СЛИТЫЕ БЕЛКИ СВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН-ИММУНОГЛОБУЛИН

ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение, в общем, относится к иммунологически активным рекомбинантным связывающим белкам и, в частности, к сконструированным молекулам слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, включая слитые белки одноцепочечный Fv-иммуноглобулин. Данное изобретение также относится к композициям и способам лечения злокачественных состояний и В-клеточных нарушений, включая заболевания, для которых характерна продукция аутоантител.

Молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны в макромолекулярный комплекс межцепочечными дисульфидными связями. Внутрицепочечные дисульфидные связи связывают различные области одной и той же полипептидной цепи, и это приводит к образованию петель, которые вместе с расположенными рядом аминокислотами образуют домены иммуноглобулина. Каждая легкая цепь и каждая тяжелая цепь имеет одну вариабельную область, которая проявляет значительную изменчивость аминокислотного состава от антитела к антителу. Вариабельная область легкой цепи, V_L, связана с вариабельной областью тяжелой цепи, V_H, образуя антигенсвязывающий сайт иммуноглобулина, Fv. Легкие цепи имеют один домен константной области, а тяжелые цепи имеют несколько доменов константной области. Классы IgG, IgA и IgE имеют три домена константной области, которые обозначены CH1, CH2 и CH3, а классы IgM и IgE имеют четыре домена константной области.

Тяжелые цепи иммуноглобулинов можно разделить на три функциональные области: Fd, шарнир и Fc. Область Fd содержит домены V_H и CH1 и вместе с легкой цепью образует Fab. Обычно считают, что фрагмент Fc отвечает за эффекторные функции иммуноглобулина, такие как фиксация комплемента и связывание с Fc-рецепторами. Шарнирная область, выявленная в классах IgG, IgA и IgD, действует как гибкий спейсер, позволяя Fab-части свободно перемещаться в пространстве. В отличие от константных областей шарнирные домены разнообразны по структуре, и варьируют как по последовательности, так и по длине среди классов и подклассов иммуноглобулинов. Например, три подкласса IgG человека, IgG1, IgG2 и IgG4, имеют шарнирные области из 12-15 аминокислот, тогда как IgG3 содержит примерно 62 аминокислоты, включая 21 остаток пролина и 11 остатков цистеина. Согласно кристаллографическим исследованиям шарнир, кроме того, можно функционально подразделить на три области: верхний шарнир, центральная часть и нижний шарнир (Shin et al., Immunological Reviews 130: 87 (1992)). Верхний шарнир включает в себя аминокислоты от карбоксильного конца CH1 до первого остатка в шарнире, который ограничивает движение, как правило, до первого остатка цистеина, который образует межцепочечную дисульфидную связь между двумя тяжелыми цепями. Длина верхней шарнирной области коррелирует с гибкостью участков антитела. Центральная шарнирная область содержит дисульфидные мостики внутри тяжелых цепей, и нижняя шарнирная область связана с аминоконцом домена CH2 и включает в себя остатки в CH2 (там же). Центральная шарнирная область IgG1 человека содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys, которая при образовании дисульфидных связей дает циклический октапептид, предположительно действующий как точка поворота, придавая таким образом гибкость. Шарнирная область также может содержать сайты присоединения углеводов. Например, IgA1 содержит пять сайтов для углеводов в пределах участка шарнирной области из 17 аминокислот, придавая шарниру исключительную устойчивость к протеазам кишечника, что считается свойством, дающим преимущество секретируемому иммуноглобулину.

Конформационные изменения, допускаемые структурой и гибкостью шарнирной области, могут влиять на эффекторные функции Fc-части антитела. Три основных категории эффекторных функций, связанных с Fc-областью, включают (1) активацию классического каскада комплемента, (2) взаимодействие с эффекторными клетками и (3) компартментализацию иммуноглобулинов. Различные подклассы IgG человека варьируют по своей относительной эффективности в активации и усилении стадий каскада комплемента. В общем, IgG1 и IgG3 наиболее эффективно фиксируют комплемент, IgG2 менее эффективен и IgG4 не активирует комплемент. Активация комплемента инициируется связыванием C1q, субъединицы первого компонента C1 в каскаде, с комплексом антиген-антитело. Хотя сайт связывания C1q локализован в CH2-домене антитела, шарнирная область влияет на способность антитела активировать каскад. Например, рекомбинантные иммуноглобулины, в которых отсутствует шарнирная область, не способны активировать комплемент (там же). В отсутствии гибкости, придаваемой шарнирной областью, Fab-часть антитела, связанная с антигеном, не способна принимать конформацию, необходимую для того, чтобы дать возможность C1q связаться с CH2 (смотри там же). Исследования показали, что длина шарнира и гибкость участков коррелирует с активацией комплемента; однако корреляция не является абсолютной. Молекулы IgG3 человека с измененными шарнирными областями, которые являются такими же негибкими, как IgG4, все еще эффективно активируют каскад.

Отсутствие шарнирной области также влияет на способность IgG-иммуноглобулинов человека связываться с рецепторами Fc на иммунных эффекторных клетках. Связывание иммуноглобулина с рецептором Fc способствует зависимой от антител клеточной цитотоксичности (ADCC), которая предположительно является важным способом элиминации опухолевых клеток. Семейство рецепторов Fc IgG человека делится на три группы, FcγRI (CD64), который способен с высокой аффинностью связывать IgG, FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), которые оба являются низкоаффинными рецепторами. Молекулярное взаимодействие между каждым из трех рецепторов и иммуноглобулином точно не установлено, но эксперименты свидетельствуют о том, что остатки в проксимальной по отношению к шарниру области домена CH2 имеют важное значение для специфичности взаимодействия между антителом и рецептором Fc. Кроме того, белки IgG1 миеломы и рекомбинантные химерные IgG3-антитела, в которых отсутствует шарнирная область, не способны связывать FcγRI, вероятно, вследствие того, что снижена доступность к CH2 (Shin et al., Intern. Rev. Immunol. 10: 177, 178-79 (1993)).

Технология моноклональных антител и генно-инженерные способы привели к быстрой разработке молекул иммуноглобулинов для диагностики и лечения заболеваний человека. Конструирование белков применяли для повышения аффинности антитела по отношению к узнаваемому им антигену, чтобы уменьшить проблемы, связанные с иммуногенностью, и чтобы изменить эффекторные функции антитела. Доменная структура иммуноглобулинов поддается конструированию, при котором можно произвести обмен антигенсвязывающими доменами и доменами, придающими эффекторные функции, между классами и подклассами иммуноглобулинов.

Кроме того, сконструированы меньшие по размеру молекулы иммуноглобулинов, чтобы преодолеть проблемы, связанные с терапией на основе целых иммуноглобулинов. Одноцепочечные Fv (scFv) содержат вариабельный домен тяжелой цепи, связанный посредством короткого линкерного пептида с вариабельным доменом легкой цепи (Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83, 1988). Вследствие небольшого размера молекул scFv наблюдается очень быстрый клиренс их из плазмы и тканей и более эффективное проникновение в ткани, чем целого иммуноглобулина. Антиопухолевые scFv показали более быстрое проникновение в опухоль и более равномерное распределение в массе опухоли, чем соответствующее химерное антитело (Yokota et al., Cancer Res. 52, 3402-08 (1992)). Слияние scFv с другой молекулой, такой как токсин, обладает преимуществом специфичной антигенсвязывающей активности и небольшого размера scFv для доставки токсина в ткань-мишень (Chaudary et al., Nature 339: 394 (1989); Batra et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2200 (1991)).

Несмотря на преимущества, которые приносят молекулы scFv для серотерапии, существует несколько недостатков данного терапевтического подхода. Хотя быстрый клиренс scFv может снижать токсические эффекты в нормальных клетках, такой быстрый клиренс может препятствовать доставке минимальной эффективной дозы в ткань-мишень. Производство адекватных количеств scFv для введения пациентам явилось сложной задачей вследствие трудностей, связанных с экспрессией и выделением scFv, которые неблагоприятно влияют на выход. Во время экспрессии молекулы scFv нестабильны и часто агрегируют в результате спаривания вариабельных областей из разных молекул. Кроме того, уровни продукции молекул scFv в экспрессирующих системах млекопитающих низкие, что ограничивает возможность эффективного производства молекул scFv для терапии (Davis et al., J. Biol. Chem. 265: 10410-18 (1990); Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-59 (1991)). Выявлены методики повышения продукции, включающие добавление сайтов гликозилирования к вариабельным областям (Jost, C. R. Патент США №5888773, Jost et al., J. Biol. Chem. 269: 26267-73 (1994)).

Конъюгирование или слияние токсинов с scFv дает очень эффективную молекулу, но дозирование ограничено токсичностью, обусловленной молекулой токсина. Токсические воздействия включают повышение уровней ферментов печени и синдром заменения проницаемости сосудов. Кроме того, иммунотоксины являются высоко иммуногенными и антитела хозяина, вырабатываемые против токсина, ограничивают возможность повторного лечения.

Дополнительным недостатком использования scFv для терапии является отсутствие эффекторной функции. scFv при отсутствии цитолитических функций, ADCC и зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC), связанных с константной областью иммуноглобулина, могут быть неэффективными при лечении заболевания. Хотя разработка методики scFv начата 12 лет назад, в настоящее время нет scFv-продуктов, одобренных для терапии.

Преимущество эффекторных функций, связанных с константной областью антитела, для лечения заболевания побудило к разработке слитых белков, в которых неиммуноглобулиновые последовательности заменяют вариабельной областью антитела. Например, CD4, поверхностный белок T-клеток, распознаваемый HIV, рекомбинантным способом сливали с эффекторным доменом Fc иммуноглобулина (Смотри Sensel et al., Chem. Immunol. 65: 129-158 (1997)). Биологическая активность такой молекулы отчасти будет зависеть от класса и подкласса выбранной константной области. Слитый белок IL-2-IgG1 влиял на опосредованный комплементом лизис клеток, несущих рецептор IL-2 (Смотри там же). Применение константных областей иммуноглобулинов для конструирования указанных и других слитых белков также может придавать улучшенные фармакокинетические свойства.

Заболевания и расстройства, которые, как считают, поддаются некоторым типам иммуноглобулиновой терапии, включают рак и расстройства иммунной системы. Рак включает широкий круг заболеваний, поражающих примерно одного из четырех людей во всем мире. Быстрая и неконтролируемая пролиферация злокачественных клеток является признаком многих типов злокачественных опухолей, включая гематологические злокачественные образования. Наибольшую пользу достижения в области терапии злокачественных опухолей в последние два десятилетия принесли пациентам с гематологическим злокачественным состоянием (Multani et al., J. Clin. Oncology 16: 3691-3710, 1998). Хотя возросла доля ремиссий, у большинства пациентов еще возникают рецидивы и они умирают из-за болезни. Препятствия для лечения цитотоксическими лекарственными средствами включают резистентность опухолевых клеток и высокую токсичность химиотерапии, которые мешают оптимальному дозированию для многих пациентов. Новые способы лечения, основанные на том, чтобы направлять к мишени молекулы, которые специфично связываются со злокачественной клеткой, включая моноклональные антитела (мАт), которые повышают эффективность, не увеличивая токсичность.

