СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТА ИЗ ПОПЕРЕЧНО-СШИТОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Область техники

Настоящее изобретение относится к области полисахаридов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым способам сшивания гиалуроновой кислоты (ГК) и изготовления продуктов из поперечно-сшитой ГК.

Предшествующий уровень техники

Одним из наиболее широко используемых биосовместимых полимеров для медицинского применения является гиалуроновая кислота (ГК). Это природный полисахарид, принадлежащий к группе гликозаминогликанов (ГАГ). ГК и другие ГАГ представляют собой отрицательно заряженные гетерополисахаридные цепи, способные поглощать большое количество воды. ГК и продукты, полученные из ГК, широко используются в биомедицинских и косметических областях, например в вискохирургии, и в качестве дермального наполнителя.

Водопоглощающие гели или гидрогели широко используются в области биомедицины. Их обычно получают путем химического сшивания полимеров в бесконечные сети. В то время как природная ГК и определенные продукты из поперечно-сшитой ГК поглощают воду до тех пор, пока они полностью не растворятся, гели из поперечно-сшитой ГК, как правило, поглощают определенное количество воды до тех пор, пока они не станут насыщенными, то есть они имеют конечную способность удерживать жидкость или степень набухания.

Поскольку ГК идентичной химической структуры, за исключением ее молекулярной массы, присутствует в большинстве живых организмов, она индуцирует минимум нежелательных реакций, что позволяет ее использовать для передовых медицинских применений. Сшивание и/или другие модификации молекулы ГК необходимы для улучшения ее устойчивости к разложению или времени действия in vivo. Кроме того, такие модификации влияют на способность молекулы ГК удерживать жидкость. Как следствие, ГК была предметом многих попыток модификации.

При получении гелей из биосовместимых полимеров целесообразно обеспечить низкую степень сшивки для поддержания высокой биологической совместимости. Однако часто требуется, чтобы более плотный гель имел надлежащий биомедицинский эффект, и в таком случае биосовместимость часто будет потеряна.

Некоторые известные способы наращивания мягких тканей, включающие имплантаты, иногда имеют недостаток, который заключается в том, что имплантат или его часть мигрирует от желаемого места обработки.

В WO 87/07898 раскрыт способ получения пленок из ГК. Любое гелеобразование следует устранить до стадии сшивания, которая включает в себя сушку водного раствора эпокси-активированной ГК с образованием пленки. Имманентным признаком способа является то, что все другие компоненты на стадии сшивания должны быть летучими.

В WO 2004/092223 описан способ получения геля из поперечно-сшитой ГК путем высушивания смеси ГК и эпоксидного сшивающего агента без существенного удаления эпоксида.

Аналогичным образом, в WO 2011/109129 и WO 2011/109130 раскрыт способ получения нитей из ГК путем высушивания ГК в присутствии сшивающего агента при неденатурирующих условиях.

В US 5827937 раскрыт способ получения полисахаридов, имеющих высокую степень сшивки.

В WO 00/046253 описан способ, включающий два типа стадий сшивания, каждая из которых осуществляется в присутствии сшивающего агента, для повышения степени сшивки ГК.

В US 2007/0066816 раскрыт способ получения дважды поперечно-сшитой ГК, включающий сшивание субстрата ГК в две стадии с использованием эпоксида и карбодиимида, соответственно.

В US 6852255 раскрыт способ, включающий сшивание водного раствора ГК с последующим формованием поперечно-сшитой ГК, например, путем добавления органического растворителя для осаждения поперечно-сшитой ГК.

US 4716224 относится к способу получения поперечно-сшитой ГК, имеющей повышенную устойчивость к ферментативному разложению. Отмечается, что ГК можно осаждать перед добавлением сшивающего агента.

В KR 2007/0004159 раскрыт способ получения поперечно-сшитой ГК, в котором ГК в твердой фазе подвергают воздействию сшивающего агента в органическом растворителе.

ЕР 2199308 относится к способу получения поперечно-сшитой ГК путем диспергирования порошка ГК в водном спирте перед добавлением сшивающего агента.

В US 6921819 раскрыт способ сшивания ГК, в котором полифункциональный сшивающий агент подвергают взаимодействию с ГК в твердом состоянии в процессе гидратации.

Несмотря на успехи в данной области, сохраняется потребность в альтернативных способах получения продуктов из поперечно-сшитой ГК, имеющих подходящую способность удерживать жидкость и пригодный профиль разложения с сохраненной биосовместимостью. В частности, желательно свести к минимуму степень модификации, которая необходима для получения продукта в виде геля ГК, имеющего желаемую прочность геля, которая, например, может быть измерена в виде способности удерживать жидкость.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является предложение нового способа получения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты (ГК), который отвечает одному или более из следующих критериев:

- низкое включение сшивающего агента

- ограниченное количество побочных реакций, например, с окружающей средой и ионами галогенов

- контролируемые условия реакции

- хорошая воспроизводимость способа

- подходит для расширения масштабов до промышленного получения

- ограниченное общее время процесса

- достаточная прочность геля, чтобы противостоять деформации и миграции при имплантации

- позволяет использовать несколько типов агентов (например, буферов, щелочей, кислот, солей) на стадиях способа.

Для решения этих задач и/или других задач, которые очевидны из данного описания, было понятно, что основная задача настоящего изобретения заключается в разработке способа получения формованного продукта из поперечно-сшитой ГК, имеющего степень модификации от низкой до умеренной и, в то же время, высокую прочность геля, которая характеризуется от низкой до умеренной способностью удерживать жидкость или степенью набухания.

Настоящее изобретение предлагает универсальный контроль процесса сшивания ГК путем контроля эффективности модификации ГК для конкретного сшивающего агента, т.е. контролируя эффективность процесса сшивания при получении геля требуемой прочности. Таким образом, настоящее изобретение позволяет изготавливать гель, имеющий требуемую прочность (ограниченную степень набухания) с удивительно низкой химической модификацией ГК. Это выгодно для минимизации проблем, связанных с биосовместимостью, но в целом и для улучшения контроля процесса сшивания ГК.

Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка способа получения продукта из поперечно-сшитой ГК, в котором высокая доля связанного сшивающего агента (агентов) присоединена (по меньшей мере) двумя концами, то есть для достижения высокой эффективности сшивания.

Задачей настоящего изобретения также является предложение продукта из поперечно-сшитой ГК, который имеет умеренную степень модификации и, в то же время, от низкой до умеренной способность удерживать жидкость или степень набухания.

Задачей настоящего изобретения также является предложение продукта из поперечно-сшитой ГК, который имеет высокую устойчивость к деформации.

Для решения этих и других задач, которые будут очевидны из данного описания, настоящее изобретение предлагает в соответствии с первым аспектом способ получения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты (ГК), включающий:

(a) инициацию сшивания ГК путем реакции ГК с одним или более полифункциональным сшивающим агентом в водном растворе с получением активированной ГК;

(b) удаление непрореагировавшего сшивающего агента (агентов) из активированной ГК; и

(c) завершение сшивания активированной ГК путем воздействия на активированную ГК дополнительными условиями сшивания без добавления какого-либо дополнительного сшивающего агента с получением продукта из поперечно-сшитой ГК; в котором конечную стадию сшивания (с) осуществляют в суспензии жидкой осаждающей среды и активированной ГК в осажденной форме.

Этот способ обеспечивает хороший контроль конечной стадии сшивания, поскольку оно происходит только в твердой (осажденной) фазе. Полученный продукт уникален тем, что он представляет собой гель с низкой степенью набухания, несмотря на низкую степень модификации ГК. Весьма удивительно, что гелевый продукт, имеющий ограниченную степень набухания, вообще может быть получен с такой низкой степенью модификации.

В одном варианте осуществления способа согласно изобретению стадия удаления (b) включает: (b1) осаждение активированной ГК в жидкой осаждающей среде с получением суспензии, содержащей жидкую осаждающую среду и активированную ГК в осажденной форме; и (b2) удаление непрореагировавшего сшивающего агента (агентов) из суспензии осажденной активированной ГК. Возможно, удаление на подстадии (b2) включает промывку осажденной активированной ГК жидкой осаждающей средой.

Удаление сшивающего агента из активированной ГК в осажденной форме является выгодным, поскольку обеспечивает быстрое получение очень чистого промежуточного продукта, т.е. без оставшегося непрореагировавшего сшивающего агента. Эта стадия удаления сшивающего агента также очень полезна в крупномасштабном процессе.

В другом варианте осуществления способа согласно изобретению завершающая стадия сшивания (с) включает: (с1) осаждение активированной ГК в жидкой осаждающей среде с получением суспензии, содержащей жидкую осаждающую среду и активированную ГК в осажденной форме; и (с2) завершение сшивания активированной ГК путем воздействия на суспензию осажденной активированной ГК дополнительными условиями сшивания без добавления какого-либо дополнительного сшивающего агента с получением продукта из поперечно-сшитой ГК.

В определенных вариантах осуществления способа согласно изобретению жидкая осаждающая среда содержит более 65 масс. % водорастворимого органического растворителя, предпочтительно от 70 до 80 масс. % водорастворимого органического растворителя, и от 20 до 30 масс. % воды.

В некоторых вариантах осуществления способа согласно изобретению водорастворимый органический растворитель содержит или состоит из одного или более низших алкильных спиртов, предпочтительно этанола.

В определенных вариантах осуществления способа согласно изобретению первоначальная стадия сшивания (а) обеспечивает получение активированной ГК в форме геля. Эта форма геля облегчает последующие стадии, такие как манипулирование, придание формы, промывка и осаждение.

В определенных вариантах осуществления способа согласно изобретению сшивающий агент выбирают из группы, состоящей из дивинилсульфона, полиэпоксидов и диэпоксидов. Предпочтительная группа сшивающих агентов состоит из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидилового эфира (EDDE) и диэпоксиоктана, и в частности 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE).

В определенных вариантах осуществления способа согласно изобретению способ дополнительно включает стадии, на которых: (d) осажденный продукт из поперечно-сшитой ГК со стадии (с) подвергают воздействию неосаждающих условий; и (е) выделяют продукт из поперечно-сшитой ГК в неосажденной форме.

В некоторых вариантах осуществления способа согласно изобретению способ дополнительно включает стадию стерилизации продукта из поперечно-сшитой ГК.

