestimal tract. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 1176-81). Созревание ДК представляет собой процесс, который превращает незрелые ДК в зрелые антигенпрезентирующие клетки, которые мигрируют в лимфатические узлы. Этот процесс приводит к потере сильной способности поглощать антигены, характерной для незрелых ДК и к активации экспрессии костимуляторных молекул и различных цитокинов (Mellman I, Steinman RM: Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell 2001, 106:255-8. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ Pulendran B, Palucka K: Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 2000, 18: 767-811).

Известные протоколы созревания основаны на окружении, с которым, как считается, ДК сталкиваются после или во время представления антигенам. Лучшим примером этого подхода является использование среды, кондиционированной моноцитами (МСМ). МСМ получают in vitro, культивируя моноциты и затем используя культуральную супернатантную жидкость в качестве источника факторов созревания. Главными компонентами в МСМ, ответственными за созревание, являются провоспалительные цитокины интерлейкин-1 β (IL-1 β), IL-6 и TNF-α (Reddy A, Sapp M, Feldman M, Subklewe M, Bhardwaj N: A monocyte condidioned medium is more effective than defined cytokines in mediating the terminal maturation of human dendritic cells. Blood 1997, 90: 3640-6). Зрелые ДК продуцируют множество цитокинов, которые стимулируют и направляют Т-клеточный ответ. Двумя из этих цитокинов являются IL-10 и IL-12. Эти цитокины оказывают противоположное действие на направление индуцированного Т-клеточного ответа: IL-12 индуцирует ответ Th1 типа, в то время как IL-10 ингибирует этот ответ.

Таким образом, состояние активации APC (антигенпрезентериующих клеток), включая ДК, определяет тип и величину CD4⁺-клеточного ответа. Остановка APC в фазе G₀ (включая эпителиальные клетки в тимусе) может способствовать развитию CD4⁺CD25⁺TR-клеток. Во время заражения патогенами распознавание бактериальных молекул TLR приводит к активации APC. Тогда APC продуцируют IL-6 и дополнительные растворимые факторы, которые вместе перекрывают супрессивный эффект TR-клеток, разрешая эффективное образование Т_Э (Т-эффекторных клеток) клеток против патогена. Динамическое равновесие между APC в фазе покоя и активированными APC также будет подвергаться действию как TR, так и ТЕ клеток (фиг.1).

Pessi et al. (2000) описывают образование IL-10 у детей с аллергией после перорального приема Lactobacillus rhamnosus GG. Но в отличие от представленного в настоящем документе изобретения, в исследовании не описаны специфические штаммы со способностью продуцировать большие количества IL-10, отобранные по их эффективности против нарушения моторики и колики (Pessi T, Sutas Y, Hurme M, Isolauri E. Interleukin-10 genetation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus. GG. Clin Exp Allergy. 2000 Dec; 30(12):1804-8).

Исследование Hermelijn et al. (2005) показывает, что примирование ДК моноцитарного ряда дифференцировки L. reuteri и Lactobacillus casei, но не Lactobacillus plantarum, управляет развитием TR-клеток. Эти TR-клетки продуцировали повышенные уровни IL-10. В отличие от настоящего изобретения авторы не связывают увеличение IL-10 с моторикой кишечника или коликой. Даже если дело касается штаммов, авторы упоминают два разных вида бактерий, которые эффективно повышают уровни IL-10. Это отличается от настоящего изобретения, в котором указано, что пробиотик, который будет наиболее эффективно уменьшать колику, следует определить и отобрать на уровне штамма, так как разные штаммы одного и того же вида обладают разной способностью эффективно увеличивать уровни IL-10.