С тех пор как в 1975 году впервые были описаны мАт (Kohler et al., Nature 256: 495-97 (1975)), многие пациенты подверглись лечению мАт к антигенам, экспрессируемым на опухолевых клетках. Указанные исследования принесли важный опыт, касающийся выбора антигенных мишеней, подходящих для терапии. Во-первых, и наиболее важно, антигенная мишень не должна экспрессироваться важными нормальными тканями. К счастью злокачественные клетки крови экспрессируют много антигенов, которые не экспрессируются стволовыми клетками или другими жизненно важными клетками. Лечение гематологического злокачественного состояния, которое истощает популяции как нормальных, так и злокачественных клеток гематологического происхождения, приемлемо, так как после окончания терапии происходит регенерация нормальных клеток из предшественников. Во-вторых, антигенная мишень должна экспрессироваться на всех клоногенных популяциях опухолевых клеток, и экспрессия должна продолжаться, несмотря на избирательное давление иммуноглобулиновой терапии. Таким образом, выбор поверхностного идиотипа для терапии В-клеточной злокачественности ограничен ростом вариантов опухолевых клеток с измененной экспрессией поверхностных идиотипов, даже если антиген проявляет высокую степень избирательности по отношению к опухоли (Meeker et al., N. Engl. J. Med. 312: 1658-65 (1985)). В-третьих, выбранный антиген должен правильным образом перемещаться после связывания с ним иммуноглобулина. Сброс или интернализация антигенной мишени после того, как иммуноглобулин связывается с антигеном, может давать опухолевым клеткам возможность избежать разрушения, ограничивая таким образом эффективность серотерапии. В-четвертых, результатом связывания иммуноглобулина с антигенными мишенями, которые передают сигналы активации, могут быть усиленные функциональные ответы в опухолевых клетках, которые приводят к остановке роста и апоптозу. Хотя важны все указанные свойства, запуск апоптоза после связывания иммуноглобулина с антигеном может быть критическим фактором достижения успешной серотерапии.

Антигены, которые были тестированы в качестве мишеней для серотерапии B- и T-клеточных злокачественных опухолей, включают идиотип Ig (Brown et al., Blood 73: 651-61 (1989)), CD19 (Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32: 364-72 (1991); Vlasveld et al., Cancer Immunol. Immunother. 40: 37-47 (1995)), CD20 (Press et al., Blood 69: 584-91 (1987); Maloney et al., J. Clin. Oncol. 15: 3266-74, (1997)), CD21 (Scheinberg et. al., J. Clin. Oncol. 8: 792-803, (1990)), CD5 (Dillman et al., J. Biol. Respn. Mod. 5: 394-410 (1986)) и CD52 (CAMPATH) (Pawson et al., J. Clin. Oncol. 15: 2667-72, (1997)). Из них наибольшего успеха достигли с использованием CD20 в качестве мишени для терапии B-клеточных лимфом. Каждая из других мишеней была ограничена биологическими свойствами антигена. Например, поверхностный идиотип может быть изменен соматической мутацией, обеспечивающей спасение опухолевой клетки. CD5, CD21 и CD19 быстро интернализуются после связывания мАт, позволяя опухолевым клеткам избежать разрушения, если мАт не конъюгированы с токсичными молекулами. CD22 экспрессируется только на подгруппе В-клеточных лимфом, тогда как CD52 экспрессируется как на T-клетках, так и на B-клетках и вызывает иммуносупрессию из-за истощения популяции Т-клеток.

CD20 удовлетворяет описанным выше критериям для выбора подходящей антигенной мишени для терапии B-клеточного злокачественного состояния. Лечение пациентов с В-клеточной лимфомой низкой степени злокачественности или фолликулярной В-клеточной лимфомой с использованием химерного CD20-мАт индуцирует частичные или полные реакции у многих пациентов (McLaughlin et al., Blood 88: 90a (abstract, suppl. 1) (1996); Maloney et al., Blood 90: 2188-95 (1997)). Однако обычно происходит рецидив опухоли в течение периода времени от шести месяцев до одного года. Таким образом, необходимы дальнейшие усовершенствования серотерапии, чтобы индуцировать более продолжительные реакции при B-клеточной лимфоме низкой степени злокачественности и обеспечить возможность эффективного лечения лимфомы высокой степени злокачественности и других В-клеточных заболеваний.

Одним из подходов к улучшению серотерапии CD20 была целенаправленная доставка радиоизотопов к B-клеточным лимфомам с использованием мАт, специфичных по отношению к CD20. Хотя увеличивается эффективность терапии, также увеличивается связанная с этим токсичность из-за длительного периода полужизни радиоактивного антитела in vivo, иногда требующая того, чтобы подвергнуть пациента процедуре спасения стволовых клеток (Press et al., N. Eng. J. Med. 329: 1219-1224, 1993; Kaminski et al., N. Eng. J. Med. 329: 459-65 (1993)). мАт к CD20 расщепляли протеазами, получая фрагменты F(ab')₂ или Fab до связывания с радиоизотопом. Это повышало проникновение радиоизотопного конъюгата в опухоль и укорачивало время полужизни in vivo, уменьшая таким образом токсичность по отношению к нормальным тканям. Однако теряются преимущества эффекторных функций, включая фиксацию комплемента и ADCC, которые обеспечивает Fc-область CD20-мАт.Таким образом, для улучшенной доставки радиоизотопов необходима методика получения производного CD20-мАт, которое сохраняет Fc-зависимые эффекторные функции, но меньше по размеру, тем самым усиливая проникновение в опухоль и укорачивая время полужизни мАт.

CD20 была первой поверхностной молекулой человека, специфичной для B-клеточной линии, идентифицированной с помощью моноклонального антитела, но функция CD20 в биологии B-клеток еще не полностью выяснена. CD20 является негликозилированным гидрофобным фосфопротеином с М.м. 35 кД, амино- и карбоксильный концы которого расположены в цитоплазме (Einfeld et al., EMBO J. 7: 711-17 (1988)). Природные лиганды CD20 идентифицированы не были. CD20 экспрессируется всеми нормальными зрелыми B-клетками, но не экспрессируется предшественниками B-клеток.

CD20-мАт доставляют сигналы к нормальным B-клеткам, которые влияют на жизнеспособность и рост (Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494-98 (1986)). Недавние данные показали, что обширное сшивание CD20 могут индуцировать апоптоз линий клеток В-клеточной лимфомы (Shan et al., Blood 91: 1644-52 (1998)). Сшивание CD20 на поверхности клеток увеличивает значение и кинетику сигнальной трансдукции, которые регистрировали измерением фосфорилирования клеточных субстратов по остаткам тирозина (Deans et al., J. Immunol. 146: 846-53 (1993)). Важно, что апоптоз B-клеток лимфомы Рамоса так же индуцировался сшиванием CD20-мАт при добавлении клеток, позитивных в отношении Fc-рецептора (Shan et al., Blood 91: 1644-52 (1998)). Таким образом, кроме истощения популяции клеток посредством механизмов на основе комплемента и ADCC связывание Fc-рецептора CD20-мАт in vivo может стимулировать апоптоз злокачественных B-клеток посредством сшивания CD20. Данная теория согласуется с экспериментами, показывающими, что эффективность терапии с помощью CD20 человеческой лимфомы в модели на мышах SCID зависела от связывания Fc-рецептора мАт к CD20 (Funakoshi et al., J. Immunotherapy 19: 93-101 (1996)).

Полипептид CD20 содержит четыре трансмембранных домена (Einfeld et al., EMBO J. 7: 711-17, (1988); Stamenkovic et al., J. Exp.Med. 167: 1975-80 (1988); Tedder et al., J. Immunol. 141: 4388-4394 (1988)). Множественные домены, проходящие в мембране, предотвращают интернализацию CD20 после связывания с антителом. Указанное качество CD20 признано важным свойством для эффективной терапии В-клеточных злокачественных опухолей, когда мышиные CD20-мАт, 1F5, инъецировали пациентам с B-клеточной лимфомой, что приводило к значительному истощению популяции злокачественных клеток и частичным клиническим ответам (Press et al., Blood 69: 584-91 (1987)).

Поскольку нормальные зрелые B-клетки так же экспрессируют CD20, популяция нормальных B-клеток истощается во время терапии CD20-антителом (Reff M. E. et al., Blood 83: 435-445, 1994). Однако после завершения лечения нормальные B-клетки восстанавливаются из CD20-негативных предшественников B-клеток; таким образом, пациенты, которых лечили с помощью анти-CD20-терапии, не испытывают значительной иммуносупрессии. Истощение популяции нормальных B-клеток может быть полезным при заболеваниях, в которые вовлечена несвойственная продукция аутоантител, или других заболеваниях, в которых могут играть роль B-клетки. Химерное мАт, специфичное по отношению к CD20, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного происхождения, слитых с константными областями тяжелой цепи IgG1 человека и легкой каппа-цепи человека, сохраняют способность связываться с CD20 и опосредовать ADCC и фиксировать комплемент (Liu et al., J. Immunol. 139: 3521-26 (1987); Robinson et al., патент США No. 5500362). Указанная работа привела к разработке химерного CD20-мАт, ритуксимаба (Rituximab^TM)^, недавно одобренного Управлением по пищевым продуктам и медикаментам США (FDA) для лечения B-клеточных лимфом. Хотя после лечения ритуксимабом клинические ответы наблюдаются с высокой частотой, у пациентов часто возникают рецидивы примерно через 6-12 месяцев.

Для внутривенной инфузии требуются высокие дозы ритуксимаба, поскольку молекула является крупной, примерно 150 кД, и диффузия в лимфоидные ткани, где находится много опухолевых клеток, ограничена. Считают, что механизм противоопухолевой активности ритуксимаба заключается в комбинировании нескольких активностей, включая ADCC, фиксацию комплемента и запускание сигналов в злокачественных B-клетках, которые стимулируют апоптоз. Большой размер ритуксимаба препятствует оптимальной диффузии молекулы в лимфоидные ткани, которые содержат злокачественные B-клетки, тем самым ограничивая указанные противоопухолевые активности. Как обсуждалось выше, расщепление CD20-мАт протеазами на Fab- или F(ab')₂-фрагменты делает их меньшего размера и позволяет лучше проникать в лимфоидные ткани, но эффекторные функции, важные для противоопухолевой активности, теряются. Хотя фрагменты CD20-мАт могут быть более эффективными для доставки радиоизотопов, чем интактное антитело, желательным было бы конструирование производного CD20-мАт, которое сохраняет эффекторные функции Fc-части, но меньше по размеру, способствуя лучшему проникновению в опухоли и характеризуясь более коротким временем полужизни.

CD20 экспрессируется злокачественными клетками B-клеточной природы, включая B-клеточную лимфому и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). CD20 не экспрессируется злокачественными опухолями пре-B-клеток, такими как острый лимфобластный лейкоз. Таким образом, CD20 является хорошей мишенью для терапии B-клеточной лимфомы, CLL и других заболеваний, при которых B-клетки вовлечены в активность заболевания. Другие B-клеточные расстройства включают аутоиммунные заболевания, при которых продуцируются аутоантитела во время дифференцировки B-клеток в плазматические клетки. Примеры B-клеточных расстройств включают аутоиммунное заболевание щитовидной железы, включая болезнь Грейвса и тиреоидит Хашимото, ревматоидный артрит, системную красную волчанку (СКВ), синдром Шегрена, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), рассеянный склероз (MS), миастению (MG), псориаз, склеродерму и воспалительное заболевание кишечника, включая болезнь Крона и язвенный колит.