Настоящее изобретение в соответствии со вторым аспектом предлагает продукт из поперечно-сшитой ГК, имеющий эффективное отношение сшивающего агента 0,35 или 35% или выше, предпочтительно в диапазоне от 35 до 80%, например от 40 до 80% или от 50 до 80%. Эффективное отношение сшивающего агента (CrR от англ. Cross-linker ratio) характеризует долю сшивающего агента от всего связанного сшивающего агента (агентов) (ГК-Х-ГК и ГК-Х), который связывает два (или более) дисахаридов (только ГК-Х-ГК), где X представляет собой сшивающий агент. Эффективное отношение сшивающего агента можно определить, например, с помощью ЖХ-МС (жидкостная хромато-масс-спектрометрия) после ферментативного разрушения геля ГК. Например, эффективное отношение сшивающего агента можно определить путем определения фрагментов ГК-Х с использованием ЖХ-МС после ферментативного разрушения геля ГК, например, с помощью хондроитиназы АС от Arthrobacter aurescens или хондроитиназы ABC от Proteus vulgaris на фрагменты, состоящие из основного дисахарида (Δди-ГК), и фрагменты со связанным сшивающим агентом (ГК-Х), содержащие от 1 до 8 дисахаридов. Фрагменты затем можно разделить с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC от англ. size exclusion chromatography) и детектировать с использованием масс-спектрометрии (МС). Этот способ можно легко приспособить для любого полифункционального сшивающего агента, используя принципы, описанные в работе Kenne и др., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418 (Углеводные полимеры), и корректируя/адаптируя массы фрагментов ГК-Х и ГК-Х-ГК в способе ЖХ-МС для конкретного используемого сшивающего агента.

В некоторых вариантах осуществления продукта из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению этот продукт имеет степень набухания от 4 до 500 мл на грамм ГК и предпочтительно от 15 до 300 мл на грамм ГК.

Настоящее изобретение в соответствии с третьим аспектом предлагает водную композицию, содержащую продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению и, возможно, буферный агент и/или агент, регулирующий тоничность.

В соответствии с четвертым аспектом настоящее изобретение предлагает предварительно заполненный шприц, который предварительно заполнен продуктом из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению или его водной композицией.

В соответствии с пятым аспектом настоящее изобретение предлагает применение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению или его водной композиции в косметической хирургической операции, например, для дермального наполнения, контурной пластики тела и контурной пластики лица, в медицинской хирургической операции, например, для дермального наполнения, контурной пластики тела, предотвращения адгезии тканей, формирования каналов, лечения недержания и ортопедических применений, и для гидратации и/или оздоровления кожи.

В соответствии с шестым аспектом настоящее изобретение предлагает способ лечения субъекта, подвергающегося косметической или медицинской хирургической операции, включающий введение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению или его водной композиции субъекту, нуждающемуся в этом.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показаны схематические способы сшивания ГК.

На фиг. 2 показано продолжение схематических способов сшивания ГК.

На фиг. 3 показано эффективное отношение сшивающего агента (CrR) для частиц ГК для различного времени реакции и различных температур на конечной стадии сшивания.

На фиг. 4 показано разрушение гелей ГК, вызванное нагреванием.

На фиг. 5 показано разрушение гелей ГК, вызванное перекисными радикалами.

Пронумерованный список вариантов осуществления изобретения

1. Способ получения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты (ГК), в котором:

(a) инициируют сшивание ГК путем реакции ГК с одним или более полифункциональных сшивающих агентов в водном растворе с получением активированной ГК;

(b) удаляют непрореагировавший сшивающий агент (агенты) из активированной ГК; и

(c) завершают сшивание активированной ГК путем воздействия на активированную ГК дополнительными условиями сшивания без добавления какого-либо дополнительного сшивающего агента с получением продукта из поперечно-сшитой ГК; в котором конечную стадию сшивания (с) осуществляют в суспензии жидкой осаждающей среды и активированной ГК в осажденной форме.

2. Способ согласно варианту осуществления 1, в котором стадия удаления (b) включает:

(b1) осаждение активированной ГК в жидкой осаждающей среде с получением суспензии, содержащей жидкую осаждающую среду и активированную ГК в осажденной форме; и

(b2) удаление непрореагировавшего сшивающего агента (агентов) из суспензии осажденной активированной ГК.

3. Способ согласно варианту осуществления 2, в котором подстадия удаления (b2) включает промывку осажденной активированной ГК жидкой осаждающей средой.

4. Способ согласно варианту осуществления 1, в котором конечная стадия сшивания (с) включает:

(с1) осаждение активированной ГК в жидкой осаждающей среде с получением суспензии, содержащей жидкую осаждающую среду и активированную ГК в осажденной форме; и

(с2) завершение сшивания активированной ГК путем воздействия на суспензию активированной ГК дополнительными условиями сшивания без добавления какого-либо дополнительного сшивающего агента с получением продукта из поперечно-сшитой ГК.

5. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором жидкая осаждающая среда содержит более 65 масс. % водорастворимого органического растворителя.

6. Способ согласно варианту осуществления 5, в котором жидкая осаждающая среда содержит от 70 до 80 масс. % водорастворимого органического растворителя и от 20 до 30 масс. % воды.

7. Способ согласно любому из вариантов осуществления 5-6, в котором водорастворимый органический растворитель содержит один или более низших алкильных спиртов.

8. Способ согласно варианту осуществления 7, в котором водорастворимый органический растворитель представляет собой этанол.

9. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором суспензия на конечной стадии сшивания (с) имеет рН 9 или выше.

10. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором конечную стадию (с) сшивания осуществляют при температуре от 10 до 50°C.

11. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором раствор на первоначальной стадии сшивания (а) имеет рН 9 или выше.

12. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором первоначальную стадию сшивания (а) осуществляют при температуре от 10 до 55°C.

13. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором на первоначальной стадии сшивания (а) получают активированную ГК в форме геля.

14. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором перед конечной стадией сшивания (с) получают желаемую форму активированной ГК, полученной на стадии (а).

15. Способ согласно варианту осуществления 14, в котором получение желаемой формы активированной ГК, полученной на стадии (а), осуществляют перед удалением непрореагировавшего сшивающего агента (агентов) из активированной ГК на стадии (b).

16. Способ согласно любому из вариантов осуществления 14-15, в котором желаемая форма представляет собой частицы размером от 0,1 до 5,0 мм.

17. Способ согласно любому из вариантов осуществления 14-15, в котором желаемая форма представляет собой ленту, сетку или пленку.

18. Способ согласно варианту осуществления 17, в котором желаемая форма представляет собой ленту, имеющую соотношение между ее длиной и шириной 5:1 или выше.

19. Способ согласно любому из вариантов осуществления, в котором сшивающий агент выбирают из группы, состоящей из дивинилсульфона, полиэпоксидов и диэпоксидов.

20. Способ согласно варианту осуществления 19, в котором сшивающий агент выбирают из группы, состоящей из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидилового эфира (EDDE) и диэпоксиоктана.

21. Способ согласно варианту осуществления 20, в котором сшивающий агент представляет собой 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE).

22. Способ согласно любому из вариантов осуществления, дополнительно включающий стадии, на которых:

(d) осажденный продукт из поперечно-сшитой ГК со стадии (с) подвергают воздействию неосаждающих условий; и

(e) выделяют продукт из поперечно-сшитой ГК в неосажденной форме.

23. Способ согласно любому из вариантов осуществления, включающий стадию стерилизации продукта из поперечно-сшитой ГК.

24. Продукт из поперечно-сшитой ГК, имеющий эффективное отношение сшивающего агента 35% или выше.

25. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно варианту осуществления 24, имеющий эффективное отношение сшивающего агента в диапазоне от 35 до 80%.

26. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-25, имеющий степень набухания от 4 до 500 мл на грамм ГК.

27. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно варианту осуществления 26, имеющий степень набухания от 15 до 300 мл на грамм ГК.

28. Продукт из поперечно-сшитой ГК, полученный способом согласно любому из вариантов осуществления 1-23.

29. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-27, полученный способом согласно любому из вариантов осуществления 1-23.

30. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-29, имеющий форму частиц с размерами от 0,1 до 5,0 мм.

31. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-29, имеющий форму ленты, сетки или пленки.

32. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно варианту осуществления 31, в котором форма представляет собой ленту, имеющую соотношение между ее длиной и шириной 5:1 или выше.

33. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-32, в котором продукт ГК находится в высушенной форме.

34. Водная композиция, содержащая продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-32, и, возможно, буферный агент и/или агент, регулирующий тоничность.

35. Водная композиция согласно варианту осуществления 34, дополнительно содержащая одно или более медицинских соединений.

36. Водная композиция согласно варианту осуществления 35, где медицинское соединение выбрано из группы, состоящей из местных анестетиков, противовоспалительных лекарственных средств, антибиотиков и факторов роста костей.

37. Водная композиция согласно варианту осуществления 36, где медицинское соединение (соединения) включает гидрохлорид лидокаина.

38. Применение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-33 или водной композиции согласно любому из вариантов осуществления 34-37 в косметической хирургической операции, такой как дермальное наполнение, контурная пластика тела и контурная пластика лица.

39. Применение согласно варианту осуществления 38, в котором косметическая хирургическая операция представляет собой контурную пластику лица.

40. Применение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-33 или водной композиции согласно любому из вариантов осуществления 34-37 для гидратации и/или оздоровления кожи.

41. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-33 или водная композиция согласно любому из вариантов осуществления 34-37 для применения в качестве лекарственного средства или медицинского устройства.

42. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-33 или водная композиция согласно любому из вариантов осуществления 34-37 для применения в косметической хирургической операции, такой как дермальное наполнение, контурная пластика тела и контурная пластика лица, или в медицинской хирургической операции, такой как дермальное наполнение, контурная пластика тела, предотвращение адгезии тканей, формирование каналов, лечение недержания и ортопедические применения.

43. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно варианту осуществления 42, в котором косметическая хирургическая операция представляет собой контурную пластику лица.

44. Применение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-33 или водной композиции согласно любому из вариантов осуществления 34-37 для изготовления лекарственного средства или медицинского устройства для применения в косметической хирургической операции, такой как дермальное наполнение, контурная пластика тела и контурная пластика лица, или в медицинской хирургической операции, такой как дермальное наполнение, контурная пластика тела, предотвращение адгезии тканей, формирование каналов, лечение недержания и ортопедические применения.

45. Применение согласно варианту осуществления 44, в котором косметическая хирургическая операция представляет собой контурную пластику лица.

46. Предварительно заполненный шприц, который предварительно заполнен продуктом из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-33 или водной композицией согласно любому из вариантов осуществления 34-37.

47. Способ лечения субъекта, подвергающегося косметической или медицинской хирургической операции, включающий введение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно любому из вариантов осуществления 24-33 или водной композиции согласно любому из вариантов осуществления 34-37 субъекту, нуждающемуся в этом.

48. Способ согласно варианту осуществления 47, в котором косметическая хирургическая операция представляет собой контурную пластику лица.

Подробное описание изобретения

Согласно первому аспекту настоящее изобретение предлагает способ получения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты (ГК), который имеет высоко желаемые свойства. Этот способ обеспечивает хороший контроль конечной стадии сшивания, поскольку оно происходит только в твердой (осажденной) фазе. Полученный продукт уникален тем, что он представляет собой гель с низкой степенью набухания, несмотря на низкую степень модификации ГК. Весьма удивительно, что гелевый продукт, имеющий ограниченную степень набухания, вообще может быть получен с такой низкой степенью модификации. Помимо многих применений, этот способ позволяет получать продукты из поперечно-сшитой ГК, имеющие заранее заданную форму, которая сохраняется в течение способа получения. Этот способ также позволяет производить биосовместимые формованные продукты из поперечно-сшитой ГК.