В настоящий момент не существует лечения от колик. Принятая схема лечения колик состоит из фармакологического и/или нефармакологического методов, обеспечивающих в лучшем случае незначительное снижение симптомов. Типичное терапевтическое воздействие на колику, предлагаемое пациентам, находится в пределах четырех категорий, включая диетическую, физическую, поведенческую и фармакологическую. Диетические процедуры включают профессиональный совет по поводу различных техник кормления или использования гипоаллергенного молока, молочных смесей без сои или лактозы и раннее введение твердой пищи (Lothe, L., et al. Cow's milk formula as a cause of infantile colic: a double-blind study. Pediatrics 1982; 70:7-10; Forsyth B W C. Colic and the effect of changing formulas: a double-blind multiple-crossover study. J Pediatr 1989; 115,521-6; Treem, W R, et al. Evaluation of the effect of a fiber-enriched formula of infant colic. J Pediatr 1991; 119695-701). Однако ни использование соевых молочных смесей, ни изменения в технике кормления не эффективны для каждого из случаев колики. Обзор информации, изучающей эти рекомендации, показал, что использование гипоаллергенных молочных смесей, таких как частично гидратированные или основанные на аминокислотах, может быть успешным только у около 25% младенцев (Lucassen, P L B J, et al. Infantile colic: crying time reduction with a whey hydrolysate: a double-blind? Randomized placebo-controlled trial. Pediatrics 2000; 106:1349-54; Estep, D C, et al. Treatment of infant colic with amino acid-based infant formula: a prelimitary study. Acta Pediatr 2000; 89: 22-7).

Физическая стратегия для управления коликой включает физическое изменение позиций тела для облегчения газообразования/рефлюкса, ношение на руках, пеленание, применение надавливания на живот или массаж ребенка. Другие методы включают создание чувства отвлеченности, чтобы минимизировать осознание колики младенцем, такие как катание младенца на машине, использование стимулятора поездки, вибратора для детской кроватки или детские качели (Lipton E L. Swadding and child care practice: historical, cultural and experimental observations. Pediatrics 1965; 35: 521-67; Byrne J M, Horowitz F D. Rocking as a soothing intervention: the influence of direction and type of movement. Infant Behav Dev 1981; 4:207-18).

Другим способом является проигрывание звуковой записи, которая успокаивает младенца. Однако в медицинской литературе существуют доказательства, что эти методы не работают (Parkin P C, Schwartz C J, Manuel B A. Randomized controlled trial of three inventions in the management of persistent crying of infancy. Pediatrics 1993; 92(2): 197-201). Эти стратегии, в лучшем случае, лишь незначительно эффективны относительно снижения симптомов колики.

Рекомендации для поведенческого воздействия для лечения колики являются наиболее противоречивыми из доступных способов терапии. Некоторые авторы пропагандируют увеличение сенсорной стимуляции, в то время как другие пропагандируют уменьшение такой стимуляции (Balon A J. Management of infantile colic. Amer Pharm Physician 1997; 55:235-242; Lucassen P L B, Assendeift W J J, Gubbels J W, van Eijk T M, van Geldrop W J, Effectiveness of treatments for infantile colic: systematic review. BMJ 1998; 316(5): 1563-9; и Carey W B, “Colic” - primary excessive crying as an infant-environmental interaction. Pediatr Clin North Am 1984; 31: 993-1005). Другие рекомендации включают ранний ответ на плач или позволение младенцу плакать, предложение пустышки, внедрение определенного графика кормления, использование визуального контакта и развлекательных игр.