Из сказанного выше очевидна явная необходимость усовершенствования композиций и способов лечения злокачественных состояний и B-клеточных расстройств. Композиции и способы согласно данному изобретению преодолевают ограничения предшествующего уровня техники, предоставляя слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, содержащий полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, который слит с полипептидом константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитым с полипептидом константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин способен опосредовать ADCC или фиксацию комплемента. Кроме того, композиции и способы обеспечивают другие связанные преимущества.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аспектом данного изобретения является получение слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, содержащего (a) полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, где указанный полипептид шарнирной области выбран из группы, состоящей из (i) мутантного полипептида шарнирной области, который не содержит остатков цистеина и который получен из полипептида шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, имеющего один или более остатков цистеина, (ii) мутантного полипептида шарнирной области, который содержит один остаток цистеина и который получен из полипептида шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, имеющего два или более остатков цистеина, (iii) полипептида шарнирной области IgA дикого типа человека, (iv) мутантного полипептида шарнирной области IgA человека, который не содержит остатков цистеина и который получен из полипептида области IgA дикого типа человека, и (v) мутантного полипептида шарнирной области IgA человека, который содержит один остаток цистеина и который получен из полипептида области IgA дикого типа человека; (b) полипептид константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, который слит с полипептидом шарнирной области; и (c) полипептид константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, который слит с полипептидом константной области CH2, где: (1) слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин способен проявлять, по меньшей мере, одну иммунологическую активность, выбранную из группы, состоящей из антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности и фиксации комплемента, и (2) полипептид связывающего домена способен специфично связываться с антигеном. В одном варианте полипептид шарнирной области иммуноглобулина является мутантным полипептидом шарнирной области и проявляет пониженную способность димеризоваться по сравнению с полипептидом шарнирной области человеческого иммуноглобулина G дикого типа. В другом варианте полипептид связывающего домена содержит, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина, который является полипептидом вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина или полипептидом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В следующем варианте полипептид вариабельной области иммуноглобулина получен из иммуноглобулина человека.

В другом варианте полипептид связывающего домена слитого белка связывающий домен Fv-иммуноглобулин содержит (a) по меньшей мере, один полипептид вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина; (b) по меньшей мере, один полипептид вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина и (c) по меньшей мере, один линкерный пептид, который слит с полипептидом (a) и с полипептидом (b). В следующем варианте полипептиды вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина и вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина получены из иммуноглобулинов человека.

В другом варианте, по меньшей мере, один из полипептидов - полипептид константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептид константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, получен из тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В другом варианте полипептиды константных областей CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина относятся к изотипу, выбранному из IgG человека и IgA человека. В другом варианте антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, CD37, CD40 и L6. В некоторых следующих вариантах описанного выше слитого белка линкерный полипептид содержит, по меньшей мере, один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO: 21], и в некоторых других вариантах линкерный полипептид содержит, по меньшей мере, три повтора полипептида, имеющего аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO: 21]. В некоторых вариантах полипептид шарнирной области иммуноглобулина содержит полипептид шарнирной области IgA человека. В некоторых вариантах полипептид связывающего домена содержит внеклеточный домен CD154. В некоторых вариантах полипептид связывающего домена содержит внеклеточный домен CD154 и, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина.

В других вариантах изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему любой из описанных выше слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, и в связанных вариантах изобретение относится к рекомбинантной экспрессирующей конструкции, содержащей такой полинуклеотид, и в некоторых следующих вариантах изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной такой рекомбинантной экспрессирующей конструкцией. В другом варианте изобретение относится к способу получения слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, включающему стадии (a) культивирования раскрытой здесь клетки-хозяина, в условиях, которые обеспечивают экспрессию слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин; и (b) выделения слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин из культуры клеток-хозяев.

Данное изобретение также относится к некоторым вариантам фармацевтической композиции, содержащей слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, который описан выше, в комбинации с физиологически приемлемым носителем. В другом варианте представлен способ лечения субъекта, у которого имеется или предположительно имеется злокачественное состояние или В-клеточное расстройство, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества описанного выше слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин. В некоторых следующих вариантах злокачественным состоянием или В-клеточным расстройством является В-клеточная лимфома или заболевание, которое характеризуется продукцией аутоантител, и в некоторых других вариантах злокачественным состоянием или В-клеточным расстройством является ревматоидный артрит, миастения, болезнь Грейвса, сахарный диабет типа I, рассеянный склероз или аутоиммунное заболевание.

Указанные и другие аспекты данного изобретения станут более понятными при обращении к следующему подробному описанию и прилагаемым чертежам. Все указанные источники информации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме, так же как были бы включены по отдельности.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана последовательность DNA и расшифрованная аминокислотная последовательность [SEQ ID NO: 15] 2H7scFv-Ig, слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, способного специфично связывать CD20.

На фигуре 2 показаны уровни продукции 2Н7 scFv-Ig трансфицированными стабильными линиями СНО и получение стандартной кривой с помощью связывания очищенного 2Н7 scFv-Ig с клетками СНО, экспрессирующими CD20.

На фигуре 3 показан анализ в SDS-ПААГ различных препаратов выделенного белка 2H7scFv-Ig.

На фигуре 4 показана фиксация комплемента (фиг.4А) и опосредование антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC, фиг.4В)) посредством 2H7scFv-Ig.

На фигуре 5 показано влияние одновременного лигирования CD20 и CD40 на рост нормальных В-клеток.

На фигуре 6 показано влияние одновременного лигирования CD20 и CD40 на экспрессию CD95 и индукцию апоптоза в лимфобластоидной В-клеточной линии.

На фигуре 7 показана последовательность DNA и расшифрованная аминокислотная последовательность слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154 L2 (фиг.7А, SEQ ID NO:21 и 33) и 2H7scFv-CD154 34 (фиг.7 В, SEQ ID NO:22 и 34), способных специфично связывать CD20 и CD40.

На фигуре 8 показано связывание слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154 с СНО-клетками CD20⁺с помощью проточной иммуноцитофлуорометрии.

На фигуре 9 показано связывание аннексина V с линиями В-клеток Ramos, ВJAB и Т51 после связывания с клетками слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154.

На фигуре 10 показано влияние на пролиферацию В-клеточной линии Т51 после связывания слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154.

На фигуре 11 изображено схематичное представление структур слитых белков, 2H7ScFv-Ig [SEQ ID NO:16, 17 и 18], называемых производными CytoxB или CytoxB: CytoxB-MHWTG1C (2H7-ScFv, мутантный шарнир, Fc-домен человеческого IgG1 дикого типа), CytoxB-MHMG1C (2H7-ScFv, мутантный шарнир, мутантный Fc-домен IgG1 человека) и CytoxB-IgAHWTHG1C (2H7-ScFv, шарнир, полученный из IgA человека, соответственно, Fc-домен IgG1 дикого типа человека). Стрелками указаны номера положений аминокислотных остатков, которые предположительно участвуют в связывании FcR и в активности ADCC (темные стрелки), и в фиксации комплемента (светлые стрелки). Межцепочечные дисульфидные связи не указаны.

На фигуре 12 показан анализ в SDS-ПААГ выделенных слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин CytoxB и 2H7scFv-CD154.

На фигуре 13 показана антителозависимая опосредованная клетками цитотоксическая (ADCC) активность производных CytoxB.

На фигуре 14 показана комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) производных CytoxB.

На фигуре 15 показаны определения времени полужизни в сыворотке CytoxB-MHWTG1C в образцах крови макак.

На фигуре 16 показано влияние CytoxB-MHWTG1C на уровни циркулирующих В-клеток CD40+в образцах крови макак.

На фигуре 17 показаны уровни продукции HD37 (CD19-специфичного)-ScFv-Ig трансфицированными линиями клеток млекопитающих и получение стандартной кривой с помощью связывания очищенного HD37-ScFv-Ig с клетками, экспрессирующими CD19.

На фигуре 18 показаны уровни L6 (антиген карциномы)-ScFv-Ig трансфицированными стабильными линиями CHO и получение стандартной кривой с помощью связывания очищенного L6-ScFv-Ig с клетками, экспрессирующими антиген L6.

На фигуре 19 показана ADCC-активность слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин 2H7-ScFv-Ig, HD37-ScFv-Ig и G28-1 (CD37-специфичного)-ScFv-Ig.

На фигуре 20 показана ADCC-активность слитых белков L6-ScFv-Ig.

На фигуре 21 показан анализ в SDS-ПААГ слитых белков L6-ScFv-Ig и 2H7-ScFv-Ig.

На фигуре 22 показан анализ в SDS-ПААГ слитых белков G28-1-ScFv-Ig и HD37-ScFv-Ig.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение направлено на слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин и родственные композиции и способы, которые будут использованы в иммунотерапевтических и иммунодиагностических применениях и которые дают определенные преимущества по сравнению с антиген-специфичными полипептидами предшествующего уровня техники. Слитые белки согласно данному изобретению предпочтительно представляют собой одиночные полипептидные цепи, которые содержат в существенной части следующие слитые домены: полипептид связывающего домена, полипептид шарнирной области иммуноглобулина, полипептид константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептид константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина. В особенно предпочтительных вариантах полипептидные домены, из которых состоит слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, являются или получены из полипептидов, которые представляют собой продукты генных последовательностей человека, но изобретение не следует ограничивать таким образом, и в действительности оно может относиться к слитым белкам связывающий домен-иммуноглобулин, которые представлены в данном описании, которые получены из любого природного или искусственного источника, включая генетически сконструированные и/или мутантные полипептиды.

Данное изобретение частично относится к неожиданному наблюдению того, что приведенные в данном описании слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин способны проявлять иммунологическую активность. Более конкретно указанные белки сохраняют способность принимать участие в хорошо известных иммунологических эффекторных активностях, включая антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC, например, происходящее после связывания антигена на поверхности клеток контактирование и индукцию цитотоксических эффекторных клеток, несущих соответствующие Fc-рецепторы, таких как природные клетки-киллеры (NK), несущие FcRγIII, в соответствующих условиях) и/или фиксацию комплемента в случае комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC, например, происходящее после связывания антигена на поверхности клеток, рекрутмент и активация цитолитических белков, которые являются компонентами каскада комплемента крови), несмотря на наличие структур, для которых не ожидали, что они способны стимулировать такие эффекторные активности. Как описано более подробно ниже, ADCC и CDC являются неожиданными функциями для мономерных белков, содержащих области тяжелой цепи иммуноглобулина, которые предпочтительны благодаря структурам, выбранным для рассматриваемых слитых белков, и, в частности, благодаря выбору полипептидов шарнирной области, в которых нарушена способность образовывать межцепочечные, дисульфидные связи гомодимеров.

Другим преимуществом, предоставляемым данным изобретением, является слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин, который можно получить в значительных количествах, как правило, больших, чем обычно достигаемые количества в случае конструкций одноцепочечного антитела предшествующего уровня техники. В предпочтительных вариантах слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению рекомбинантно экспрессируют в экспрессирующих системах млекопитающих, которые дают преимущество, предоставляя полипептиды, которые стабильны in vivo (например, при физиологических условиях). Согласно не ограничивающей теории такую стабильность отчасти можно получить на основе посттрансляционных модификаций, и, в частности, гликозилирования слитых белков. Продукция данных слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин посредством рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих была достигнута в стационарных культурах клеток на уровне, превышающем 50 мг белка в литре надосадка культуры, и обычно наблюдалась в таких культурах на уровне 10-50 мг/л, так что предпочтительно в условиях стационарной культуры можно получить, по меньшей мере, 10-50 мг/л; также предполагается усиленная продукция слитых белков с использованием общепринятых в данной области методик крупномасштабного производства, таких как способ получения с «периодической подпиткой» (т.е. нестационарный), где получают выходы, составляющие, по меньшей мере, 5-500 мг/л, и в некоторых случаях, по меньшей мере, 0,5-1 г/л в зависимости от конкретного белкового продукта.