Если не предусмотрено иное, термины "гиалуроновая кислота" или «ГК» используются взаимозаменяемо и охватывают все варианты и комбинации вариантов гиалуроновой кислоты или гиалуронана с различной длиной цепи и различных заряженных состояний, а также различные химические модификации. То есть, этот термин охватывает также различные гиалуронатные соли ГК, такие как гиалуронат натрия (NaГК). Различные модификации гиалуроновой кислоты также охватываются термином, таким как окисление, например, окисление групп -СН₂ОН в группы -СООН; окисление периодатом вицинальных гидроксильных групп, необязательно с последующим восстановлением или образованием иминов и т.п.; восстановление, например, восстановление -СООН в -СН₂ОН; сульфатирование; дезамидирование, необязательно с последующим дезаминированием или образованием амидов с новыми кислотами; этерификация; замещение различными соединениями, например, с использованием сшивающего агента или карбодиимида; включая конденсацию различных молекул, таких как белки, пептиды и активные лекарственные компоненты, с ГК; и дезацетилирование. Специалисту в данной области хорошо известно, что различные формы ГК имеют различные химические свойства, которые должны быть учтены при химической модификации и во время анализа. Например, если желательно получить раствор ГК, имеющей определенное рН, на конечное рН раствора будут влиять кислотность материала, подлежащего растворению, кислотность растворяющей жидкости и любая буферная емкость.

Предпочтительно, чтобы субстрат ГК представлял собой ГК или гиалуронатную соль без химических модификаций, т.е. которая не была подвергнута сшиванию или другим модификациям перед настоящим способом получения.

ГК может быть получена из различных источников животного и неживотного происхождения. Источники неживотного происхождения включают дрожжи и предпочтительно бактерии. Молекулярная масса одной молекулы ГК, как правило, составляет от 1,5 до 3 МДа, но другие молекулярные массы также возможны, например, от 0,5 до 10 МДа.

Продукт, изготовленный этим способом, представляет собой поперечно-сшитую ГК. Этот способ обеспечивает поперечные сшивки между цепями ГК, что создает непрерывную формованную сеть молекул гиалуроновой кислоты, которая удерживается ковалентными поперечными связями, физическим перепутыванием цепей ГК и различными взаимодействиями, такими как водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и электростатические взаимодействия. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению является гелем или гидрогелем. То есть, его можно рассматривать как нерастворимую в воде, но по существу разбавленную поперечно-сшитую систему молекул ГК при воздействии на него жидкости, обычно водной жидкости.

Конечный продукт из поперечно-сшитой ГК предпочтительно является биосовместимым. Это означает, что отсутствует или имеется только очень слабый иммунный ответ у обработанного человека.

Поскольку гелевые продукты из поперечно-сшитой ГК являются очень сложными химическими структурами, они, как правило, характеризуются сочетанием их химических структур и их физических свойств. Отклонения в химической структуре от немодифицированной ГК, как правило, характеризуются как степень модификации, модифицикационная степень, степень сшивки, показатель сшивки или химическая модификация, все из которых связаны с количеством сшивающего агента, ковалентно связанного с ГК. В данном описании будет использоваться термин «степень модификации».

Наиболее релевантные физические свойства гелевого продукта из поперечно-сшитой ГК - это объем жидкости, который может поглощать гель, и реологические свойства геля. Эти оба свойства описывают структурную стабильность геля, которую часто называют прочностью геля или твердостью геля, но, хотя поглощение жидкости может быть определено для сухого геля, реологические свойства должны быть измерены на геле, который находится в набухшем состоянии до требуемой концентрации. Традиционными понятиями, отражающими поглощение жидкости, являются набухание, способность к набуханию, способность удерживать жидкость, степень набухания, степень набухания, максимальное поглощение жидкости и максимальное набухание. На протяжении всего этого описания будет использоваться термин «степень набухания». Относительно реологических свойств гелевых продуктов из поперечно-сшитой ГК можно отметить, что вращательная реометрия полезна только для определения реологических свойств жидкостей, в то время как для определения реологии гелей необходима осциллирующая реометрия. Измерение дает сопротивление геля деформации в виде модуля упругости и модуля вязкости. Высокая прочность геля обеспечит большую устойчивость к деформации гелевого продукта, набухшего до требуемой концентрации.

Некоторые известные способы наращивания мягких тканей, включающие имплантаты, иногда имеют недостаток, который заключается в том, что имплантат или его часть мигрирует от желаемого места обработки. Для устранения этой проблемы гель должен иметь определенную прочность для противодействия деформации. Это свойство может быть измерено с помощью реометрии в осциллирующем режиме.

Способ согласно изобретению включает по меньшей мере три стадии и, возможно, состоит из них: первоначальную или инициирующую стадию сшивания, стадию удаления сшивающего агента и конечную или завершающую стадию сшивания. Первую стадию сшивания можно осуществить с использованием многих различных температур, времени и концентраций. На первой стадии сшивания определяется степень модификации и происходит сшивание в небольшой степени. Независимо от того, как происходит сшивание на первой стадии, эффективное отношение сшивающего агента повышается на второй стадии сшивания, обычно до коэффициента от 2 до 6 или даже выше.

На первой стадии способа инициируют сшивание субстрата ГК или, если сказать иначе, осуществляют первоначальное сшивание субстрата ГК. Субстрат ГК присутствует в водном растворе и ему позволяют взаимодействовать с одним или более полифункциональных сшивающих агентов. Это приводит к существенному сшиванию субстрата ГК, т.е. ковалентное связывание двух отдельных молекул ГК или двух отдаленных частей одной и той же молекулы ГК достигается уже на этой стадии. Как будет видно из раскрытия других стадий способа, сшивающий агент добавляют только до или во время этой первоначальной стадии (а) сшивания.

В предпочтительном варианте осуществления первоначальная стадия (а) сшивания приводит к получению активированной ГК в форме геля. В дополнение к поперечным связям между отдельными молекулами ГК или отдаленными частями одной и той же молекулы ГК, это также приводит к тому, что большое количество сшивающих агентов ковалентно связывается с субстратом ГК в одном положении, и что ГК, полученная в результате этой стадии, замещается несколькими сшивающими агентами, имеющими реакционноспособные сшивающие группы. Таким образом, полученная в результате активированная ГК содержит смесь сшитых молекул ГК, в которых каждая сшивка включает ковалентную связь между (по меньшей мере) двумя отдельными молекулами ГК или двумя отдаленными частями одной и той же молекулы ГК, и ГК, замещенной сшивающими агентами, имеющими реакционноспособные сшивающие группы, т.е., как правило, включающей одно ковалентное связывание все еще реакционноспособного сшивающего агента в отношении ГК.

Субстрат ГК растворен в водном растворе. Под термином "растворен" и "раствор" понимают, что субстрат ГК присутствует в однородной смеси с жидкостью, в которой происходят энергетически выгодные взаимодействия. Добавление жидкости в раствор снижает концентрацию растворенного субстрата ГК. Раствор является водным, т.е. он содержит воду. Водный раствор может просто состоять из субстрата ГК, растворенного в воде. В предпочтительном варианте раствор на первоначальной стадии (а) сшивания имеет рН 9 или выше, например 10 или выше, или даже 11 и выше.

В общих чертах, первоначальную стадию сшивания (а) можно выполнять с использованием любых концентраций ГК и сшивающего агента, и температуру и время можно варьировать до тех пор, пока не будет достигнуто первоначальное сшивание ГК и не останется реакционноспособных сшивающих агентов, ковалентно связанных с ГК.

Первоначальную стадию сшивания (а) обычно выполняют при температуре от 10 до 75°C, но предпочтительно эту стадию выполняют при комнатной температуре, например от 20 до 25°C. Другими предпочтительными диапазонами температур являются от 10 до 55°C, например от 18 до 35°C и от 35 до 55°C.

Водный раствор на первоначальной стадии сшивания содержит один или более сшивающих агентов, которые являются полифункциональными, то есть имеют два или более реакционноспособных места для образования ковалентных связей с молекулами ГК, которые подлежат сшиванию. Предпочтительно, чтобы сшивающий агент (агенты), который используется на третьей стадии, являлся бифункциональным, т.е. имел два реакционноспособных места для образования ковалентных связей с молекулами ГК, которые подлежат сшиванию. Но, не ограничиваясь этим, полезные полифункциональные сшивающие агенты включают дивинилсульфон, полиэпоксиды и диэпоксиды, такие, как 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидиловый эфир (EDDE) и диэпоксибутан, предпочтительно BDDE. Желательно, чтобы один или более полифункциональных сшивающих агентов образовывали простые эфирные поперечные связи.

Первоначальная стадия сшивания (а) также может включать, либо за ней может следовать получение желаемой формы активированной ГК, такой как частица, волокно, лента, нить, сетка, пленка, диск и шарик. Это может быть достигнуто различными способами, например экструзией, измельчением и литьем. Экструзия субстрата ГК обычно включает его прессование через отверстие нужного размера. Размеры, например толщину волокна, ленты или нити можно контролировать, изменяя размер или тип отверстия, например, с использованием различных диаметров отверстий в диапазоне от 0,1 до 2 мм или от 14 до 30 G, давление экструзии, скорость экструзии и/или концентрацию ГК. При использовании других типов отверстий и щелей можно получить различные формы или структуры. Альтернативно, частицы или шарики можно получить путем измельчения геля активированной ГК, например путем прессования активированной ГК через сито с желаемым размером ячейки. ГК также можно отлить в виде различных форм, например, пленки, сетки, дисков или шариков.

Эта форма может сохраняться в течение всего способа получения и в конечном продукте. Предпочтительно, чтобы форма имела протяженность менее 5 мм, предпочтительно менее 1 мм, и более 0,5 мм или даже боле 0,8 мм, когда субстрат ГК находится в набухшей форме в физиологическом растворе. Предпочтительна форма частиц или шариков, имеющих размер от 0,1 до 5,0 мм, например от 0,5 до 1 мм, в полностью набухшей форме в физиологическом растворе. В случае волокон, лент, нитей, сетки и пленки, можно применять значительно большие размеры, чем 5 мм в одном или двух измерениях, соответственно.

После первоначального сшивания и возможного придания формы осуществляют стадию удаления сшивающего агента. Это включает удаление непрореагировавшего сшивающего агента (агентов) из активированной ГК. Как указано выше, активированная ГК, полученная в результате первоначальной стадии сшивания (а), содержит смесь сшитых молекул ГК и молекул ГК, замещенных сшивающими агентами, имеющими реакционноспособные сшивающие группы. После первоначальной стадии сшивания (а) также имеется значительное присутствие сшивающего агента, который не связан ковалентно с ГК, либо поскольку он совсем не прореагировал, либо поскольку он прореагировал с молекулами воды или с другими компонентами водной среды, например хлорид-ионами. Непрореагировавший сшивающий агент, т.е. сшивающий агент, который не связан ковалентно с ГК, удаляют на этой стадии любыми подходящими средствами, такими как диализ и промывка, включая, например, фильтрацию, декантацию и/или центрифугирование. Само собой разумеется, что ни один сшивающий агент (агенты) не добавляют на этой стадии.