Фармакологический подход к лечению колик привел к использованию рецептурных и нерецептурных препаратов. Применяемые в настоящее время рецептурные препараты включают алкалоиды белладонны и опиаты (камфорная настойка опия), которые могут обеспечить облегчение, но чреваты рисками, включая дополнительные пирамидальные симптомы, угнетение дыхания и констипацию. Например, антихолинергические лекарственные средства, сходные по своему действию с действием атропина, такие как Хиосциамин (Левизин® или Гастросед®) и Дицикломин расширяют зрачки, увеличивают сердцебиение, уменьшают слюноотделение, ослабляют спазмы желудочно-кишечного и мочевого трактов, а также бронхов. Кроме того, антихолинергические лекарственные средства являются единственными рецептурными препаратами на рынке США, которые, как было много раз показано, эффективно лечат детскую колику, но, к сожалению, у 5% детей, подвергавшихся лечению, могут развиться побочные эффекты, включая затруднение дыхания, апноэ, эпилептический припадок, обморок, асфиксию, кому и мышечную гипотонию (Williams J, Watkin-Jones R. Dicyclomine: worrying symptoms associated with its use in some small babies. BMJ 1984; 288:901; Myers J H, Moro-Sutherland D, Shook J E. Anticholinergic poisoning in colicky infants treated with hyoscyamine sulfate. Am J Emerg Med 1997; 15: 532-5). К тому же сообщалось о нескольких случаях смерти у детей, принимавших дицикломин (Garriott J C, Rodriguez R, Norton L E. Two cases of death involving dicyclomine in infants. Clinical Toxicol 1984; 22(5): 455-462).

Нерецептурные препараты, которые описывались как эффективные для лечения детской колики, включают несколько седативных или снотворных лекарственных средств, включая надфизиологическую дозу (высокую дозу) дифенгидрамина (Бенадрил®), фенобарбитала, гидрата хлорана и даже спирта. Однако существует вероятность серьезных побочных эффектов, связанных с несколькими из этих агентов, у детей с респираторным заболеванием, ограничивая, таким образом, их широкое применение при лечении колики (Balon A J. Management of infantile colic. Amer Pharm Physician 1997; 55: 235-242; Gurry D. Infantile colic. Australian Pharm Phys 1994; 23(3): 337-34632).

Более безопасные нерецептурные препараты для лечения колики включали, главным образом, введение симетикона или диметилполисилоксана, нерассасывающегося, отпускаемого без рецепта, лекарственного средства, которое уменьшает размер кишечных пузырьков газа. Симетикон имеет очень безопасный профиль и часто рекомендуется, несмотря на несколько исследований, показывающих, что эффективность семитикона в отношении детской колики не больше, чем у плацебо (Metcalf, T J, et al., Pediatrics 1994 July; 94(1): 29-34. Sferra, T J, et al., Pediatr Clin North Am 1996 Aril; 43(2): 189-510. Danielson, B et al., Acta Paediatr scand 1985 May; 74(3): 446-50. Colon, A R, et al., Am Fam Physician 1989 December; 10(6): 122-4). В результате наиболее распространенным лечением колик на сегодняшний день является просто ждать, когда младенец перерастет это состояние.

Следовательно, в настоящее время существует потребность в безопасных и эффективных соединениях и композициях, а также способах, которые могут быть эффективны для лечения колики у младенцев и маленьких детей. Композиции и способы по настоящему изобретению отвечают этим нуждам, предлагая продукт, который может безопасно и эффективно устранять симптомы, связанные с коликой у младенцев. В патентной публикации ЕР1364483А10 описаны пробиотики для лечения кишечно-нервномышечных аномалий, таких как колики у младенцев. В качестве пробиотиков заявители упоминают несколько разных видов бактерий. Напротив, в настоящем изобретении пробиотик для наиболее эффективного уменьшения колики является специфическим штаммом молочнокислой бактерии, отобранным для эффективного увеличения уровней IL-10, и не относится ко всему классу бактерий, так как авторы настоящего изобретения показали, что существуют существенные отличия в стимуляции продукции IL-10 между штаммами одного и того же вида.

В 2005 г. Savino показал, что добавление L.reuteri АТСС 55730 существенно улучшает симптомы колики у младенцев, вскармливаемых грудью, по сравнению со стандартной терапией при помощи симетикона в течение 7 дней лечения. Процент ответа на лечение L.reuteri составил 95%, в то время как лишь 7% младенцев отвечали на симетикон. Эти результаты были представлены на Европейском Обществе Изучения Педиатрии (European Society for Pediatric Research (ESPR)) с 31 августа 2005 г. по 3 сентября 2005 г., Сиена, Италия (Pediatr Res. 2005; 58(2):411). Несмотря на то, что результаты Savino показали положительный эффект, он не определял связь между отдельными штаммами, способствующими продукции IL-10 и снижением моторики кишечника и, следовательно, коликой. Прилагаемое изобретение относится к способу селекции таких лучших штаммов.