Полипептидом связывающего домена согласно данному изобретению может быть любой полипептид, который обладает способностью специфично распознавать и стабильно или временно связываться с узнаваемой биологической молекулой или комплексом нескольких молекул или с группой или агрегатом таких молекул, которые включают белок, полипептид, пептид, аминокислоту или их производное; липид, жирную кислоту и тому подобное; углевод, сахарид или тому подобное или их производное, нуклеиновую кислоту, нуклеотид, нуклеозид, пурин, пиримидин или родственную молекулу, или их производное, или тому подобное; или их любую комбинацию, например, гликопротеин, гликопептид, гликолипид, липопротеин, протеолипид; или любую другую биологическую молекулу, которая может присутствовать в биологическом образце. Биологический образец можно приготовить, получая образец крови, образец биопсии, эксплантат ткани, культуру органов, биологическую жидкость или любой другой препарат ткани или клеток от субъекта или из биологического источника. Субъектом или биологическим источником может быть человек или животное, отличное от человека, первичная культура клеток или линия клеток, адаптированных в культуре, включая, но не ограничивая указанным, генетически сконструированные линии клеток, которые могут содержать интегрированные в хромосому или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, иммортализованные или неиммортализованные линии клеток, клеточные линии гибридов соматических клеток, дифференцированные или недифференцированные клеточные линии, трансформированные линии клеток и тому подобное. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения для субъекта или биологического источника может предположительно существовать риск или он может подвергаться риску наличия злокачественного состояния или B-клеточного расстройства, которое представлено в данном описании и которое в некоторых дополнительных предпочтительных вариантах может представлять собой аутоиммунное заболевание, и в некоторых других предпочтительных вариантах изобретения может быть известно, что субъект или биологический источник не подвергается риску или не имеет такого заболевания.

Таким образом, полипептидом связывающего домена может быть любой имеющий природное происхождение или полученный рекомбинантно партнер связывания соответствующей биологической молекулы, которая представлена в данном описании и которая является представляющей интерес структурой-мишенью, называемой в данном описании «антигеном», но означающей согласно данному описанию структуру, охватывающую любую биологическую молекулу-мишень, с которой требуется специфичное связывание слитого белка согласно данному изобретению. Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин определяют как «иммуноспецифичные» или способные специфично связываться, если они связываются с требуемой молекулой-мишенью, такой как представленный в данном описании антиген, с K_a, большей или равной примерно 10⁴ M^-1, предпочтительно большей или равной примерно 10⁵ M^-1, более предпочтительно большей или равной примерно 10⁶ M^-1 и еще более предпочтительно большей или равной примерно 10⁷ M^-1. Аффинности связывания слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению можно легко определить с использованием обычных способов, например, способов, описанных Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660 (1949). Такое определение связывания слитого белка с представляющими интерес антигенными мишенями также можно осуществить, используя любой из ряда известных способов идентификации и получения белков, которые специфично взаимодействуют с другими белками или полипептидами, например, двугибридную дрожжевую систему скрининга, такую как система, описанная в патенте США No. 5283173 и патенте США No. 5468614, или эквивалентную.

Предпочтительные варианты слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению содержат связывающие домены, которые включают, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина, такой как вся или часть или фрагмент V-области тяжелой цепи или легкой цепи, при условии, что он способен специфично связывать антиген или другую требуемую представляющую интерес структуру-мишень, приведенную в данном описании. В других предпочтительных вариантах связывающий домен содержит одноцепочечный полученный из иммуноглобулина Fv-продукт, который может включать всю или часть, по меньшей мере, одной V-области легкой цепи иммуноглобулина и всю или часть, по меньшей мере, одной V-области тяжелой цепи иммуноглобулина и который дополнительно содержит линкер, слитый с V-областями; получение и тестирование таких конструкций приведено в данном описании более подробно и известно в данной области. Другие полипептиды связывающего домена могут содержать любой белок или его часть, которая сохраняет способность специфично связываться с антигеном, который приведен в данном описании, включая белки, отличные от иммуноглобулинов. Таким образом, изобретение охватывает слитые белки, содержащие полипептиды связывающего домена, которые получены из полипептидных лигандов, таких как гормоны, цитокины, хемокины и тому подобное; рецепторов клеточной поверхности или растворимых рецепторов для таких полипептидных лигандов; лектинов; рецепторов межклеточной адгезии, таких как специфичные лейкоцитарные интегрины, селектинов, представителей суперсемейства генов иммуноглобулинов, молекул межклеточной адгезии (ICAM-1,-2,-3) и тому подобного; антигенов гистосовместимости и т.д.

Примеры рецепторов клеточной поверхности, которые могут представлять полипептид связывающего домена и которые также могут быть выбраны в качестве молекулы-мишени или антигена, с которым желательно связывается слитый белок связывающий домен-Ig согласно данному изобретению, включает следующие или подобные рецепторы: HER1 (например, с депозитарным номером в GenBank No. U48722, SEG_HEGFREXS, K03193), HER2 (Yoshino et al., 1994 J. Immunol. 152: 2393; Disis et al., 1994 Canc. Res. 54: 16; смотри, например, также GenBank депозитарный No. X03363, M17730, SEG_HUMHER20), HER3 (например, GenBank депозитарный No. U29339, M34309), HER4 (Plowman et al., 1993 Nature 366: 473; смотри также, например, GenBank депозитарный No. L07868, T64105), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) (например, GenBank депозитарный No. U48722, SEG_HEGFREXS, KO3193), фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (например, GenBank No. M32977), рецептор фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (например, GenBank депозитарный No. AF022375, 1680143, U48801, X62568), инсулиноподобный фактор роста I (например, GenBank депозитарный No. X00173, X56774, X56773, X06043, смотри также европейский патент No. GB 2241703), инсулиноподобный фактор роста II (например, GenBank депозитарный No. X03562, X00910, SEG_HUMGFIA, SEG_HUMGFI2, M17863, M17862), рецептор трансферрина (Trowbridge and Omary, 1981 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3039; смотри также, например, GenBank депозитарный No. X01060, M11507), рецептор эстрогена (например, GenBank депозитарный No. M38651, X03635, X99101, U47678, M12674), рецептор прогестерона (например, GenBank депозитарный No. X51730, X69068, M15716), рецептор фолликулостимулирующего гормона (FSH-R) (например, GenBank депозитарный No. Z34260, M65085), рецептор ретиноевой кислоты (например, GenBank депозитарный No. L12060, M60909, X77664, X57280, X07282, X06538), MUC-1 (Barnes et al., 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 7159; смотри также, например, GenBank депозитарный No. SEG_MUSMUCIO, M65132, M64928) NY-ESO-1 (например, GenBank депозитарный No. AJ003149, U87459), NA 17-A (например, в европейском патенте No. WO 96/40039), мелан-A/MART-1 (Kawakami et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515; смотри также, например, GenBank депозитарный No. U06654, U06452), тирозиназу (Topalian et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 9461; смотри также, например, GenBank депозитарный No. M26729, SEG_HUMTYR0, смотри также Weber et al., J. Clin. Invest. (1998) 102: 1258), Gp-100 (Kawakami et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515; смотри также, например, GenBank депозитарный No. S73003, смотри также европейский патент No. EP 668350; Adema et al., 1994 J. Biol. Chem. 269: 20126), MAGE (van den Bruggen et al., 1991 Science 254: 1643; смотри также, например, GenBank депозитарный No. U93163, AF064589, U66083, D32077, D32076, D32075, U10694, U10693, U10691, U10690, U10689, U10688, U10687, U10686, U10685, L18877, U10340, U10339, L18920, U03735, M77481), GAGE (например, GenBank депозитарный No. U19180, смотри также патенты США No. 5683886 и 5571711), GAGE (например, GenBank депозитарный No. AF055475, AF055474, AF055473, U19147, U19146, U19145, U19144, U19143, U19142), любой из CTA-класса рецепторов, включая, в частности, антиген HOM-MEL-40, кодируемый геном SSX2 (например, GenBank депозитарный No. X86175, U90842, U90841, X86174), онкофетальный антиген (CEA, Gold and Freedman, 1985 J. Exp.Med 121: 439; смотри также, например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCEA, M59710, M59255, M29540) и PyLT (например, GenBank депозитарный No. J02289, J02038).

Дополнительные рецепторы клеточной поверхности, которые могут быть источниками полипептидов связывающего домена или которые могут быть соответствующими антигенами, включают следующие или подобные примеры: CD2 (например, GenBank депозитарный No. Y00023, SEG_HUMCD2, M16336, M16445, SEG_MUSCD2, M14362), 4-1BB (CDw137, Kwon et al., 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 1963), лиганд 4-1BB (Goodwin et al., 1993 Eur. J. Immunol. 23: 2361; Melero et al., 1998 Eur. J. Immunol. 3: 116), CD5 (например, GenBank депозитарный No. X78985, X89405), CD10 (например, GenBank депозитарный No. M81591, X76732), CD27 (например, GenBank депозитарный No. M63928, L24495, L08096), CD28 (June et al., 1990 Immunol. Today 11: 211; смотри также, например, GenBank депозитарный No. J02988, SEG_HUMCD28, M34563), CTLA-4 (например, GenBank депозитарный No. L15006, X05719, SEG_HUMIGCTL), CD40 (например, GenBank депозитарный No. M83312, SEG_MUSC040A0, Y10507, X67878, X96710, U15637, L07414), интерферон-γ (IFN-γ; смотри, например, Farrar et al. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11: 571 и цитированные в данной работе ссылки, Gray et al. 1982 Nature 295: 503, Rinderknecht et al. 1984 J. Biol. Chem. 259: 6790, DeGrado et al. 1982 Nature 300: 379), интерлейкин-4 (IL-4; смотри, например, 53rd Forum in Immunology, 1993 Research in Immunol. 144: 553-643; Banchereau et al., 1994 в The Cytokine Handbook, 2nd ed., A. Thomson, ed., Academic Press, NY, p.99; Keegan et al., 1994 J. Leukocyt. Biol. 55: 272, и цитированные в данных работах ссылки), интерлейкин-17 (IL-17) (например, GenBank депозитарный No. U32659, U43088) и рецептор интерлейкина-17 (IL-17R) (например, GenBank депозитарный No. U31993, U58917). Несмотря на вышесказанное, данное изобретение определенно не охватывает, в частности, слитые иммуноглобулиновые белки, которые заявлены в патенте США 5807734, 5795572 или 5807734.

Дополнительные рецепторы клеточной поверхности, которые могут быть источниками полипептидов связывающего домена или которые могут быть соответствующими антигенами, включают следующие или подобные примеры: CD59 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD590, M95708, M34671), CD48 (например, GenBank депозитарный No. M59904), CD58/LFA-3 (например, GenBank депозитарный No. A25933, Y00636, E12817; смотри также JP 1997075090-A), CD72 (например, GenBank депозитарный No. AA311036, S40777, L35772), CD70 (например, GenBank депозитарный No. Y13636, S69339), CD80/B7.1 (Freeman et al., 1989 J. Immunol. 43: 2714; Freeman et al., 1991 J. Exp.Med. 174: 625; смотри также, например, GenBank депозитарный No. U33208, I683379), CD86/B7.2 (Freeman et al., 1993 J. Exp.Med. 178: 2185, Boriello et al., 1995 J. Immunol. 155: 5490; смотри также, например, GenBank депозитарный No. AF099105, SEG_MMB72G, U39466, U04343, SEG_HSB725, L25606, L25259), лиганд CD40 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD40L, X67878, X65453, L07414), IL-17 (например, GenBank депозитарный No. U32659, U43088), CD43 (например, GenBank депозитарный No. X52075, J04536) и VLA-4 (α₄β₇) (например, GenBank депозитарный No. L12002, X16983, L20788, U97031, L24913, M68892, M95632). Следующие рецепторы поверхности клеток обычно связаны с B-клетками: CD19 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD19W0, M84371, SEG_MUSCD19W, M62542), CD20 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD20, M62541), CD22 (например, GenBank депозитарный No. I680629, Y10210, X59350, U62631, X52782, L16928), лиганд CD30 (например, GenBank депозитарный No. L09753, M83554), CD37 (например, GenBank депозитарный No. SEG_MMCD37X, X14046, X53517), CD106 (VCAM-1) (например, GenBank депозитарный No. X53051, X67783, SEG_MMVCAM1C, смотри также патент США No. 5596090), CD54 (ICAM-1) (например, GenBank депозитарный No. X84737, S82847, X06990, J03132, SEG_MUSICAM0), интерлейкин-12 (смотри, например, Reiter et al., 1993 Crit. Rev. Immunol. 13: 1, и цитированные в данной работе ссылки). Дополнительные клеточные агенты также могут включать любой из следующих рецепторов клеточной поверхности, обычно связанных с дендритными клетками: CD83 (например, GenBank депозитарный No. AF001036, AL021918), DEC-205 (например, GenBank депозитарный No. AF011333, U19271).