В предпочтительном варианте осуществления активированную ГК, которая связана с непрореагировавшим сшивающим агентом (агентами), осаждают в жидкой осаждающей среде перед тем, как удаляют непрореагировавший сшивающий агент (агенты), либо одновременно с этим удалением.

Активированную ГК осаждают в результате снижения растворимости ГК. Это обычно достигается путем воздействия на активированную ГК жидкой средой, в которой она нерастворима. Специалисту в данной области хорошо известно, что это может быть достигнуто путем добавления активированной ГК к осаждающей среде, путем добавления осаждающей среды к активированной ГК, или с помощью других соответствующих стадий способа. Жидкая осаждающая среда содержит количество одного или более водорастворимых органических растворителей, обеспечивающих условия осаждения для ГК. Полученный твердый осадок ГК выпадает из фазы растворенного вещества и, как правило, его можно отделить от остальной жидкости путем фильтрации, декантации, центрифугирования или вручную, с помощью пинцета или тому подобного. Полученная суспензия содержит жидкую осаждающую среду и активированную ГК в осажденной форме. Непрореагировавший сшивающий агент (агенты) удаляют любыми подходящими средствами, такими как диализ и промывка, включая, например, фильтрацию, декантацию и/или центрифугирование. Предпочтительно непрореагировавший сшивающий агент (агенты) удаляют из суспензии осажденной активированной ГК путем промывки осажденной активированной ГК жидкой осаждающей средой, обычно того же типа, которую используют для осаждения активированной ГК.

Удаление сшивающего агента из активированной ГК в осажденной форме является выгодным, поскольку это быстро приводит к получению очень чистого промежуточного продукта, т.е. без оставшегося непрореагировавшего сшивающего агента. Эта Стадия удаления сшивающего агента также очень полезна в крупномасштабном процессе.

В зависимости от жидкой среды, в которой она присутствует, ГК или гель ГК может быть в растворенной форме или в форме набухшего геля, или в осажденной форме.

В хорошем растворителе ГК, т.е. в растворителе, где взаимодействия между ГК и растворителем являются энергетически выгодными по сравнению с взаимодействиями между молекулами ГК, ГК или гель ГК будет находиться в растворенной форме или в форме набухшего геля. Одним примером хорошего растворителя ГК является вода.

В плохом растворителе ГК или в нерастворителе ГК, т.е. в растворителе, где взаимодействие между самими молекулами ГК энергетически более выгодно по сравнению с взаимодействиями между ГК и растворителем, ГК или гель ГК будет находиться в осажденной форме. Одним примером плохого растворителя ГК является этанол.

Термин "жидкая осаждающая среда", как используется здесь, относится к жидкой среде, в которой активированная ГК будет при погружении в нее осаждаться. Другими словами, жидкая осаждающая среда является нерастворителем для активированной ГК.

Жидкая осаждающая среда обычно содержит более 50 масс. %, например более 65 масс. %, водорастворимого органического растворителя, растворенного в воде, и возможные дополнительные ингредиенты, такие как соли, буферы, основания и кислоты. Водорастворимый органический растворитель должен присутствовать в концентрации, которая является достаточной для достижения осаждения активированной ГК, но не обязательно в избыточном количестве. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения жидкая осаждающая среда включает или содержит более 50 масс. % водорастворимого органического растворителя и до 50 масс. % воды, предпочтительно от 60 до 90 масс. % или от 65 до 85 масс. % водорастворимого органического растворителя и от 10 до 40 масс. % или от 15 до 35 масс. % воды. В определенных вариантах осуществления изобретения жидкая осаждающая среда содержит более 60 масс. %, предпочтительно от 60 до 90 масс. % или от 65 до 85 масс. % водорастворимого органического растворителя, дополнительные ингредиенты, такие как соли, буферы, основания и кислоты, и воду до 100 масс. %.

Органические растворители, используемые в соответствии с изобретением, являются углеродсодержащими растворителями и могут проявлять различную степень полярности. Хотя используется термин "растворители", следует понимать, что эти органические растворители используются для уравновешивания и смещения растворимости ГК при осуществлении способа получения. Гиалуроновая кислота может быть очень хорошо растворима в органическом растворителе при определенном интервале концентраций органического растворителя, но выпадает и образует осадок при увеличении концентрации органического растворителя. Например, ГК может быть растворена в смеси органического растворителя 50/50 (об/об), например смеси низшего алкильного спирта и воды, но выпадает и образует осадок в смеси 90/10 (об/об). При воздействии неосаждающих условий, например, смеси 50/50 или 0/100, ГК возвращается в неосажденное, растворенное состояние. Специалисту в данной области хорошо известно, что другие факторы могут оказывать влияние на предельную концентрацию органического растворителя (растворителей) для осаждения ГК, такие как температура, рН, ионная сила и тип органических растворителей. Предельная концентрация для осаждения ГК в определенных условиях хорошо известна или может быть легко определена специалистом в данной области. Например, предельная концентрация для осаждения ГК (в смеси воды и этанола) составляет приблизительно 65% этанола.

Органические растворители согласно изобретению могут быть выбраны из группы (без ограничения этим), состоящей из пентана, гексана, циклогексана, 1,4-диоксана, N,N-диметилформамида, N,N-диметилацетамида, этилацетата, ацетамида, диэтилового эфира, тетрагидрофурана, ацетонитрила, метилэтилкетона, ацетона, низших алкильных спиртов, например метанола, этанола, пропанола, изопропанола и бутанола. Органические растворители согласно изобретению являются водорастворимыми. Предпочтительной группой органических растворителей является группа низших алкильных спиртов. Термин «низший алкильный спирт» включает первичные, вторичные и третичные алкильные спирты, имеющие от одного до шести атомов углерода, т.е. C_1-6 алкильные спирты. Конкретные примеры низших алкильных спиртов включают метанол, этанол, денатурированный спирт, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол и трет-бутанол. Предпочтительными низшими алкильными спиртами являются метанол и этанол, в частности этанол, за счет цены, доступности и удобства в обращении.

Стадия удаления сшивающего агента может также включать, либо за ней может следовать получение желаемой формы активированной ГК, такой как частица, волокно, лента, нить, сетка, пленка, диск и шарик. Предпочтительно получение желаемой формы активированной ГК осуществляют перед действительным удалением непрореагировавшего сшивающего агента (агентов) из активированной ГК на стадии. Таким образом, получение желаемой формы предпочтительно может иметь место до любого осаждения активированной ГК.

Получение желаемой формы можно выполнять различными способами, например, экструзией, измельчением и литьем. Экструзия субстрата ГК обычно включает его прессование через отверстие нужного размера. Размеры, например толщину волокна, ленты или нити можно контролировать, изменяя размер или тип отверстия, например, с использованием различных диаметров отверстий в диапазоне от 0,1 до 2 мм или от 14 до 30 G, давление экструзии, скорость экструзии и/или концентрацию ГК. При использовании других типов отверстий и щелей можно получить различные формы или структуры. Альтернативно, частицы или шарики желаемых размеров можно получить путем измельчения геля активированной ГК, например путем прессования активированной ГК через сито с желаемым размером ячейки. ГК также можно отлить в виде различных форм, например, пленки, сетки, дисков или шариков.

Эта форма может сохраняться в течение всего способа получения и в конечном продукте. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения форма имеет протяженность менее 5 мм, предпочтительно менее 1 мм, и более 0,5 мм или даже более 0,8 мм, когда субстрат ГК находится в набухшей форме в физиологическом растворе.

Предпочтительной формой являются частицы или шарики, имеющие размер от 0,1 до 5,0 мм, например от 0,2 до 3,0 мм или от 0,5 до 1 мм, когда они полностью набухли в физиологическом растворе. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения форма имеет протяженность более или значительно более 5 мм в по меньшей мере одном измерении, когда субстрат ГК находится в набухшей форме в физиологическом растворе. Предпочтительной формой является форма волокна, ленты или нити, имеющих длину в несколько сантиметров, например от 1 до 100 сантиметров. Предпочтительно, чтобы соотношение между его длиной и шириной или средним диаметром составляло 5:1 или выше, например 100:1 или выше, и, возможно, 10000:1 или ниже, например 2500:1 или ниже.

После удаления сшивающего агента и возможного придания формы осуществляют конечную или завершающую стадию сшивания. На этой стадии способа сшивание субстрата активированной ГК будет завершено. Оставшиеся реакционноспособные группы сшивающих агентов, которые были ковалентно присоединены к ГК на первоначальной стадии сшивания (а), вступают в реакцию с дополнительными доступными группами на активированной ГК с получением дополнительных поперечных связей, т.е. ковалентных связей между (по меньшей мере) двумя отдельными молекулами ГК или двумя отдаленными частями одной и той же молекулы ГК. Предпочтительно, чтобы желаемую форму активированной ГК, полученной на первоначальной стадии сшивания (а), получали перед этой завершающей стадией сшивания.

Хотя эта стадия завершает сшивание ГК, следует отметить, что на этой стадии не присутствует свободный или несвязанный сшивающий агент. Любой оставшийся несвязанным сшивающий агент (агенты) с первоначальной стадии сшивания (а) удаляют на стадии удаления сшивающего агента. Отсюда следует, что сшивающий агент не добавляют на этой стадии или на любой стадии после первоначальной стадии сшивания (а) и стадии удаления сшивающего агента. Хотя конечный продукт из поперечно-сшитой ГК можно обработать с получением различных форм, предпочтительно обрабатывать активированную ГК в желаемую форму перед конечной стадией сшивания.

Сшивание активированной ГК с получением продукта из поперечно-сшитой ГК завершают, подвергая активированную ГК воздействию дополнительных условий сшивания. Завершающую стадию сшивания проводят в суспензии жидкой осаждающей среды и активированной ГК в осажденной форме. Считают, что это улучшает эффективное отношение сшивающего агента (CrR), т.е. долю сшивающего агента от всего связанного сшивающего агента (агентов) (ГК-Х-ГК и ГК-Х), который связывает два (или более) дисахаридов (только ГК-Х-ГК). Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, считают, что это может быть обусловлено, во-первых, тем, что цепи ГК приближены друг к другу, и, во-вторых, локальным отсутствием конкурирующих молекул воды внутри сети осажденной ГК. Выполнение завершающей стадии сшивания в суспензии активированной ГК в осажденной форме также ограничивает побочные реакции, например с окружающей осаждающей средой и галогенидными ионами. Никакого дополнительного сшивающего агента не добавляют в этой стадии.

Завершение сшивания означает, что сшивание будет происходить при обеспечении сшивающих условий в суспензии активированной ГК в осажденной форме. Условия сшивания означают условия, при которых сшивающие агенты, имеющие реакционноспособные группы, будут реагировать с доступными группами на активированной ГК с образованием дополнительных поперечных связей.

Термин «конечный» или «завершающий» используют для того, чтобы отличить вторую стадию сшивания от первой, инициирующей стадии сшивания. Завершающее сшивание повышает долю связанного сшивающего агента (агентов) (ГК-Х-ГК и ГК-Х), который сшивает два (или более) дисахаридов (только ГК-Х-ГК).