Collins описал, что нарушения моторной функции обеспечивают разнообразные симптомы, которые могут возникать в контексте воспаления или активации иммунитета в различных областях кишечника и включать такие обычные расстройства, как эзофагит, гастрит и спонтанное воспалительное заболевание кишечника (IBD). Эти наблюдения предполагают, что моторика кишечника также подвержена влиянию иммунной системы. В этом контексте моторная система может играть важную роль в защите кишечника от токсичных стимулов, присутствующих в просвете (Collins S., The Immunomodulation of Enteric Neuromuscular Function: Implications for Motility and Inflammatory Disorders. Gastroenterology 1996; 111: 1683-1699). Эта точка зрения отражена, например, в наблюдении Vantrappen et al., которые показали, что чрезмерный рост бактерий в тонком кишечнике сопровождается нарушением нормальной циклической пищеварительной моторики в тонком кишечнике (Vantrappen G, Jannssens J, Hellemans J, Ghoos Y. The interdigestive motor complex of normal subjects and patients with bacterial overgrowth of small intestine. J Clin Invest 1977; 9: 1158-1168).

Хорошо известно на протяжении многих лет, что повышенные уровни IL-10 супрессируют избыточно активированные системы иммунитета. Ранее было также показано, что моторика кишечника контролируется неврологическими сигналами, которые связаны с иммунной системой кишечника, и что колика является следствием повышенной моторики кишечника, например вследствие чрезмерного роста бактерий.

В промышленно развитых странах гигиенические меры начинаются с момента рождения, что нарушает способности новорожденного усваивать микрофлору матери. Вследствие этого младенец получает другую микрофлору. Вместо содержания, например, Escherichia coli и Lactobacilli, новорожденные получают Staphylococcus aureus и другие кожные бактерии.

Авторы изобретения сделали неожиданное открытие, что чрезмерный рост кожных бактерий избыточно активирует иммунную систему младенца, что приводит к избыточно-активированной моторике кишечника и, как следствие, к колике, большее число специфических кишечных бактерий, таких как L.reuteri DSM 17938, со способностью стимулировать продукцию IL-10 приводит к созреванию TR системы, т.е. пролиферации CD4+CD25+TR-клеток. Активация CD4+CD25+ клеток приводит к спокойной моторике кишечника и, следовательно, к благоприятным эффектам на младенцев с коликой.

Благодаря этим открытиям были отобраны непатогенные бактериальные штаммы по свойствам, усиливающим IL-10, и неожиданно было обнаружено, что эти свойства штаммов коррелируют со снижением колики у детей. Следовательно, изобретение относится к применению L.reuteri DSM 17938 для получения препаратов для профилактики и/или лечения колики и других штаммов, отобранных тем же путем.

Другим объектом изобретения являются продукты, содержащие указанные штаммы, для введения животным, включая человека. Другие цели и преимущества будут очевидны из следующего описания и прилагаемой формулы изобретения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к определенным штаммам молочнокислых бактерий, отобранных по способности способствовать продукции IL-10 и, следовательно, пролиферации CD4+CD25+TR-клеток, для профилактики и/или лечения колик, к способу селекции таких штаммов и к продуктам, содержащим такие штаммы.

Другие объекты и признаки изобретения будут очевидны из следующего описания и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание изобретения

Фиг.1 - предполагаемая роль определенных отобранных штаммов молочнокислых бактерий в стимуляции развития CD4+CD25+TR-клеток.

Фиг.2а - продукция IL-10 ДК клетками в виде столбчатой диаграммы.

Фиг.2б - продукция IL-10 ДК клетками в таблице.