Полипептид шарнирной области иммуноглобулина, который обсуждается выше, включает любой пептид или полипептид шарнира, который имеет природное происхождение, получен в виде искусственного пептида или в виде результата генетического конструирования и который расположен в полипептиде тяжелой цепи иммуноглобулина между аминокислотными остатками, ответственными за образование внутрицепочечных дисульфидных связей доменов иммуноглобулина в областях CH1 и CH2; полипептиды шарнирной области для применения в данном изобретении также могут включать мутантный полипептид шарнирной области. Таким образом, полипептид шарнирной области иммуноглобулина можно получить из части или фрагмента или он может являться частью или фрагментом (т.е. одна или более аминокислот, связанных пептидной связью, обычно 5-65 аминокислот, предпочтительно 10-50, более предпочтительно 15-35, еще более предпочтительно 18-32, еще более предпочтительно 20-30, еще более предпочтительно 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 аминокислот) области полипептидной цепи иммуноглобулина, которая согласно классическим представлениям обладает функцией шарнира, которая описана выше, но полипептид шарнирной области для применения в настоящем изобретении не следует ограничивать таким образом, и он может включать аминокислоты, расположенные (в соответствии со структурными критериями для размещения конкретного остатка в конкретном домене, который может варьировать, как известно в данной области) в прилегающем домене иммуноглобулина, таком как домен CH1 или домен CH2, или в случае некоторых искусственно сконструированных конструкций иммуноглобулина домен вариабельной области иммуноглобулина.

Полипептиды шарнирной области иммуноглобулина дикого типа включают любую область шарнира природного происхождения, которая расположена между доменами константной области CH1 и CH2 иммуноглобулина. Полипептид шарнирной области иммуноглобулина дикого типа предпочтительно является полипептидом шарнирной области иммуноглобулина человека, предпочтительно содержащим шарнирную область иммуноглобулина IgG человека, и более предпочтительно полипептид шарнирной области изотипа IgG1 человека. Как известно в данной области, несмотря на огромное общее разнообразие аминокислотных последовательностей иммуноглобулина, в первичной структуре иммуноглобулина наблюдается высокая степень консерватизма последовательностей в конкретных частях полипептидных цепей иммуноглобулинов, особенно по отношению к расположению остатков цистеина, которые благодаря своим сульфгидрильным группам обеспечивают возможность для образования дисульфидных связей с другими имеющимися сульфгидрильными группами. Таким образом, в контексте данного изобретения полипептиды шарнирной области иммуноглобулина дикого типа можно рассматривать как полипептиды, характерной особенностью которых является один или более высоко консервативных (например, преобладающих в популяции статистически значимым образом) остатков цистеина и в некоторых предпочтительных вариантах можно выбрать мутантный полипептид шарнирной области, который не содержит или содержит один остаток цистеина и который получен из такой шарнирной области дикого типа.

Мутантный полипептид шарнирной области иммуноглобулина может содержать область шарнира, которая имеет происхождение из иммуноглобулина вида, изотипа или класса иммуноглобулина или подкласса иммуноглобулина, который отличается от такового для доменов CH2 и CH3. Например, в некоторых вариантах изобретения слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин может содержать полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, содержащим полипептид шарнирной области человеческого IgA дикого типа или мутантный полипептид шарнирной области IgA человека, который не содержит или содержит только один остаток цистеина, как указано в данном описании. Такой полипептид шарнирной области может быть слит с полипептидом области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина из Ig другого изотипа или класса, например подкласса IgG, который в некоторых предпочтительных вариантах будет представлять собой подкласс IgG1.

Например, и как описано более подробно далее, в некоторых вариантах данного изобретения выбран полипептид шарнирной области иммуноглобулина, который получен из шарнирной области IgA дикого типа человека, который в природе содержит три цистеина, при этом выбранный полипептид шарнирной области укорочен по сравнению с полной шарнирной областью так, что остается только один остаток цистеина (например, SEQ ID NO: 35-36). Подобным образом в некоторых других вариантах изобретения слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин содержит полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, содержащим мутантный полипептид шарнирной области, в котором количество остатков цистеина уменьшено с помощью аминокислотной замены или делеции. Таким образом, мутантный полипептид шарнирной области можно получить из шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, которая содержит один или более остатков цистеина. В некоторых вариантах мутантный полипептид шарнирной области может не содержать или содержать только один остаток цистеина, при этом мутантный полипептид шарнирной области получают из шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, которая содержит соответственно, один или более или два или более остатков цистеина. В мутантном полипептиде шарнирной области остатки цистеина шарнирной области иммуноглобулина дикого типа предпочтительно заменяют аминокислотами, которые неспособны образовывать дисульфидную связь. В одном варианте изобретения мутантный полипептид шарнирной области получают из полипептида шарнирной области IgG дикого типа человека, который может включать любой из четырех подклассов изотипа IgG человека, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых предпочтительных вариантах мутантный полипептид шарнирной области получают из полипептида шарнирной области IgG1 дикого типа человека. В качестве примера мутантный полипептид шарнирной области, полученный из полипептида шарнирной области IgG1 дикого типа человека, может содержать мутации в двух из трех остатков цистеина в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа или мутации во всех трех остатках цистеина.

Остатки цистеина, которые присутствуют в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа и которые удаляют в результате мутагенеза согласно особенно предпочтительным вариантам данного изобретения, включают остатки цистеина, которые образуют или которые способны образовывать межцепочечные дисульфидные связи. Не желая связывать с теорией, в данном изобретении предполагают, что мутация таких остатков цистеина шарнирной области, которые предположительно вовлечены в образование межцепочечных дисульфидных мостиков, снижает способность слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению димеризоваться (или образовывать олигомеры более высокого порядка) посредством образования дисульфидных связей, при этом неожиданно не лишая способности слитого белка стимулировать антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC) или фиксировать комплемент. В частности, Fc-рецепторы (FcR), которые опосредуют ADCC (например, FcRIII, CD16), проявляют низкую аффинность в отношении Fc-доменов иммуноглобулина, что свидетельствует о том, что функциональное связывание Fc с FcR требует стабилизации авидности комплекса Fc-FcR благодаря димерной структуре тяжелых цепей в обычном антителе, и/или агрегации и сшиванию FcR с помощью обычной Fc-структуры Ат. (Sonderman et al., 2000 Nature 406: 267; Radaev et al., 2001 J. Biol. Chem. 276: 16469; Radaev et al., 2001 J. Biol. Chem. 276: 16478; Koolwijk et al., 1989 J. Immunol. 143: 1656; Kato et al., 2000 Immunol. Today 21: 310). Следовательно, слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению обеспечивают преимущества, связанные с одноцепочечными слитыми белками иммуноглобулина, при этом также неожиданно сохраняя иммунологическую активность. Подобным образом, способность фиксировать комплемент обычно связана с иммуноглобулинами, которые являются димерными по отношению к константным областям тяжелой цепи, такими как области, которые содержат Fc, несмотря на это слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению проявляют неожиданную способность фиксировать комплемент.

Как отмечено выше, предполагают, что в слитых белках связывающий домен-иммуноглобулин согласно не ограничивающей теории нарушена их способность димеризоваться и, кроме того, согласно теории указанное свойство является следствием снижения количества остатков цистеина, которые присутствуют в полипептиде шарнирной области иммуноглобулина, выбранном для включения в конструкцию слитого белка. Определение относительной способности полипептида димеризоваться хорошо известно в соответствующей области, при этом можно использовать любую из ряда разработанных методик для выявления димеризации белка (смотри, например, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 1987 Springer-Verlag, New York). Например, способы биохимического разделения для разделения белков на основе размера молекул (например, гель-электрофорез, гель-фильтрационная хроматография, аналитическое ультрацентрифугирование и т.д.) и/или сравнение физико-химических свойств белков до и после введения активных по отношению к сульфгидрильным группам (например, йодацетамид, N-этилмалеимид) или снижающих образование дисульфидных связей (например, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол) агентов или другие эквивалентные методики, все указанные способы можно использовать для определения степени димеризации или олигомеризации полипептидов и для определения возможного вклада дисульфидных связей в такую возможную четвертичную структуру. В некоторых вариантах изобретение относится к слитому белку связывающий домен-иммуноглобулин, который проявляет пониженную (т.е. статистически значимую по сравнению с соответствующим контролем, полученным из IgG) способность димеризоваться по сравнению с полипептидом шарнирной области человеческого иммуноглобулина G дикого типа, как указано в данном описании. Таким образом, специалисты в данной области смогут легко определить, проявляет ли конкретный слитый белок такую пониженную способность к димеризации.

Композиции и способы получения слитых белков иммуноглобулина хорошо известны в данной области, как описано, например, в патенте США No. 5892019, в котором заявлены рекомбинантные антитела, которые являются продуктами одного кодирующего полинуклеотида, но которые не являются слитыми белками связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению.

Для слитого белка иммуноглобулина согласно изобретению, который предназначен для применения на человеке, константные области обычно будут иметь происхождение из последовательностей человека, чтобы минимизировать возможный иммунный ответ против белков человека и обеспечить соответствующие эффекторные функции. Обработка последовательностей, кодирующих константные области антител, описана в заявке на выдачу патента PCT Morrison и Oi, WO 89/07142. В особенно предпочтительных вариантах домен CH1 делетирован, и карбоксильный конец связывающего домена или в случае, когда связывающий домен содержит два полипептида вариабельной области иммуноглобулина, вторая (т.е. более проксимальная по отношению к C-концу) вариабельная область связана с аминоконцом CH2 посредством шарнирной области. Схематичная диаграмма, на которой изображены структуры двух типичных слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, показана на фиг.11, при этом следует отметить, что в особенно предпочтительных вариантах межцепочечные дисульфидные связи отсутствуют, и в других вариантах может присутствовать ограниченное количество межцепочечных дисульфидных связей относительно количества таких связей, которые могли бы присутствовать, если бы вместо имеющихся были полипептиды шарнирной области дикого типа, и что в других вариантах слитый белок содержит мутантный полипептид шарнирной области, который проявляет пониженную способность димеризоваться по сравнению с полипептидом шарнирной области IgG дикого типа человека. Таким образом, выделенная молекула полинуклеотида кодирует одноцепочечный слитый белок иммуноглобулина, имеющий связывающий домен, который обеспечивает специфичную аффинность связывания выбранного антигена.