Как указано выше, активированную ГК можно осаждать в жидкой осаждающей среде перед удалением непрореагировавшего сшивающего агента (агентов), либо одновременно с этим. В альтернативном варианте осаждение активированной ГК в жидкой осаждающей среде выполняют после удаления непрореагировавшего сшивающего агента, например перед тем, как активированную ГК подвергают воздействию дополнительных сшивающих условий на завершающей стадии сшивания. Таким образом, завершающая стадия сшивания может включать осаждение активированной ГК в жидкой осаждающей среде с получением суспензии, содержащей жидкую осаждающую среду и активированную ГК в осажденной форме; и завершение сшивания активированной ГК путем воздействия на суспензию осажденной активированной ГК дополнительными сшивающими условиями. Опять же, никакого дополнительного сшивающего агента не добавляют на этой стадии.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения суспензия на завершающей стадии сшивания имеет рН 9 или выше, например 10 или выше, 11 или выше, или даже 12 и выше.

Завершающую стадию сшивания обычно проводят при температуре от 10 до 75°C, но предпочтительно при комнатной температуре, например от 20 до 25°C. Предпочтительные диапазоны температур составляют от 10 до 50°C, например от 18 до 40°C.

Способ в соответствии с изобретением также может включать одну или более дополнительных стадий. Стадия предпочтительного способа включает воздействие на осажденный продукт из поперечно-сшитой ГК с завершающей стадии сшивания неосаждающих условий. Это, как правило, включает в себя воздействие на продукт из поперечно-сшитой ГК жидкой средой, позволяя ему вернуться в неосажденное состояние. Жидкая среда, как правило, является водой, физиологическим раствором или их смесью, и/или их комбинацией, возможно, с неосаждающей концентрацией органического растворителя, например, метанола или этанола.

Из-за поперечной сшивки, полученный продукт из ГК имеет непрерывную сеть соединенных между собой и перепутанных цепей ГК, которая в неосаждающих условиях поглощает жидкость (набухает) и образует гель. Набухание может продолжаться до тех пор, пока гель полностью не набухнет и дополнительная жидкость не может быть поглощена, или набухание можно прервать на более ранней стадии, чтобы получить частично набухший гель. Частично набухший гель может быть полезен в качестве промежуточного продукта для дополнительной обработки геля, например, дополнительного механического получения гелевых структур желаемого размера и формы. Например, пленка может быть разрезана на частицы, пластинки или кусочки, геле вые волокна могут быть разрезаны на более короткие фрагменты, из пленки можно изготовить четко определенные неправильные формы и т.д. Сшитые волокна, ленты или нити ГК также могут быть сплетены вместе, чтобы сформировать сеть или пленку после завершения сшивания до или после сушки. Также можно удобно использовать частично набухший формованный гелевый продукт при его имплантации в желаемом месте, чтобы облегчить введение и свести к минимуму дискомфорт пациента, и повысить способность к лифтингу путем использования оставшейся набухаемости.

Когда формованный гелевый продукт подвергают воздействию неосаждающих условий в избытке жидкости, можно также определить его максимальную степень набухания (SwD от англ. swelling degree), или наоборот, минимальную концентрацию ГК в нем (C_min), т.е. концентрацию ГК, когда гелевый продукт является полностью набухшим. Использование способа получения согласно изобретению позволяет получить степень набухания от 4 до 500 мл на грамм ГК, предпочтительно от 15 до 300 мл на грамм ГК. Это подразумевает значения C_min в диапазоне от 0,2 до 25% (масс./масс), т.е. от 2 до 250 мг/г, такие как от 0,3 до 7% (масс/масс), т.е. от 3 до 70 мг/г. Предпочтительные значения C_min составляют от 0,3 до 5% (масс./об.), т.е. от 3 до 50 мг/мл. Очень выгодно, что желаемую степень набухания (или значение C_min) можно достичь с минимальной степенью модификации, хотя традиционный способ регулирования степени набухания осуществляют посредством изменения степени модификации. Настоящий способ получения, следовательно, обеспечивает новую концепцию регулирования набухаемости формованного гелевого продукта, который удивительным образом позволяет изготавливать твердые формованные гели с высоким значением C_min (низкой степенью набухания) при относительно низкой степени модификации геля.

Эффективность модификации (МоЕ от англ. modification efficiency) является мерой соотношения между минимальной концентрацией ГК (C_min) или жесткостью/прочностью геля и степенью его химической модификации с помощью сшивающего агента (агентов). Использование способа получения в соответствии с настоящим изобретением позволяет получить продукт из поперечно-сшитой ГК, имеющий эффективность модификации 2 или выше, предпочтительно в диапазоне от 3 до 500, например от 5 до 200 или от 7 до 100. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, полагают, что полезные свойства геля являются результатом неожиданно высокой степени эффективного поперечного сшивания, т.е. высокой степени связанного сшивающего агента (агентов) (эффективное отношение сшивающего агента обычно составляет 35% или выше, например 40% или выше, или даже 50% или выше), фактически связанного с ГК в двух (или более) точках, в сочетании с эффективным положением поперечных связей, для достижения желаемой цели, и, возможно, чрезвычайно высокой степени остаточной запутанности. В противоположность тому, что специалист в данной области мог бы ожидать от низкой степени модификации полученного продукта ГК, способ согласно изобретению удивительно обеспечивает гель с высокой жесткостью/прочностью. При любых обстоятельствах способ согласно изобретению обеспечивает удобный способ дополнительного регулирования степени набухания относительно степени модификации.

При необходимости, способ получения также включает стадию выделения продукта из поперечно-сшитой ГК. В зависимости от того, выдерживают ли продукт в осаждающих условиях или подвергают воздействию неосаждающих условий, эта стадия может включать выделение продукта в осажденной форме или в неосажденной форме. Выделенный осажденный или неосажденный продукт может быть затем подвергнут стерилизации, например посредством автоклавирования, излучения, нагревания с получением стерильного продукта из поперечно-сшитой ГК.

При желании, после получения продукта из поперечно-сшитой ГК можно добавить другие вещества, такие как местные анестетики (например гидрохлорид лидокаина), противовоспалительные лекарства, антибиотики и другие подходящие вспомогательные лекарственные средства, например, факторы роста костей или клетки.

Теперь, ссылаясь на фигуры, некоторые предпочтительные способы изготовления продукта из поперечно-сшитой ГК схематически показаны на фиг. 1-2. Каждая комбинация (1A-1F) стадий способа, показанная на фиг. 1, обеспечивает получение продукта из поперечно-сшитой ГК, но также любая из стадий может быть объединена с любой комбинацией дополнительных последующих стадий способа, как показано пунктирными стрелками, и примеры которых приведены на фиг. 2 (2A-2D).

Наиболее общий способ проиллюстрирован на фиг. 1А, в котором сшивание ГК инициируют путем взаимодействия ГК с полифункциональным сшивающим агентом в водном растворе для получения активированной ГК. Любой непрореагировавший сшивающий агент удаляют из активированной ГК. Сшивание активированной ГК завершают путем воздействия на активированную ГК в осажденной форме дополнительными сшивающими условиями в суспензии жидкой осаждающей среды без добавления каких-либо дополнительных сшивающих агентов. Эти стадии обеспечивают получение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению, имеющего степень модификации от низкой до умеренной и, в то же время, высокую прочность геля, характеризуемой способностью удерживать жидкость от низкой до умеренной, или степенью набухания.

Как показано на фиг. 1B-1С и 1E-1F, осаждение активированной ГК можно осуществлять в любое время между первоначальным сшиванием в растворе и завершающим сшиванием. Осаждение активированной ГК, таким образом, можно осуществлять до удаления несвязанного сшивающего агента (фиг. 1B, 1E-1F) или после удаления несвязанного сшивающего агента (фиг. 1С).

Способ согласно изобретению может также включать придание активированной ГК формы, как показано на фиг. 1D-1F. Придание формы можно осуществлять в любое время между первоначальным сшиванием в растворе и завершающим сшиванием. Придание формы, таким образом, можно осуществлять до удаления несвязанного сшивающего агента (фиг. 1D, 1F) или после удаления несвязанного сшивающего агента (фиг. 1F). Также придание формы можно осуществлять до осаждения активированной ГК (фиг. 1Е) или после осаждения активированной ГК (фиг. 1F).

Продукт из поперечно-сшитой ГК также можно подвергать дополнительным последующим стадиям способа, например повторному набуханию в неосаждающих условиях и/или выделению, и/или стерилизации продукта. Например, на продукт из поперечно-сшитой ГК можно воздействовать неосаждающими условиями и выделять его из обрабатывающей среды, как показано на фиг. 2А.

Продукт из поперечно-сшитой ГК также может быть подвергнут стерилизации, например автоклавированию, как показано на фиг. 2B-2D. Для многих применений предпочтительно, чтобы готовое к употреблению устройство, такое как инжектор, было загружено продуктом из поперечно-сшитой ГК, как показано на фиг. 2C-2D. Продукт из ГК можно стерилизовать, например, в автоклаве перед загрузкой в устройство (фиг. 2D) или после загрузки в устройство (фиг. 2С).

Согласно одному аспекту изобретение обеспечивает получение продукта из поперечно-сшитой ГК. Согласно одному варианту осуществления этот продукт изготавливают или он может быть изготовлен с помощью способа получения согласно изобретению. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению является гелем или гидрогелем. То есть, его можно рассматривать как нерастворимую в воде, но по существу разбавленную поперечно-сшитую систему молекул ГК при воздействии на него жидкости, обычно водной жидкости. Гель по существу является жидким в массе и может, например, содержать от 90 до 99,9% воды, но он ведет себя как твердое тело за счет трехмерной сшитой сети ГК в жидкости. Из-за значительного содержания жидкости формованный гель является структурно гибким и близким природной ткани, что делает его очень полезным в качестве каркаса в тканевой инженерии и для наращивания тканей. Поперечные связи и их положения прикрепления на молекулах ГК вместе с естественной перепутанностью цепей ГК придают гелю структуру и свойства, которые тесно связаны с его степенью набухания.

Количество связанного сшивающего агента (агентов) может быть количественно определено и представлено в виде степени модификации (MoD), т.е. молярного количества связанного сшивающего агента (агентов) по отношению к общему количеству повторяющихся дисахаридных звеньев ГК. Предпочтительно, чтобы продукт из поперечно-сшитой ГК в соответствии с изобретением имел степень модификации от 1 до 90 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев (0,1-9%), предпочтительно от 1 до 40 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев (0,1-4%). Эффективность реакции сшивания характеризуется количеством присоединенного сшивающего агента (агентов), который присоединен (по меньшей мере) к двум концам одной (или более) цепи ГК, и представлена в виде отношения сшивающего агента (CrR). Сейчас было неожиданно реализовано и экспериментально показано, что CrR может быть преимущественно многократно увеличено путем разделения реакций сшивания на две отдельные стадии, и, в частности, путем включения стадии осаждения ГК перед конечной стадией сшивания. В частности, CrR увеличивается по меньшей мере в 1,5 раза и предпочтительно в 2-10 раз, например в 2-6 раз с помощью конечной стадии сшивания. Предпочтительно, чтобы продукт согласно изобретению имел эффективное отношение сшивающего агента 35% или выше, более предпочтительно 40% или выше, например, в диапазоне от 40 до 80% или даже от 50 до 80%. Эти продукты, следовательно, содержат низкое количество сшивающих агентов, которые не обеспечивают эффективных поперечных связей в продукте. Высокие эффективные отношения сшивающего агента позволяют использовать удивительно низкую общую степень модификации по отношению к прочности геля, которая, в свою очередь, является преимуществом для обеспечения высокой биосовместимости.