Подробное описание изобретения и предпочтительных вариантов его осуществления

Колонизация кожных бактерий в кишечнике и дефицит TR-клеток избыточно активируют иммунную систему новорожденного младенца, что приводит к избыточной активации моторики кишечника и, следовательно, к колике. Большое количество клеток специфических кишечных бактерий, таких как L.reuteri DSM 17938, обладающих способностью стимулировать продукцию IL-10, приводит к созреванию TR-системы, т.е. к пролиферации CD4+CD25+TR-клеток. Другие штаммы молочнокислых бактерий, как сообщалось многими исследователями ранее, индуцируют продукцию IL-10, например Rautava et al. (см. выше). Активация CD4+CD25+TR-клеток приводит к умеренной моторике кишечника и, следовательно, к благоприятным воздействиям на колику. Неожиданно было обнаружено, что штаммы, которые приводят к повышению уровней цитокина IL-10, одновременно являются штаммами, которые способны уменьшать среднее время плача (пример 2).

Настоящее изобретение относится к штаммам молочнокислых бактерий, которые были отобраны по способности снижать колику, включая L.reuteri DSM 17938. Продукты, такие как продукты питания, пищевые добавки и молочные смеси, лекарственные препараты или медицинское оборудование, содержащие цельные клетки или компоненты, выделенные из этих штаммов, могут быть получены в соответствии с известной в данной области рецептуре и включают, как известно, в основном, перевариваемую основу плюс штамм Lactobacillus или выделенный из него компонент.

Исследования in vitro могут использоваться в качестве способа селекции штаммов молочнокислых бактерий по способности стимулировать продукцию IL-10 в ДК моноцитарного ряда дифференцировки и посредством этого индуцировать развитие CD4+CD25+TR-клеток (Пример 1).

Данные описывают показатель сильной стимуляции IL-10 при помощи специфических штаммов L.reuteri АТСС 55730 и L.reuteri DSM 17938 и то, что эта регуляция опосредована веществом, выделяемым в ростовую среду двумя этими специфическими штаммами во время поздней логарифмической/стационарной фазы роста. Два штамма L.reuteri, напротив, не были способны стимулировать соответствующую продукцию IL-10.

Для подтверждения клинической значимости отобранных штаммов для профилактики или лечения колик проводятся дополнительные исследования у младенцев, вскармливаемых грудью, с диагнозом детской колики.

Признаки настоящего изобретения будут понятны из следующих примеров, которые не следует истолковывать, как ограничивающие изобретение.

Пример 1

Изучение способности штаммов пробиотиков стимулировать экспрессию IL-10 ДК моноцитарного ряда дифференцировки

Незрелые ДК образуются из моноцитов периферической крови (Hilkens, C.M.U., P. Kalinski, M. De Boer, and Kapsenberg. 1997. Human dendritic cells require exogenous interleukine-12-inducing factors to direct the development of native T-helper cells toward the Th1 phenotype. Blood 90:1920), культивируемых в IMDM (Life Technologies, Пейсли, Соединенное королевство), содержащей 10% FCS (HyClone, Логан, шт.Юта), рекомбинантный человеческий (rh)GM-CSF (500 ед./мл; Schering-Plough, Юден, Нидерланды) и rhIL-4 (250 ед./мл; Pharma Biotechnologie Hannover, Ганновер, Германия) (Kalinski, P., J.H.N. Schuitemaker, C.M.U. Hilkens, E. A. Wierenga, and M.L. Kapsenberg. 1999. Final maturation of dendritic cells is associated with impaired responsiveness to IFN-γ and to bacterial IL-12 inducers: decreased ability of mature dendritic cells to produce IL-12 during the interaction with Th cells. J. Immunol. 162:3231).

Штаммами, которые будут протестированы в эксперименте, являются Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacillus reuteri ATCC РТА 4660 и Lactobacillus reuteri ATCC РТА 4964, доступные в АТСС (Manassas, шт. Виржиния, США и DSMZ, Брауншвейг, Германия). Штаммы культивируют на агаре Columbia (Oxoid, Базингсток, Соединенное королевство), содержащем 6,25% овечьей крови. Молочнокислые бактерии инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Через 3 дня количество бактерий определяется измерением оптической плотности при 620 нм (OD620). Обычно OD620, равная 0,35, соответствовала 1×10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) для всех тестовых штаммов.