Как указано выше, в некоторых вариантах слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина, который может представлять собой полипептид вариабельной области легкой цепи или тяжелой цепи, и в некоторых вариантах слитый белок содержит, по меньшей мере, одну такую V-область легкой цепи и одну такую V-область тяжелой цепи и, по меньшей мере, один линкерный пептид, который слит с каждой V-областью. Конструирование таких связывающих доменов, например одноцепочечных Fv-доменов, хорошо известно в данной области и более подробно описано в примерах ниже и описано, например, в патенте США No. 5892019 и цитированных в указанном патенте ссылках; отбор и сборка одноцепочечных вариабельных областей и линкерных пептидов, которые могут быть слиты с каждой V-областью, полученной из тяжелой цепи и полученной из легкой цепи (например, чтобы создать связывающий домен, который содержит одноцепочечный Fv-полипептид), также известны в данной области и приведены в данном описании и, например, в патентах США No. 5869620, 4704692 и 4946778. В некоторых вариантах вся или часть последовательности иммуноглобулина, которая получена из источника, отличного от человека, может быть «гуманизирована» согласно известным способам создания гуманизированных антител, т.е. последовательностей иммуноглобулинов, в которые введены последовательности Ig человека, чтобы уменьшить степень, с которой иммунная система человека может воспринимать такие белки, как чужеродные (смотри, например, патенты США No. 5693762; 5585089; 4816567; 5225539; 5530101 и цитированные в данных патентах ссылки).

После конструирования слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, который приведен в данном описании, можно синтезировать ДНК, кодирующие полипептид, посредством синтеза олигонуклеотидов, как описано, например, в Sinha et al., Nucleic Acids Res., 12, 4539-4557 (1984); собрать с помощью ПЦР, как описано, например, в Innis, Ed., PCR Protocols, Academic Press (1990), а также в Better et al. J. Biol. Chem. 267, 16712-16118 (1992); клонировать и экспрессировать с помощью стандартных способов, как описано, например, в Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1989), а также в Robinson et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 2, 84-93 (1991); и тестировать в отношении специфичной антигенсвязывающей активности, как описано, например, в Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988) и Munson et al., Anal. Biochem., 107, 220-239 (1980).

Получение связывающих молекул Fv-области с одной полипептидной цепью, одноцепочечных Fv-молекул, описано в патенте США No. 4946778, который включен в данное описание в виде ссылки. В данном изобретении синтезируют одноцепочечные Fv-подобные молекулы путем кодирования первой вариабельной области тяжелой или легкой цепи, за которой следует один или более линкеров к вариабельной области соответствующей легкой или тяжелой цепи, соответственно. Выбор соответствующего линкера(ров) между двумя вариабельными областями описан в патенте США No. 4946778. Типичным приведенным в данном описании линкером является (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃. Линкер используют для превращения агрегированных в естественных условиях, но химически разделенных тяжелых и легких цепей в аминоконцевую антигенсвязывающую часть одной полипептидной цепи, при этом указанная антигенсвязывающая часть будет укладываться в структуру, подобную исходной структуре, образуемой двумя полипептидными цепями, и таким образом сохранять способность связываться с представляющим интерес антигеном. Нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, связанные последовательностью, кодирующей линкер, связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константные области антитела. Константными областями являются области, которые позволяют полученному в результате полипептиду образовывать межцепочечные дисульфидные связи, чтобы образовать димер, и которые обладают требуемыми эффекторными функциями, такими как способность опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Для подобной иммуноглобулину молекулы согласно изобретению, которая предназначена для применения на человеке, константные области обычно будут в значительной степени человеческими, чтобы минимизировать возможный иммунный ответ против белков человека и обеспечить разрешенные эффекторные функции. Обработка последовательностей, кодирующих константные области антитела, описана в заявке PCT Morrison and Oi, WO 89/07142, которая включена в данное описание в виде ссылки. В предпочтительных вариантах домен CH1 делетирован и карбоксильный конец второй вариабельной области связан с аминоконцом CH2 посредством шарнирной области. Остаток Cys шарнира, который образует дисульфидную связь с соответствующим Cys легкой цепи, удерживая тяжелую и легкую цепи нативной молекулы антитела, может быть делетирован или предпочтительно заменен, например, остатком Pro или тому подобным.

Как описано выше, данное изобретение относится к рекомбинантным экспрессирующим конструкциям, способным управлять экспрессией слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, которые представлены в данном описании. Аминокислоты, которые встречаются в различных указанных в данном описании аминокислотных последовательностях, идентифицированы в соответствии с хорошо известными трехбуквенными или однобуквенными сокращениями. Нуклеотиды, которые встречаются в различных упоминаемых в данном описании последовательностях ДНК или их фрагментах, указаны стандартными однобуквенными обозначениями, обычно используемыми в данной области. Приведенная аминокислотная последовательность также может охватывать сходные аминокислотные последовательности, имеющие только небольшие изменения, например, с целью иллюстрации и без ограничения, ковалентные химические модификации, вставки, делеции и замены, которые дополнительно могут включать консервативные замены. Аминокислотные последовательности, которые сходны друг с другом, могут иметь значительные области гомологии последовательностей. Подобным образом нуклеотидные последовательности могут охватывать в значительной степени сходные нуклеотидные последовательности, имеющие только небольшие изменения, например, в качестве иллюстрации и без ограничения, ковалентные химические модификации, вставки, делеции и замены, которые, кроме того, могут включать молчащие мутации вследствие вырожденности генетического кода. Нуклеотидные последовательности, которые сходны друг с другом, могут иметь значительные области гомологии последовательностей.

Наличие злокачественного состояния у субъекта относится к наличию диспластических, канцерогенных и/или трансформированных клеток у субъекта, включая, например, неопластические, опухолевые, контактно не ингибированные или онкогенно трансформированные клетки или тому подобное. Например, в предпочтительных вариантах, рассматриваемых в данном изобретении, такими раковыми клетками являются злокачественные гематопоэтические клетки, такие как трансформированные клетки лимфоидной линии и, в частности, B-клеточные лимфомы и тому подобное; раковыми клетками в некоторых предпочтительных вариантах также могут быть эпителиальные клетки, такие как клетки карциномы. В изобретении также рассматриваются B-клеточные нарушения, которые могут включать некоторые злокачественные состояния, которые затрагивают B-клетки (например, B-клеточная лимфома), но которые не следует считать ограниченными таким образом, и подразумевается, что они включают аутоиммунные заболевания и, в частности, заболевания, расстройства и состояния, которые характеризуются продукцией аутоантител.

Аутоантителами являются антитела, которые реагируют с собственными антигенами. Аутоантитела выявлены при нескольких аутоиммунных заболеваниях (т.е. заболевание, расстройство или состояние, при котором иммунная система хозяина вызывает нежелательные иммунные реакции, направленные против самого себя), при этом они вовлечены в активность заболевания. Современными средствами лечения указанных аутоиммунных заболеваний являются иммуносупрессирующие лекарственные средства, которые требуют непрерывного введения, не обладают специфичностью и вызывают значительные побочные эффекты. Новые подходы, которые могут исключить продукцию аутоантител при минимальной токсичности, будут направлены на неудовлетворенные потребности здравоохранения в отношении спектра заболеваний, которые поражают многих людей. Слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению предназначен для лучшего проникновения в лимфоидные ткани. Истощение популяции B-лимфоцитов прерывает цикл продукции аутоантител и позволяет иммунной системе восстановиться, так как новые B-лимфоциты продуцируются из предшественников в костном мозге.

Идентифицирован ряд заболеваний, при которых согласно неограничивающей теории предполагается целебное действие в результате терапии по истощению популяции B-клеток; краткое описание нескольких примеров указанных заболеваний приведено далее.

Аутоиммунное заболевание щитовидной железы включает болезнь Грейвса и тиреоидит Хашимото. Только в Соединенных Штатах проживает примерно 20 миллионов человек, у которых имеется какая-либо форма аутоиммунного заболевания щитовидной железы. Аутоиммунное заболевание щитовидной железы возникает из-за продукции аутоантител, которые либо стимулируют щитовидную железу, вызывая гипертиреоидизм (болезнь Грейвса), либо разрушают щитовидную железу, вызывая гипотиреоидизм (тиреоидит Хашимото). Стимуляцию щитовидной железы вызывают аутоантитела, которые связываются и активируют рецептор тиреотропина (TSH). Разрушение щитовидной железы вызывают аутоантитела, которые реагируют с другими антигенами щитовидной железы.

В настоящее время терапия болезни Грейвса включает хирургию, лечение радиоактивным йодом или противотиреоидными лекарственными средствами. Широко используют радиоактивный йод, так как противотиреоидные лекарственные средства обладают значительными побочными эффектами и высока вероятность рецидива заболевания. Хирургия предназначена для пациентов с крупным зобом или в случае, когда необходима очень быстрая нормализация функции щитовидной железы. Не существует способов терапии, мишенью которых является продукция аутоантител, ответственных за стимуляцию рецептора TSH. Современная терапия тиреоидита Хашимото использует левотероксин натрия, и терапия обычно осуществляется на протяжении жизни, вследствие малой вероятности ремиссии. Показана подавляющая терапия для уменьшения зоба при тиреоидите Хашимото, но не известны способы лечения, которые уменьшают продукцию аутоантител, чтобы целенаправленно поразить механизм заболевания.

Ревматоидный артрит (RA) является хроническим заболеванием, характеризующимся воспалением суставов, приводящим к опухоли, боли и потере функции. RA по оценкам поражает 2,5 миллиона человек в Соединенных Штатах. Причиной RA является комбинация событий, включая начальную инфекцию или повреждение, аномальный иммунный ответ и генетические факторы. Хотя при RA присутствуют аутореактивные T-клетки и B-клетки, для диагностики RA используют высокие уровни антител, которые собираются в суставах, называемых ревматоидным фактором. Современная терапия RA включает многие лекарственные средства для подавления боли и замедления прогрессирования заболевания. Не открыты способы терапии, которые могут излечивать заболевание. Лекарственные средства включают нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) и модифицирующие заболевание антиревматоидные лекарственные средства (DMARD). NSAID эффективны в начале заболевания, но не могут предотвращать прогрессирование разрушения сустава и болезненность при тяжелом RA. Как NSAID, так и DMARD связаны со значительными побочными эффектами. Только один новый DMARD, лефлюномид, был одобрен в течение 10 лет. Лефлюномид блокирует продукцию аутоантител, снижает воспаление и замедляет прогрессирование RA. Однако такое лекарственное средство также вызывает тяжелые побочные эффекты, включая тошноту, диарею, выпадение волос, сыпь и повреждение печени.

Системная красная волчанка (СКВ) является аутоиммунным заболеванием, вызванным рецидивирующими повреждениями кровеносных сосудов в различных органах, включая почки, кожу и суставы. СКВ поражает более 500000 человек в Соединенных Штатах. У пациентов с СКВ неправильное взаимодействие между T-клетками и B-клетками приводит к продукции аутоантител, которые атакуют клеточное ядро. Антитела включают антитела против двухцепочечной ДНК и анти-Sm-антитела. Примерно у половины пациентов с СКВ также выявляют аутоантитела, которые связывают фосфолипиды и ответственны за повреждение кровеносных сосудов и низкое количество клеток крови. Иммунные комплексы накапливаются в почках, кровеносных сосудах и суставах пациентов с СКВ, где они вызывают воспаление и повреждение ткани. Не обнаружены способы лечения СКВ, которые излечивают заболевание. Для терапии используют NSAID и DMARD в зависимости от тяжести заболевания. Плазмаферез с заменой плазмы для удаления аутоантител может вызвать временное улучшение у пациентов с СКВ. Общепринято, что за СКВ ответственны аутоантитела, таким образом, новые способы терапии, которые истощают B-клеточную линию, позволяя иммунной системе восстановиться, так как новые B-клетки образуются из предшественников, дают надежду на долговременное полезное действие у пациентов с СКВ.