Другой характеристикой геля является его способность поглощать воду до тех пор, пока он полностью не набухнет. Дальнейшее добавление жидкости не будет дополнительно разбавлять гель, т.е. гель не может быть разбавлен в неопределенной степени как раствор свободных молекул. Когда гель подвергают воздействию неосаждающих условий, можно также определить его степень набухания, или, наоборот, его минимальную концентрацию (C_min), т.е. концентрацию ГК, когда гелевый продукт является полностью набухшим. Более твердые (низкого набухания) гели, как правило, менее вязкие, более упругие и, как ожидается, имеют более длительный период полураспада in vivo, чем более мягкие (высокого набухания) гели. Однако тело может распознавать твердые гели как инородные материалы, если они высоко химически модифицированы. Предпочтительно, чтобы продукт согласно изобретению имел степень набухания от 4 до 500 мл на грамм ГК, а предпочтительно от 15 до 300 мл на грамм ГК. Это означает, что значения C_min находятся в диапазоне от 0,2 до 25% (масс./масс.), т.е. от 2 до 250 мг/г, например от 3 до 7% (масс./масс.), т.е. от 3 до 70 мг/г. Предпочтительно значение C_min составляет от 0,3 до 5% (масс./об.), т.е. от 3 до 50 мг/мл.

Продукт из поперечно-сшитой ГК в соответствии с изобретением является сшитым одним или более сшивающих агентов, которые являются полифункциональными, т.е. имеют два или более реакционных центров для образования ковалентных связей с молекулами ГК, которые подвергают сшиванию. Предпочтительно, чтобы сшивающий агент или агенты являлись бифункциональными, т.е. имели два реакционных центра для образования ковалентных связей с молекулами ГК, которые подвергают сшиванию. Не ограничиваясь этим, полезные полифункциональные сшивающие агенты включают дивинилсульфон, полиэпоксиды и диэпоксиды, такие как 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидиловый эфир (EDDE) и диэпоксиоктан, предпочтительно BDDE. Желательно, чтобы гелевый продукт из ГК был сшит простыми эфирными связями, которые являются стабильными.

Формованный гелевый продукт из ГК может представлять собой многократно сшитый продукт, т.е. продукт, содержащий по меньшей мере два различных типа связей, предпочтительно содержащий простые эфирные связи. Предпочтительно продукт из ГК является поперечно сшитым однократно, т.е. содержащим поперечные связи одного типа, предпочтительно простые эфирные связи. Однократно сшитый продукт имеет то преимущество, что он является химически хорошо определенным. Предпочтительно, что продукт с одним типом поперечных связей проявляет такие желаемые свойства. В конкретных вариантах осуществления продукт из ГК является поперечно-сшитым простыми эфирными связями, что обеспечивает стабильный и автоклавируемый продукт.

Очень выгодно получать желаемую степень набухания (или значение C_min) продукта при минимальной степени модификации, хотя традиционный способ регулирования степени набухания осуществляют посредством изменения степени модификации. Основной причиной минимизации степени модификации является обеспечение высокой биосовместимости геля, но специалист в данной области хорошо знает и о других преимуществах. Формованный продукт характеризуется высоким значением C_min (низкой степенью набухания) по отношению к степени модификации геля. Эффективность модификации (МоЕ) является мерой соотношения между минимальной концентрацией ГК (C_min), которая отражает жесткость и прочность геля, и степенью химической модификации геля с помощью сшивающего агента (агентов). Продукт из поперечно-сшитой ГК в соответствии с изобретением имеет эффективность модификации 2 или выше, предпочтительно в диапазоне от 3 до 500, например в диапазоне от 5 до 200 или от 7 до 100. Продукты с эффективностью модификации 10 или выше, например в диапазоне от 20 до 190, сочетают, в первую очередь, степень модификации от низкой до умеренной и, в то же время, степень набухания или способность удерживать жидкость от низкой до умеренной. Таким образом, можно получить твердый продукт из поперечно-сшитой ГК, который является биосовместимым и имеет высокую стойкость к деформации.

Кроме того, гелевые продукты из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению предпочтительно являются вязкоупругими. Это означает, что гелевые продукты обладают комбинацией вязких и упругих свойств. Как хорошо известно специалисту в данной области, вязкоупругие свойства могут быть определены с помощью реометра. В осциллирующем режиме модуль упругости (С’) и модуль вязкости (G”) можно определять на частоте 0,1 или 1 Гц. Для некоторых вязкоупругих гелевых продуктов в соответствии с изобретением предпочтительно, чтобы выполнялось следующее соотношение:

, предпочтительно .

Продукт согласно изобретению изготавливают в заранее заданных физических формах или структурах, таких как частица, волокно, лента, нить, сетка, пленка, диск и шарик. Предпочтительно форма имеет протяженность менее 5 мм, предпочтительно менее 1 мм, и более 0,5 мм, даже более 0,8 мм, когда субстрат ГК находится в полностью набухшем состоянии в физиологическом растворе. Предпочтительной формой является форма частиц и шариков, имеющих размер от 0,1 до 5,0 мм, например от 0,5 до 1 мм, в полностью набухшем состоянии в физиологическом растворе.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, гелевый продукт из поперечно-сшитой ГК может быть полезным в качестве устройства для доставки лекарственных средств и может быть использован в способе доставки лекарства.

Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению полезен для гидратации и/или оздоровления кожи. С этой целью продукт можно, например, вводить в кожу или включать в крем, который наносят на кожу.

Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению полезен в косметической или медицинской хирургической операции. Неограничивающими примерами косметической хирургической операции являются дермальное наполнение, контурная пластика тела и контурная пластика лица, в частности, контурная пластика лица. Неограничивающими примерами медицинской хирургической операции являются дермальное наполнение, контурная пластика тела, предотвращение адгезии тканей, ортопедические применения, лечение недержания, лечение пузырно-мочеточникового рефлюкса (ПМР) и формирование каналов для целей дренажа, например, в офтальмологии, и для удерживания тканей разделенными.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение предлагает способ лечения субъекта, подвергающегося косметической или медицинской хирургической операции, включающий введение продукта из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Неограничивающими примерами медицинской хирургической операции являются дермальное наполнение, контурная пластика тела, предотвращение адгезии тканей, ортопедические применения, например терапия тазобедренных суставов, формирование каналов для целей дренажа, например, в офтальмологии, и для удерживания тканей разделенными.

Нужную форму и размер обеспечивают во время изготовления продукта, т.е. путем придания желаемой формы субстрату перед завершающим сшиванием. В другом подходящем способе получения структуры желаемого размера получают гелевый продукт из поперечно-сшитой ГК с желаемой концентрацией и подвергают этот гель механическому разрушению, такому как измельчение, расплющивание или пропускание набухшего или частично набухшего геля или осажденного поперечно-сшитого продукта через фильтр или сито с подходящим размером пор. Полученные гелевые частицы или кусочки диспергируют в физиологическом солевом растворе с получением дисперсии геля или суспензии с частицами желаемого размера и формы. В зависимости от формы, размер гелевой структуры можно определить любым подходящим способом, например путем лазерной дифракции, микроскопии, фильтрации, и т.д., который будет определяться наибольшим расстоянием между двумя концами частицы. Для сферических структур диаметр равен размеру для этой цели.

Полезные диапазоны размеров и форм гелевых структур зависят от назначения. Для увеличения объема мягких тканей, предпочтительно для подкожного введения, введения под мышцу или супрапериостального введения, полезными являются гелевые частицы, кусочки или волокна, имеющие размер более 0,1 мм при воздействии физиологического солевого раствора. Термин "увеличение объема мягких тканей", как он использован здесь, относится к любому типу объемного увеличения мягких тканей, в том числе, но не ограничиваясь этим, к контурной пластике лица (например, более выраженных щек или подбородка), к коррекции вогнутых деформаций (например, посттравматической, ВИЧ-ассоциированной липоатрофии) и к коррекции глубоких, связанных с возрастом морщин на лице. Таким образом, увеличение объема мягких тканей можно использовать исключительно в косметических или медицинских целях, таких как посттравматические или дегенеративные заболевания. Эти две цели легко отличить специалисту в данной области. Термин "мягкая ткань", как используется здесь, относится к тканям, которые соединяют, поддерживают или окружают другие структуры и органы тела. Мягкие ткани включают в себя мышцы, фиброзные ткани и жир. Увеличение объема мягких тканей можно выполнять у любого млекопитающего, включая человека. Предпочтительно этот способ выполняют у человека.

Термины "субэпидермальное введение" или "субкутикулярное введение", как они использованы здесь, относятся к введению под эпидермис кожи, включая введение в дерму, под кожу или глубже, например, под мышцу или в надкостницу, где это применимо (в непосредственной близости от костной ткани).

Введение гелевых структур может быть выполнено любым подходящим способом, таким как инъекция из стандартной канюли и иглы соответствующих размеров, или хирургическое введение, например в случае введения пленки. Введение осуществляют в тех местах, где желательно увеличение объема мягких тканей, таких как подбородок, щеки, или в другом месте лица или тела. Предпочтительно использовать гель и гелевые структуры в контурной пластике лица.

Имплантат в соответствии с изобретением может представлять собой водную композицию, содержащую продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению, например, в форме гелевых структур из ГК размером более или равным 0,1 мм, таких как частицы, шарики, волокна или отрезанные ленты, и, при необходимости, буферный агент и/или агент, регулирующий тоничность. Композиция может обычно содержать физиологический солевой раствор с буфером. Композиция может дополнительно содержать другие подходящие активные вещества и медицинские соединения, такие как местные анестетики (например гидрохлорид лидокаина), противовоспалительные лекарственные средства, антибиотики и другие подходящие поддерживающие лекарственные средства, например факторы роста костей или клетки. Продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению или его водная композиция могут быть представлены в предварительно заполненном шприце, т.е. в шприце, который предварительно заполнен стерилизованным продуктом из поперечно-сшитой ГК или стерилизованной водной композицией, содержащей этот формованный продукт. При необходимости, продукт из поперечно-сшитой ГК может содержаться в шприце, пакете или другом подходящем контейнере в осажденной форме и может быть переведен в неосажденную форму перед инъекцией или в теле после его инъекции.

Предпочтительно, чтобы набухший или частично набухший продукт из поперечно-сшитой ГК являлся автоклавируемым, так как это наиболее удобный способ стерилизации конечного продукта. Это позволяет приготовить стерильный продукт из поперечно-сшитой ГК.