На 6 день созревание незрелых ДК индуцируют при помощи LPS (E.coli; Sigma-Aidrich, Сент Льюис, Марокко) и тестируют lactobacilli на присутствие сочетания цитокинов IL-1β (25 нг/мл) и TNF-α (50 нг/мл), используемых вместе в качестве факторов созревания (цитокины, приобретенные у Peprotech, Роки Хилл, Нью-Джерси).

Продукция цитокинов IL-12, IL-10 и IL-6 зрелыми ДК определяется посредством 24-часовой стимуляции при помощи CD40 лигандэкспрессирующих клеток плазмоцитомы мыши (J558), как описано Vieira PL et al. (Vieira PL, de Jong EC, Wierenga EA, Kapsenberg ML, Kalinski P. Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J Immunol 2000; 164: 4507-12). После 24 ч супернатанты собирают и измеряют концентрации IL-10 при помощи ELISA. Результаты см. на фиг.2. Как видно из результатов, существует существенное различие во влиянии различных штаммов Lactobacillus и их способности стимулировать продукцию IL-10 у ДК.

Пример 2

Отобранные штаммы пробиотиков в сравнении с Симетиконом в лечении детской колики

Младенцев, вскармливаемых грудью, с диагнозом детской колики набирали в Отделении детской и подростковой науки (Больница университета Дроттинг Сильвия, Гетеборг). Пациенты в возрасте 21-90 дней, соответствующие внутриутробному возрасту с массой при рождении между 2500 и 4000 г, с симптомами колики, удовлетворяющими критериям Вессела и возникшими почти 6±1 дней до регистрации, рассматриваются для включения в исследование (Wessel MA, Cobb JC, Jackson EB, Harris GS, Detwiler AC. Paroximal fussing in infancy, sometimes called “colic”. Pediatrics 1954; 14: 421-35). Все зарегистрированные младенцы находятся исключительно на грудном вскармливании, чтобы уменьшить вариабельность кишечной микрофлоры из-за вариаций в диете, которые могли бы, в свою очередь, вызвать ответ на пробиотики. Младенцы исключались, если у них существовали клинические доказательства хронической болезни или гастроинтестинальных нарушений, или если они получали антибиотики или пробиотики на неделе, предшествовавшей набору.

В этом исследовании младенцев с коликами случайно отбирали для получения пробиотиков или Симетикона в последующем лечении:

(Р1) Lactobacillus reuteri штамм ATCC 55730, называемый также SD2112;

(Р2) Lactobacillus reuteri штамм DSM 17938 (выделенный DSMZ-Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг) 6 февраля 2006 г., под Budapest Treaty);

(P3) Lactobacillus reuteri штамм ATCC РТА 4660; и

(S) Симетикон.

L.reuteri вводят в дозе 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 5 каплях серийно выпускаемого МСТ-масла (среднецепочечно триглицеридное масло), через 30 мин после еды, один раз в день, в течение 28 дней. МСТ-масло получают естественным путем, и наиболее распространенным источником является кокосовое масло. Большую часть МСТ-масла перерабатывают из кокосового масла. МСТ-масло представляет собой прозрачную светлоокрашенную жидкость с приятным запахом и низкой вязкостью. Эта масляная суспензия стабильна в течение 21 месяца при 2-8°С (как описано производителем, BioGaia AB, Стокгольм, Швеция) (альтернативным источником МСТ-масла является Alkomed R, Karlshamns AB, Карлшамн, Швеция). Во время исследования родителей информировали, чтобы они держали продукт в холодильнике, когда он не используется. Симетикон (S) давали в дозе 60 мг/в день в 3 мл серийно выпускаемого раствора (Mylicon Infant Gas Relief Drops, J&J, 7050 Кемп Хилл Роад, Форт Вашингтон, Пенсильвания, 19034-2210, США) после еды, дважды в день, в течение 28 дней. Сказано, что при регистрации всех матерей просили соблюдать диету, исключающую коровье молоко: отменить молоко, йогурт, мягкий и твердый сыр, сметану, масло, пирожные. Строгое соблюдение диеты отслеживается с помощью дневника диеты, ведущегося на протяжении всего периода лечения. На 7, 14, 21 и 28 день один из исследователей проверяет соответствие диете.