Синдром Шегрена является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется разрушением увлажняющих желез. Синдром Шегрена является одним из наиболее преобладающих аутоиммунных заболеваний, поражающих до 4 миллионов человек в Соединенных Штатах. Примерно половина людей с синдромом Шегрена также имеют заболевание соединительной ткани, такое как ревматоидный артрит, тогда как другая половина имеет первичный синдром Шегрена без другого сопутствующего аутоиммунного заболевания. У пациентов с синдромом Шегрена часто присутствуют аутоантитела, включая антиядерные антитела, ревматоидный фактор, антифодрин и антитела против мускаринового рецептора. Обычная терапия включает кортикостероиды.

Иммунная тромбоцитопеническая пурпура (ITP) вызвана аутоантителами, которые связываются с тромбоцитами и вызывают их разрушение. Некоторые случаи ITP вызваны лекарственными средствами, а другие связаны с инфекцией, беременностью или аутоиммунным заболеванием, таким как СКВ. Примерно половину всех случаев идентифицируют как «идиопатические», что означает, что причина неизвестна. Лечение ITP определяют по тяжести симптомов. В некоторых случаях терапия не требуется. В большинстве случаев используют иммуносупрессирующие лекарственные средства, включая кортикостероиды или внутривенные инфузии иммуноглобулина, чтобы истощить популяцию T-клеток. Другим способом лечения, который обычно приводит к увеличению количества тромбоцитов, является удаление селезенки, органа, который разрушает покрытые антителами тромбоциты. Более эффективные иммуносупрессирующие лекарственные средства, включая циклоспорин, циклофосфамид или азатиоприн, используют для пациентов в тяжелых случаях. Удаление аутоантител с помощью пропускания плазмы пациента через колонку с белком A используют в качестве второй линии лечения пациентов с тяжелой формой заболевания.

Рассеянный склероз (MS) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется воспалением центральной нервной системы и деструкцией миелина, который изолирует волокна нервных клеток в головном мозге, спинном мозге и в теле. Хотя причина MS неизвестна, широко распространено мнение, что первичный вклад в патогенез заболевания вносят аутоиммунные T-клетки. Однако в спинномозговой жидкости пациентов с MS присутствуют высокие уровни антител, и некоторые теории прогнозируют, что B-клеточный ответ, приводящий к продукции антител, является важным для опосредования заболевания. Не разработаны способы лечения пациентов с MS на основе истощения B-клеток. MS неизлечим. Современная терапия представляет собой кортикостероиды, которые могут уменьшать продолжительность и тяжесть приступов, но не влияют на течение MS во времени. Недавно одобрены новые способы лечения MS биотехнологически полученным интерфероном (IFN).

Миастения (MG) является хроническим аутоиммунным нейромышечным заболеванием, которое характеризуется слабостью группы произвольных мышц. MG поражает примерно 40000 человек в Соединенных Штатах. MG вызвана аутоантителами, которые связываются с рецепторами ацетилхолина, экспрессированными на нервно-мышечных соединениях. Аутоантитела уменьшают количество или блокируют ацетилхолиновые рецепторы, предотвращая передачу сигналов из нервов в мышцы. MG неизлечим. Обычные способы лечения включают иммуносупрессию кортикостероидами, циклоспорином, циклофосфамидом или азатиоприном. Хирургическое удаление тимуса часто используют, чтобы притупить аутоиммунный ответ. Плазмаферез, используемый для снижения уровней антител в крови, эффективен при MG, но кратковременно, поскольку продукция аутоантител продолжается. Плазмаферез обычно назначают при тяжелой мышечной слабости перед операцией.

Псориаз поражает примерно пять миллионов человек. Аутоиммунное воспаление в коже. Псориаз связан с артритом в 30% случаев (псориазный артрит). Много способов терапии, включая стероиды, УФ-излучение, ретиноиды, производные витамина D, циклоспорин, метотрексат.

Склеродерма является хроническим аутоиммунным заболеванием соединительной ткани, которое также известно, как системный склероз. Склеродерма характеризуется сверхпродукцией коллагена, приводящей к утолщению кожи. Примерно 300000 человек в Соединенных Штатах имеют склеродерму.

Воспалительные заболевания кишечника, включая болезнь Крона и язвенный колит, являются аутоиммунными заболеваниями пищеварительной системы.

Данное изобретение, кроме того, относится к конструкциям, кодирующим слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, и, в частности, к способам введения рекомбинантных конструкций, кодирующих такие белки, которые могут быть экспрессированы, например, в виде фрагментов, аналогов и производных таких полипептидов. Термины «фрагмент», «производное» или «аналог» при ссылке на слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин относятся к любому слитому полипептиду или слитому белку связывающий домен-иммуноглобулин, который сохраняет по существу такую же биологическую функцию или активность, как и такой полипептид. Таким образом, аналог включает белок-предшественник, который может быть активирован отщеплением части белка-предшественника с получением активного слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин.

Фрагментом, производным или аналогом слитого полипептида или слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, включая слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемые приведенными в данном описании ДНК, может быть (i) фрагмент, производное или аналог, в котором один или более аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может кодироваться или не кодироваться с помощью генетического кода, или (ii) фрагмент, производное или аналог, в котором один или более аминокислотных остатков включают замещающую группу, или (iii) фрагмент, производное или аналог, в котором дополнительные аминокислоты слиты со слитым полипептидом связывающий домен-иммуноглобулин, включая аминокислоты, которые используют для выявления или специфичного функционального изменения последовательности слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин или последовательности пробелка. Считается, что такие фрагменты, производные и аналоги понятны специалистам в данной области, исходя из инструкций, приведенных в данном описании.

Полипептиды согласно данному изобретению включают слитые полипептиды и слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, имеющие аминокислотные последовательности полипептида связывающего домена, которые идентичны или сходны с последовательностями, известными в данной области, или их фрагментами или частями. Например, в качестве иллюстрации и без ограничения внеклеточный домен молекулы CD154 человека предполагают использовать согласно данному изобретению, также как полипептиды, обладающие, по меньшей мере, 70% сходством (предпочтительно 70% идентичностью) и более предпочтительно 90% сходством (более предпочтительно 90% идентичностью) с указанным полипептидом и еще более предпочтительно 95% сходством (еще более предпочтительно 95% идентичностью) с указанными полипептидами и частями таких полипептидов, при этом такие части слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин обычно содержат, по меньшей мере, 30 аминокислот и более предпочтительно, по меньшей мере, 50 аминокислот.

Как известно в данной области «сходство» между двумя полипептидами определяют сравнением аминокислотной последовательности и консервативных аминокислотных замен в последовательности полипептида с последовательностью второго полипептида. Фрагменты или части нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды согласно данному изобретению, можно использовать для того, чтобы синтезировать полноразмерные нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению. В используемом в данном описании смысле «% идентичности» относится к проценту идентичных аминокислот, расположенных в соответствующих положениях остатков аминокислот при сопоставлении двух или более полипептидов или анализом их последовательности с использованием алгоритма BLAST для пробелов (например, Altschul et al., 1997 Nucl. Ac. Res. 25: 3389), который присваивает весовые коэффициенты пробелам в последовательности и ошибочным спариваниям в последовательности в соответствии с коэффициентами взвешивания по умолчанию, предоставляемыми в базе данных National Institutes of Health/NCBI (Bethesda, MD; смотри www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast).

Термин «выделенный» означает, что материал извлечен из своего исходного окружения (например, природного окружения, если оно является веществом природного происхождения). Например, нуклеиновая кислота или полипептид природного происхождения, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но та же самая нуклеиновая кислота или полипептид, отделенные от некоторых или всех совместно существующих в природной системе веществ, являются выделенными. Такие нуклеиновые кислоты могут быть частью вектора и/или такие нуклеиновые кислоты или полипептиды могут быть частью композиции и быть выделенными, так как такой вектор или композиция не являются частью его природного окружения.

Термин «ген» означает участок ДНК, участвующий в продуцировании полипептидной цепи; он включает области, предшествующие и следующие за кодирующей областью, «лидер и концевую часть», а также вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими участками (экзонами).

Как обсуждается в данном описании, изобретение относится к слитым белкам связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемым нуклеиновыми кислотами, которые имеют последовательность, кодирующую связывающий домен, слитую в рамке с дополнительной последовательностью, кодирующей домен иммуноглобулина, чтобы обеспечить экспрессию полипептидной последовательности связывающего домена, слитой с дополнительной функциональной полипептидной последовательностью, которая делает возможным, например, в качестве иллюстрации и без ограничения регистрацию, функциональное изменение, выделение и/или очистку слитого белка. Такие слитые белки могут обеспечивать возможность функционального изменения связывающего домена благодаря содержанию дополнительных полученных из иммуноглобулина полипептидных последовательностей, которые влияют на поведение слитого продукта, например (и как описано выше) за счет снижения доступности сульфгидрильных групп для участия в образовании дисульфидных связей и за счет придания способности усиливать ADCC и/или CDC.

Модификацию полипептида можно осуществить любым способом, известным специалистам в данной области. Предпочтительные способы согласно данному изобретению основаны на модификации ДНК, кодирующей слитый белок, и экспрессии модифицированной ДНК. ДНК, кодирующую одно из обсуждавшихся выше слияний связывающий домен-иммуноглобулин можно подвергнуть мутагенезу с использованием стандартных методик, включая методики, описанные далее. Например, остатки цистеина, которые в противном случае могут способствовать образованию мультимера или поддерживать особые конформации молекулы, можно делетировать из полипептида или заменить, например, остатки цистеина, которые ответственны за образование агрегатов. При необходимости остатки цистеина, которые вносят вклад в образование агрегатов, можно идентифицировать эмпирически путем делетирования и/или замены остатка цистеина и выяснения того, агрегирует ли полученный в результате белок в растворах, содержащих физиологически приемлемые буферы и соли. Кроме того, можно сконструировать и использовать фрагменты слияний связывающий домен-иммуноглобулин. Как указано выше, описаны контррецептор/связывающие домены лиганда для многих потенциальных слияний связывающий домен-иммуноглобулин, так что специалист в данной области легко может выбрать соответствующие полипептидные домены для включения в кодируемые продукты данных экспрессирующих конструкций.

Консервативные замены аминокислот хорошо известны и могут быть осуществлены, как правило, без изменения биологической активности полученной в результате молекулы слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин. Например, такие замены, как правило, осуществляют посредством взаимной замены в группе полярных остатков, заряженных остатков, гидрофобных остатков, небольших остатков и тому подобных. При необходимости такие замены можно определить эмпирически только путем тестирования полученного в результате модифицированного белка по способности связываться с соответствующими рецепторами клеточной поверхности в биологических анализах in vitro или связываться с соответствующими антигенами или требуемыми молекулами-мишенями.

Данное изобретение, кроме того, относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются с последовательностями полинуклеотидов, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, которые приведены в данном описании, или с комплементарными им последовательностями, что без труда будет понятно специалисту в данной области, если между последовательностями имеется, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 90% и более предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичность. Данное изобретение, в частности, относится к нуклеиновым кислотам, которые в условиях высокой жесткости гибридизуются с приведенными в данном описании нуклеиновыми кислотами, кодирующими слияние связывающий домен-иммуноглобулин. В используемом в данном описании смысле термин «условия высокой жесткости» означает, что гибридизация будет проходить только в том случае, если существует, по меньшей мере, 95% и предпочтительно, по меньшей мере, 97% идентичность между последовательностями. Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с приведенными в данном описании нуклеиновыми кислотами, кодирующими слияние связывающий домен-иммуноглобулин, в предпочтительных вариантах кодируют полипептиды, которые сохраняют по существу такую же биологическую функцию или активность, что и слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемые ДНК, указанными в цитированных в данном описании ссылках.