Само собой разумеется, что размер гелевых структур, например волокон, согласно изобретению, зависит от того, как долго гель был оставлен набухать, от ионной силы буфера, раствора или носителя, которые включены в гелевые структуры и/или окружают гелевые структуры. В данном описании конкретные размеры структуры предполагают физиологические условия, в частности изотонические условия. Следует отметить, что, хотя предпочтительно, что гелевые структуры содержат физиологический солевой раствор и диспергированы в нем, предполагается, что гелевые структуры в соответствии с изобретением временно могут быть доведены до различных размеров при воздействии на них раствором другой тоничности, другого рН, или если структурам геля не дают набухнуть до их максимального размера.

Как используется здесь, понятие «физиологический или изотонический раствор» означает раствор, имеющий осмолярность в интервале от 200 до 400 мОсм/л, предпочтительно от 250 до 350 мОсм/л, более предпочтительно примерно 300 мОсм/л.

Гелевый продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению является в физиологических условиях стабильным, но не постоянно. В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 90% гелевого продукта из поперечно-сшитой ГК сохраняется в течение не менее двух недель in vivo, более предпочтительно от двух недель до двух лет. Термин "разрушается" означает, что менее 20%, предпочтительно менее 10%, среды сохраняется в организме.

Гелевый продукт из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению является более устойчивым к биоразложению in vivo, чем природная ГК, а также, чем имеющиеся в продаже гелевые продукты из поперечно-сшитой ГК, см. примеры сравнения 8 и 9. Длительное присутствие стабильного гелевого продукта является предпочтительным для пациента, поскольку время между обработками увеличивается. Важно также, что продукт является очень похожим на природную ГК для сохранения высокой биосовместимости природной ГК.

Определения

На протяжении данного описания приведенные ниже термины имеют следующие значения.

Не желая быть ограниченным этим, настоящее изобретение будет далее проиллюстрировано на примерах.

Примеры

Методы анализа

Определение концентрации ГК

Метод определения содержания ГК принят из аналитического теста для гиалуроната натрия, описанного в Ph. Eur. 1472. Принцип этого метода заключается в том, что реакция конденсации производных фурфурола, образованных при нагревании в серной кислоте, происходит с реагентом карбазолом с образованием пурпурно-красного продукта. Эта реакция является специфичной для D-глюкуроновой кислоты, которая является частью ГК. Поглощение измеряют при 530 нм и в качестве стандарта используют глюкуроновую кислоту.

Образовавшийся продукт из D-глюкуроновой кислоты (GIcA), содержащейся в образце, определяют с помощью реакции с карбазолом. Чтобы получить однородные растворы образцов, стабилизированный гель ГК разрушают серной кислотой при 70°C и разбавляют 0,9% раствором NaCl. Растворы смешивают с серной кислотой при температуре 95°C, а затем с реагентом карбазолом. Реакции приводят к образованию растворов розового цвета. Интенсивность окраски измеряют с помощью колориметра при 530 нм, причем оптическая плотность каждого образца прямо пропорциональна содержанию GIcA. Содержание ГК рассчитывают из содержания GIcA в каждом образце.

Определение содержания геля (GeIC)

GeIC описывает в % долю общей ГК, которая связана в виде геля. Содержание геля определяют как количество ГК в образце, который не проходит через 0,22 мкм фильтр. GeIC рассчитывают из количества ГК, которое собирается в фильтрате, здесь обозначенное как экстрагируемая ГК. Содержание геля и содержание экстрагируемой ГК даны в процентах от общего количества ГК в образце геля. Короче говоря, содержание геля определяют путем смешивания определенного количества образца геля с 0,9% раствором NaCl в пробирке. Гелю дают набухнуть, затем NaCl-фазу отделяют от гелевой фазы путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Концентрацию ГК в фильтрате определяют в соответствии с методикой, описанной в определении концентрации ГК.

Определение степени набухания (SwD)

SwD описывает способность гидрогелевого продукта из ГК поглощать жидкость, то есть способность поглощать 0,9% раствор NaCl, и представлено как вес (в граммах) полученного полностью набухшего геля на грамм ГК. Продукт, как правило, является частично набухшим, поперечно-сшитым гелем ГК, но также может присутствовать в сухом состоянии. SwD может быть определена из фактора набухания (SwF). SwF измеряется как объем (V) полностью набухшего геля, который образуется при набухании определенной массы (w) частично набухшего продукта в физиологическом растворе в мерном цилиндре, и рассчитывается как:

Затем SwD рассчитывают как:

где [ГК] - концентрация ГК (в г/мл геля) частично набухшего геля, и GeIC - содержание геля (в %). GeIC включено в формулу для поправки на содержание экстрагируемой ГК, которая не вносит вклад в набухание геля. Считают, что плотность полностью набухшего геля составляет 1,0 г/мл.

Примечательно, что более прочный гель будет иметь более низкую SwD, а более слабый гель будет иметь более высокую SwD.

Определение минимальной концентрации (C_min)

C_min (или c_min) описывает концентрацию гелевой формы ГК в гелевом продукте из поперечно-сшитой ГК, полностью набухшем в 0,9% растворе NaCl после полного удаления экстрагируемой ГК. Поскольку продукт не может поглотить больше жидкости, эта концентрация является минимальной концентрацией ГК, которая может быть получена для данного гелевого продукта. Следует отметить, что более прочный гель будет иметь более высокую C_min, в то время как слабый гель будет иметь более низкую C_min.

C_min (в мг/мл или мг/г) определяют по аналогии с определением SwD, как изложено выше, используя соотношение:

Определение степени модификации (MoD)

MoD описывает молярное количество связанного сшивающего агента (агентов) по отношению к общему количеству повторяющихся дисахаридных звеньев ГК (Kenne и др., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418). Эта величина не делает различий между моно-связанным и фактически поперечно-сшитым сшивающим агентом (агентами), т.е. включен весь сшивающий агент (агенты), который связан с ГК с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи. Например, MoD 1% для геля ГК, сшитого с помощью BDDE, означает, что имеется 1 связанная (моно-связанная или поперечно-сшитая) молекула BDDE на 100 дисахаридных звеньев в геле ГК.

MoD определяют с помощью ЯМР-спектроскопии (ядерная магнитно-резонансная спектроскопия) на ферментативно разрушенном гелевом продукте. Растворимую ГК, остаточный (несвязанный) сшивающий агент (агенты) и их производные отмывают перед разрушением геля путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Гелевый продукт разрушают при 37°C с помощью ферментативной обработки с использованием хондроитиназы. Разрушенный гелевый продукт подвергают ЯМР-спектроскопии, записывая одномерные спектры ¹Н-ЯМР на спектрометре 500 МГц, оснащенном стандартным 5 мм датчиком.

Спектры ЯМР оценивают путем интегрирования сигнала на δ_Н 1,6 ppm (млн^-1), который происходит от четырех протонов в молекуле, сшитой BDDE, и сигнала на δ_H 2,0 ppm, который происходит от трех протонов в группах СН₃ на остатках N-ацетилглюкозамина дисахаридов ГК. Соотношение между интегралами для этих двух сигналов пропорционально соотношению между молярным количеством связанного BDDE и дисахаридов после поправки на число протонов, ответственных за каждый сигнал, следовательно, оно дает значение MoD.

Определение эффективности модификации (МоЕ)

МоЕ представляет собой соотношение между минимальной концентрацией ГК и степенью модификации геля, т.е.:

C_min (мг/г или мг/мл) и MoD (%) определяют, как описано ранее. Так как C_min тесно связана с прочностью геля, МоЕ является мерой того, насколько эффективной является процедура сшивания при получении геля желаемой прочности. Процесс с высоким МоЕ будет производить гель с высокой C_min и низкой MoD, т.е. получают прочный гель, несмотря на ограниченную химическую модификацию ГК.

Определение эффективного отношения сшивающего агента (CrR)

CrR характеризует долю сшивающего агента от всего связанного сшивающего агента (агентов) (ГК-Х-ГК и ГК-Х), который связан с двумя (или более) дисахаридами (только ГК-Х-ГК):

где X представляет собой сшивающий агент.

Этот метод основан на определении фрагментов ГК-Х с использованием ЖХ-МС после разрушения геля ГК с помощью хондроитиназы АС от Arthrobacter aurescens или хондроитиназы ABC от Proteus vulgaris на фрагменты, состоящие из основного дисахарида (Δди-ГК), и фрагменты со связанным сшивающим агентом (ГК-X), содержащие 1-8 дисахаридов. Фрагменты разделяют с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), и детектируют с использованием масс-спектрометрии (МС). Площади пиков для каждой группы фрагментов суммируют и CrR рассчитывают следующим образом:

Предполагают, что все типы фрагментов ГК-Х имеют одинаковые отклики в МС-детекторе, т.е. определенная площадь пика соответствует определенному молярному количеству для всех типов фрагментов ГК-Х (Kenne и др., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418).

При определении CrR следует позаботиться, чтобы включать только BDDE, присоединенный простыми эфирными связями. В зависимости от условий во время сшивания, BDDE может связываться с ГК как простыми эфирными, так и сложноэфирными связями. Поскольку сложноэфирные связи легко гидролизуются, только BDDE, связанный простыми эфирными связями, будет вносить вклад в прочность геля и в продолжительность времени действия. Фрагменты с BDDE со сложноэфирными связями имеют такую же массу, как и с BDDE с простыми эфирными связями, однако их можно детектировать, поскольку они имеют немного разные времена удерживания при хроматографии. Для определения CrR без BDDE со сложноэфирными связями образцы должны быть гидролизованы перед анализом. Гидролиз образцов можно осуществить, например, путем добавления основания и/или путем нагревания до или после ферментативного расщепления.

Хотя способ для определения CrR описан с использованием ГК, сшитой с помощью BDDE, в качестве иллюстративного примера, он никоим образом не ограничен этим конкретным сочетанием сшивающего агента и полисахарида. Этот способ можно легко приспособить для любого другого полифункционального сшивающего агента, используя принципы, описанные в работе Kenne и др., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418, и корректируя/адаптируя массы фрагментов ГК-Х и ГК-Х-ГК в способе ЖХ-МС для конкретного используемого сшивающего агента.

Реометрия

Для определения вязкоупругих свойств набухшего гелевого продукта используют реометрию в осциллирующем режиме. Модуль упругости (G’) описывает прочность геля в смысле физического сопротивления геля упругой деформации. Модуль вязкости (G”) описывает прочность геля в смысле физического сопротивления геля вязкой деформации. Измерение выполняют с использованием осциллирующего реометра.

Реометрические измерения выполняют следующим образом. Частотные развертки выполняют со временем покоя по меньшей мере 15 минут между загрузкой образца и измерением, и с деформацией (γ) 0,1%. Используют датчик с параллельными пластинами с диаметром 25 мм и зазором 1 или 2 мм. Средние значения модуля упругости (G’) и модуля вязкости (G”) определяют при 0,1 и 1 Гц из частотных разверток. Амплитудные развертки выполняют при частоте 1 Гц, чтобы убедиться, что частотная развертка выполнена при деформации (γ) в пределах линейного вязкоупругого диапазона.