Этический комитет в Институте одобрил протокол исследования, и младенцы регистрируются в исследовании только после получения письменного информированного согласия от родителей.

Контрольные посещения

День, в который педиатр смотрел ребенка первый раз, определен, как - 1 день. В данном случае каждый ребенок проходил медицинское обследование, а родителей опрашивали с целью получения основополагающей информации, касающейся типа родоразрешения, веса при рождении и внутриутробного возраста, семейного анамнеза желудочно-кишечного заболевания и атопии. В частности, последнее считалось положительным, если у младенцев был один или более членов семьи (мать, отец и/или старший сиблинг) с атопической экземой, аллергическим ринитом или астмой. Более того, регистрировались любые признаки и симптомы атопического заболевания в период исследования. Родителей также приглашали, чтобы зарегистрировать информацию, касающуюся среднего времени плача в день и количества приступов колики в день после набора (0 день). Врач случайным образом приписывал младенца к любой из исследуемых групп. Введение исследуемых продуктов началось в 1 день.

Родителям выдавали письменную информацию об исследовании и просили регистрировать количество приступов безутешного плача в день и их продолжительность, консистенцию стула и частоту, а также любые наблюдаемые побочные эффекты (констипация, рвота, кожные реакции и т.д.), начиная с 0 дня до 28 день, используя структурированный дневник. Чтобы убедиться, что все родители отмечали время плача одинаковым способом, и убедиться, что препараты правильно даются младенцам, один из исследователей всегда доступен по телефону, чтобы помочь родителям.

Каждого пациента осматривает один и тот же педиатр на 1, 7, 14, 21 и 28 день.

Результаты

Из 120 зарегистрированных младенцев, вскармливаемых грудью, 30 случайным образом приписаны к лечению Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (Р1), 30 случайным образом приписаны к лечению Lactobacillus reuteri DSM 17938 (Р2), 30 случайным образом приписаны к лечению Lactobacillus reuteri ATCC РТА 4660 (P3) и 30 к Симетикону (S). Ни одного младенца не выбыло из-за побочного эффекта, связанного с опытом. Группы сходны по возрасту, весу при рождении, полу, типу родоразрешения, семейному анамнезу атопии или желудочно-кишечных заболеваний и воздействию курения.

Среднее время плача в день сходно в лечебных группах в 0 день и в 1 день. Было показано существенное уменьшение ежедневного времени плача у младенцев, получающих Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (Р1) и DSM 17938 (Р2), к 7 дню, по сравнению с младенцами, которых лечили ATCC РТА 4660 (P3) и Симетиконом (S). На 14, 21 и 28 день время плача существенно отличается между четырьмя лечебными группами. Отличие между (Р1) и (S) по среднему времени плача в день от начала до конца исследования составляет 82 минуты, а отличие между (Р2) и (S) по среднему времени плача в день от начала до конца исследования составляет 83 минуты по состоянию на 28 день (Таблица 1). Как видно из результатов, четыре лечебные группы более или менее равны до введения тестовых продуктов. Уже после 7 дней существует ясное отличие в пользу Lactobacillus reuteri штаммов ATCC 55730 и DSM 17938 по сравнению с двумя другими альтернативами. По прошествии 28 дней отличие увеличилось.

Несмотря на то, что изобретение было описано на основании специфических воплощений, будет высоко оценено то, что возможны бесчисленные вариации, модификации и воплощения, и, следовательно, все подобные вариации, модификации и воплощения следует рассматривать, как входящие в сущность и в рамки изобретения.