Примеры

Пример 1

1 г ГК растворяли в 7 г 0,25 М NaOH. После того, как ГК растворилась, добавляли 50 мг BDDE, смешанного с 0,2 г 0,25 М NaOH. Первоначальную реакцию сшивания проводили в течение 2 ч при 50°C. Активированную ГК пропускали через металлическую сетку и оставляли набухать в 30 г воды в течение короткого периода времени. Набухший гель осаждали в этаноле и промывали 3 раза смесью вода/этанол/NaOH. Завершали сшивание в растворе этанола и NaOH в течение 2 ч при 50°C. Концентрация этанола составляла около 70 масс. % и концентрация NaOH - 50 мМ. Нейтрализацию осуществляли с помощью HCl до кажущегося рН 7. Осадок промывали и сушили.

Полученный сухой порошок оставляли набухать с получением геля в 0,9% NaCl с буфером до концентрации ГК 20 мг/мл. Гель помещали в шприцы и автоклавировали.

Получали контрольный гель с использованием вышеописанного способа без осаждения и завершающего сшивания в смеси этанола.

Анализировали MoD и CrR. Оба геля имели MoD 3,4%. CrR для контроля составил 0,1, и это было в 3 раза выше для геля, который был подвергнут завершающему сшиванию в осажденной форме.

Пример 2 - Сравнительные эксперименты

Продукты из поперечно-сшитой ГК получали четырьмя различными способами A-D:

(A): Пленку из поперечно-сшитой ГК получали в соответствии с Примером 24 из WO 87/07898. Гиалуронат натрия (3% масс/об.) смешивали с 0,75% (об/об) NaOH. Добавляли 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE) в концентрации 0,22% (масс/об.) и оставляли взаимодействовать в течение 24 ч. Смесь подвергали диализу против проточной дистиллированной воды в течение 24 ч. К диализованной смеси добавляли аммиак (25% об/об) и полученную смесь выливали в чашку Петри из полистирола. Выдерживали для сушки в течение 2-х дней при комнатной температуре. Была получена прозрачная плоская водонерастворимая пленка. Затем пленку делили на частицы, оставляли набухать в физиологическом растворе, помещали в шприц и автоклавировали.

Готовили варианты (B)-(D), чтобы показать различия между способами сушки, как описано в заявке WO 87/07898, что соответствует варианту (В), и более эффективным способом сшивки согласно изобретению, включающим стадию осаждения, варианты (С) и (D). Во всех вариантах (B)-(D) была получена одинаковая MoD.

(B): На первой стадии сшивания использовали BDDE в концентрации 0,22% и NaOH в концентрации 0,75%. Диализ, добавление аммиака и сушку выполняли, как указано в варианте (А). Полученная пленка выглядела как в варианте (А) и ее обрабатывали таким же образом. Полученные частицы оставляли набухать в физиологическом растворе, помещали в шприц и автоклавировали.

(C): Первоначальное сшивания выполняли, как в варианте (В). Диализ проводили, как указано в варианте (А). Гель осаждали в этаноле и вторую, завершающую стадию сшивания проводили в 70% водном растворе этанола и 0,23% растворе NaOH. Частицы оставляли набухать в физиологическом растворе, помещали в шприц и автоклавировали.

(D): Выполняли способ получения, как в варианте (С), но заменяли стадию диализа на стадию промывки после стадии осаждения, чтобы удалить любые непрореагировавшие молекулы сшивающего агента.

Эффективное отношение сшивающего агента (CrR) определяли для полученных частиц из ГК для каждого эксперимента A-D, как показано в таблице 1.

Можно сделать вывод, что замена стадии сушки в экспериментах А и В с завершающим сшиванием ГК осажденной форме (C-D) резко увеличивает CrR в шесть раз без увеличения MoD. Из этого следует, что эффективность всей процедуры сшивания значительно возрастает, так как большее количество ковалентно связанных сшивающих агентов участвуют в фактическом сшивании ГК. Очевидно также, что замена диализа в экспериментах А-С промывкой ГК в осажденной форме (D) дополнительно увеличивает CrR, также без повышения MoD.

Пример 3 - Концентрации сшивающего агента на первоначальной стадии (а) сшивания

Выполняли первоначальную стадию сшивания ГК с помощью BDDE. Для контрольного образца (Ref от англ. reference) не проводили дополнительную стадию осаждения или сшивания осажденной ГК. Также готовили следующие образцы:

(A): Концентрации BDDE и ГК такие же, как и для контроля, но со сшиванием активированной ГК в осажденной форме

(B): Как А, но с BDDE равным 2/3*А

(C): Как А, но с BDDE равным 1/3*А

Завершающую стадию сшивания проводили в 70% ЕЮН, содержащем 50 мМ NaOH при 23° в течение 45 ч. Частицы для каждого образца оставляли набухать в физиологическом растворе, помещали в шприц и автоклавировали. Степень модификации (MoD), эффективное отношение сшивающего агента (CrR), степень набухания (SwD) и содержание геля определяли для полученных частиц ГК для каждого эксперимента A-D, как показано в таблице 2.

Очевидно, что включение завершающей стадии сшивания в варианте (А) дает более прочный гель (более низкое набухание) и более высокое CrR, чем контрольный образец. Сниженные концентрации сшивающего агента на первоначальной стадии (а) сшивания сохраняют высокое CrR и обеспечивают более слабый гель (более сильное набухание), но с уменьшением содержания геля.

Пример 4 - рН на завершающей стадии сшивания

Проводили первоначальную стадию сшивания ГК с помощью BDDE. Для контрольного образца (Ref) не проводили дополнительную стадию осаждения или сшивания осажденной ГК. Также готовили следующие образцы:

(A): Завершающая стадия сшивания в 70% ЕtOН без добавления NaOH, 23°C в течение 45 ч.

(B): Завершающая стадия сшивания в 70% ЕtOН, содержащем 50 мМ NaOH, 23°C в течение 45 ч.

Частицы для каждого эксперимента оставляли набухать в физиологическом растворе, помещали в шприц и автоклавировали. Степень модификации (MoD), эффективное отношение сшивающего агента (CrR), степень набухания (SwD) и содержание геля определяли для полученных частиц ГК для каждого эксперимента А-С, как показано в таблице 3.

Показано, что выполнение завершающего сшивания ГК осажденной форме (А-В) увеличивает CrR без увеличения MoD, в частности, когда добавляли NaOH (В). Кроме того, содержание геля в полученном продукте повышается при использовании завершающего сшивания ГК в осажденной форме, подтверждая, что оно повышает эффективность всей процедуры сшивания.

Пример 5 - Концентрация осадителя и рН на завершающей стадии сшивания

Выполняли первоначальную стадию сшивания ГК с помощью BDDE. Для контрольного образца (Ref) не проводили дополнительную стадию осаждения или сшивания осажденной ГК. Готовили образцы А-Е с завершающей стадией сшивания при 23°C в течение 45 ч с от 60 до 90% (об/об) этанола и от 30 до 70 мм NaOH, как показано в таблице 4.

Частицы из каждого эксперимента оставляли набухать в физиологическом растворе, помещали в шприц и автоклавировали. Степень модификации (MoD) и эффективное отношение сшивающего агента (CrR) определяли для полученных частиц ГК для каждого эксперимента А-Е, как показано в таблице 4.

Был сделан вывод, что эффективное отношение сшивающего агента не зависит от концентрации осадителя (этанола) и рН (концентрации NaOH) на завершающей стадии сшивания.

Пример 6 - Время и температура на завершающей стадии сшивания

Выполняли первоначальную стадию сшивания ГК с помощью BDDE. Осаждали активированную ГК и проводили завершающую стадию сшивания в 70% этаноле и 50 мМ NaOH при 23°C или 35°C в течение до 48 часов. Полученные частицы оставляли набухать в физиологическом растворе, помещали в шприц и автоклавировали.

Как показано на фиг. 3, эффективное отношение сшивающего агента определяли для полученных частиц ГК различного времени реакции и различных температур. Сделан вывод о том, что эффективное отношение сшивающего агента особо не зависит от температуры и достигает плато через менее чем 20 часов.

Пример 7 - Отношение сшивающего агента (CrR) для коммерчески доступных ГК-гелей (сравнительный)

Определяли CrR для коммерчески доступных гелей, как описано в методах анализа в разделе выше.

Для сравнения, продукты из поперечно-сшитой ГК согласно изобретению имеют CrR, равное 0,35 или выше, например в диапазоне от 0,35 до 0,8. Сделан вывод, что способ согласно изобретению предлагает новый ассортимент продуктов в виде геля из ГК с высокими значениями CrR.

Пример 8 - Скорость разрушения гелей из ГК, вызванного нагреванием

Определяли скорость разрушения гелей для образца геля из ГК, приготовленного, как описано в примере 3В выше. В качестве контроля использовали коммерчески доступный продукт Restylane от компании Q-Med/Galderma. Эксперименты проводили в двух экземплярах. CrR образца составил 0,6, а контрольного образца - 0,2.

Образец и контроль переносили во флаконы и выдерживали при 90°C. В разные моменты времени один флакон с образцом и один флакон с контролем охлаждали до комнатной температуры и анализировали на содержание геля. Результаты разрушения геля, вызванного нагреванием, показаны на фиг. 4, где значения, полученные для образца геля, изготовленного в соответствии с примером 3В, обозначены символом , и соответствующие значения для контрольного образца Restylane обозначены символом (х).

Сделан вывод, что скорость разрушения является в 2 раза более медленной для образца с высоким CrR по сравнению с контролем. Таким образом, гель, полученный согласно примеру 3В, будет иметь ожидаемое время действия in vivo в 2 раза большее, чем контроль.

Пример 9 - Скорость разрушения гелей из ГК, вызванного перекидными радикалами

Образец геля изготавливали в соответствии с Примером 6. Температура на завершающей стадии сшивания составляла 35°C в течение 24 ч. В качестве контроля использовали коммерчески доступный продукт Restylane от Q-Med/Galderma. CrR образца составляло 0,5 и контроля - 0,2.

Скорость разложения, вызванную радикалами, определяли для образцов геля и контроля. Эксперименты проводили в двух экземплярах. Скорость разложения, вызванную радикалами, определяли путем диспергирования 0,25 г геля в 10 мл физиологического раствора с фосфатным буфером. Источник радикалов, дигидрохлорид 2,2'-азо-бис-2-метил-пропанимидамида, добавляли в концентрации 10 мм, и реакцию проводили при 37°C. Содержание ГК в надосадочной жидкости определяли в различные моменты времени. Содержание геля рассчитывали из начального веса геля и содержания ГК в надосадочной жидкости в различные моменты времени. Результат разрушения, вызванного перекисными радикалами, показан на фиг. 5, где значения, полученные для образца геля, изготовленного в соответствии с Примером 6, обозначены символом и соответствующие значения для контроля Restylane обозначены символом (х),

Сделан вывод, что скорость разрушения в 2 раза меньше для образца с высоким CrR по сравнению с контролем. Таким образом, гель, полученный согласно примеру 6, с эффективным отношением сшивающего агента 0,5, будет иметь ожидаемое время действия in vivo в 2 раза большее, чем контроль.