В используемом в данном описании смысле термин «гибридизоваться» в условиях определенной жесткости используют для описания стабильности гибридов, образованных между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот. Жесткость гибридизации обычно выражают в виде условий ионной силы и температуры, при которых отжигают и промывают гибриды. Обычно «высокая», «умеренная» и «низкая» жесткость охватывает следующие условия или эквивалентные им условия: высокая жесткость: 0,1 x SSPE или SSC, 0,1% SDS, 65°C; умеренная жесткость: 0,2 x SSPE или SSC, 0,1% SDS, 50°C; и низкая жесткость: 1,0 x SSPE или SSC, 0,1% SDS, 50°C. Как известно специалистам в данной области, изменения жесткости условий гибридизации можно достичь путем изменения времени, температуры и/или концентрации растворов, используемых для стадий предварительной гибридизации, гибридизации и промывки, и подходящие условия также могут отчасти зависеть от конкретных нуклеотидных последовательностей используемого зонда и блотированного образца исходной нуклеиновой кислоты. Таким образом, будет понятно, что подходящие условия жесткости легко можно выбрать без чрезмерного экспериментирования в том случае, если указана требуемая избирательность зонда, на основании его способности гибридизоваться с одной или более определенными исходными последовательностями и при этом не гибридизоваться с определенными другими исходными последовательностями.

Нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению, также называемые в данном описании полинуклеотидами, могут быть в форме РНК или в форме ДНК, и ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и в случае одноцепочечной ДНК может быть кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. Кодирующая последовательность, которая кодирует слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин для применения согласно данному изобретению, может быть идентична кодирующей последовательности, известной в данной области, для любого данного слияния связывающий домен-иммуноглобулин или может представлять собой другую кодирующую последовательность, которая в результате избыточности или вырожденности генетического кода кодирует тот же самый слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин.

Нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин для применения согласно изобретению, могут включать, но не ограничены указанным: только кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин; кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин и дополнительную кодирующую последовательность; кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин (и необязательно дополнительную кодирующую последовательность) и некодирующую последовательность, такую как интроны или некодирующие последовательности с 5'- и/или 3'-стороны кодирующей последовательности слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин, которые, например, могут дополнительно включать, но не ограничены указанным, одну или более регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, которые могут представлять собой регулирующий или регулируемый промотор, энхансер, другую последовательность регуляции транскрипции, последовательность, связывающую репрессор, последовательность регуляции трансляции или любую другую регуляторную последовательность нуклеиновой кислоты. Таким образом, термин «нуклеиновая кислота, кодирующая» или «полинуклеотид, кодирующий» слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, охватывает нуклеиновую кислоту, которая включает только кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин, а также нуклеиновую кислоту, которая включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность(ти).

Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды для приведенного в данном описании применения можно синтезировать любым способом, известным специалистам в данной области (смотри, например, WO 93/01286, заявку на выдачу патента США с регистрационным No. 07/723454; патент США No. 5218088; патент США No. 5175269; патент США No. 5109124). Идентификация олигонуклеотидов и последовательностей нуклеиновых кислот для применения в данном изобретении включает способы, хорошо известные в данной области. Например, требуемые свойства, длины и другие характеристики применимых олигонуклеотидов хорошо известны. В некоторых вариантах могут быть сконструированы синтетические олигонуклеотиды и последовательности нуклеиновых кислот, которые устойчивы к деградации эндогенными нуклеолитическими ферментами клетки-хозяина за счет наличия таких связей, как: фосфоротиоатные, метилфосфонатные, сульфоновые, сульфатные, кетильные, фосфородитиоатные, фосфоамидные, сложные фосфорноэфирные и другие такие связи, для которых показано, что они пригодны для применений в качестве антисмысловых (смотри, например, Agrwal et al., Tetrаhedron Lett. 28: 3539-3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrаhedron Lett. 26: 2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12: 4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40: 137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54: 367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14: 97-100 (1989); Stein в: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp.97-117 (1989); Jager et al., Biochemistry 27: 7237-7246 (1988)).

В одном варианте данное изобретение относится к укороченным компонентам (например, полипептиду связывающего домена, полипептиду шарнирной области, линкеру и т.д.) для применения в слитом белке связывающий домен-иммуноглобулин, и в другом варианте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, имеющий такие укороченные компоненты. Укороченной молекулой может быть любая молекула, которая содержит версию молекулы, которая меньше, чем полноразмерная. Укороченные молекулы, представленные в данном изобретении, могут включать укороченные биологические полимеры и в предпочтительных вариантах изобретения такими укороченными молекулами могут быть укороченные молекулы нуклеиновых кислот или укороченные полипептиды. Укороченные молекулы нуклеиновых кислот имеют нуклеотидную последовательность, которая короче полноразмерной последовательности известной или описанной молекулы нуклеиновой кислоты, при этом такая известная или описанная молекула нуклеиновой кислоты может быть природного происхождения, синтетической или рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты при условии, что специалист в данной области может расценивать ее как полноразмерную молекулу. Таким образом, например, укороченные молекулы нуклеиновой кислоты, которые соответствуют последовательности гена, содержат меньше полной длины гена, где ген содержит кодирующие и некодирующие последовательности, промоторы, энхансеры и другие регуляторные последовательности, фланкирующие последовательности и тому подобные, и другие функциональные и нефункциональные последовательности, которые считают частью гена. В другом примере укороченные молекулы нуклеиновой кислоты, которые соответствуют последовательности мРНК, содержат меньше полной длины транскрипта мРНК, который может включать различные транслируемые и нетранслируемые области, а также другие функциональные и нефункциональные последовательности.

В других предпочтительных вариантах укороченными молекулами являются полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность более короткую, чем полная последовательность конкретного белка или полипептидного компонента. В используемом в данном описании смысле «делеция» имеет свое общепринятое значение, которое понятно специалисту в данной области и может относиться к молекулам, в которых отсутствует одна или более частей последовательности либо из концевой, либо из неконцевой области по сравнению с соответствующей молекулой полной длины, например, как в случае приведенных в данном описании укороченных молекул. Укороченные молекулы, которые являются линейными биологическими полимерами, такие как молекулы нуклеиновых кислот или полипептиды, могут иметь одну или более делеций либо в концевой области молекулы, либо делеций в неконцевой области молекулы, при этом такие делеции могут быть делециями 1-1500 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидных или аминокислотных остатков, предпочтительно 1-500 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидных или аминокислотных остатков и более предпочтительно 1-300 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидных или аминокислотных остатков. В некоторых особенно предпочтительных вариантах укороченные молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь делецию 270-330 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов. В некоторых других особенно предпочтительных вариантах укороченные молекулы полипептидов могут иметь делецию 80-140 непрерывно следующих друг за другом аминокислот.

Данное изобретение, кроме того, относится к вариантам указанных в данном описании нуклеиновых кислот, которые кодируют фрагменты, аналоги и/или производные слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин. Варианты нуклеиновых кислот, кодирующих слияние связывающий домен-иммуноглобулин, могут быть аллельными вариантами нуклеиновых кислот природного происхождения или вариантами неприродного происхождения. Как известно, в данной области аллельный вариант представляет собой альтернативную форму последовательности нуклеиновой кислоты, которая может иметь, по меньшей мере, одну замену, делецию или присоединение одного или более нуклеотидов, любой из которых существенно не изменяет функцию кодируемого слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин.

Вариант и производные слияния связывающий домен-иммуноглобулин можно получить посредством мутаций нуклеотидных последовательностей, кодирующих слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин. Изменения нативной аминокислотной последовательности можно осуществить любым из ряда стандартных способов. Мутации можно ввести в конкретные локусы путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, обеспечивающими лигирование с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная в результате реконструированная последовательность кодирует аналог, имеющий требуемую вставку, замену или делецию аминокислоты.

Альтернативно можно использовать сайт-специфичный мутагенез на основе олигонуклеотидов, чтобы получить измененный ген, в котором предварительно определенные кодоны можно изменить путем замены, делеции или вставки. Типичные способы осуществления таких изменений описаны Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering. Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987) и в патентах США No. 4518584 и 4737462.

В качестве примера модификацию ДНК можно осуществить с помощью сайт-специфичного мутагенеза ДНК, кодирующей белок, наряду с применением способов ДНК-амплификации с использованием праймеров, чтобы ввести и амплифицировать изменения в ДНК-матрице, таких как сплайсинг путем удлинения перекрывающихся участков с помощью ПЦР (SOE). Сайт-специфичный мутагенез обычно осуществляют с использованием фагового вектора, который имеет одно- и двухцепочечные формы, такого как векторы на основе фага M13, которые хорошо известны и коммерчески доступны. Можно использовать другие подходящие векторы, которые содержат начало репликации одноцепочечного фага (смотри, например, Veira et al., Meth. Enzymol. 15: 3, 1987). В общем, сайт-специфичный мутагенез выполняют путем получения одноцепочечного вектора, который кодирует представляющий интерес белок (например, весь или часть компонента данного слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин). Олигонуклеотидный праймер, который содержит требуемую мутацию в области гомологии с ДНК в одноцепочечном векторе, отжигают с вектором с последующим добавлением ДНК-полимеразы, такой как ДНК-полимераза I E.coli (фрагмент Кленова), которая использует двухцепочечную область в качестве праймера для получения гетеродуплекса, в котором одна цепь кодирует измененную последовательность, а другая - исходную последовательность. Гетеродуплекс вводят в соответствующие бактериальные клетки и отбирают клоны, которые содержат требуемую мутацию. Полученные в результате измененные молекулы ДНК можно рекомбинантно экспрессировать в соответствующих клетках-хозяевах, чтобы получить модифицированный белок.

Данное изобретение также охватывает эквивалентные ДНК-конструкции, которые кодируют различные добавления или замены аминокислотных остатков или последовательностей, или делеции концевых или внутренних остатков или последовательностей, которые не нужны для биологической активности. Например, и как обсуждалось выше, последовательности, кодирующие остатки Cys, которые не желательны или не являются существенными для биологической активности, можно изменить на основе делеции остатков Cys или замены другими аминокислотами, предотвращая образование неподходящих внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации.

Организмы-хозяева включают такие организмы, в которых может осуществляться рекомбинантная продукция слитых продуктов связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемых рекомбинантными конструкциями согласно данному изобретению, такие как бактерии (например, E.coli), дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris), клетки насекомых и млекопитающие, включая экспрессию in vitro и in vivo. Таким образом, организмы-хозяева могут включать организмы для конструирования, размножения, экспрессии или других стадий продукции вакцин, приведенных в данном описании; хозяева также включают субъекты, у которых имеют место иммунные ответы, которые описаны выше. В настоящее время предпочтительными организмами-хозяевами являются бактериальные штаммы E.coli, инбредные линии мышей и линии клеток мышей, и клетки человека, в организме и в виде линий клеток.

Конструкцию ДНК, кодирующую требуемое слияние связывающий домен-иммуноглобулин, вводят в плазмиду для экспрессии в соответствующем хозяине. В предпочтительных вариантах хозяином является бактериальный хозяин. Последовательность, кодирующую лиганд или связывающий домен нуклеиновой кислоты, предпочтительно оптимизируют в отношении кодонов для экспрессии в конкретном хозяине. Таким образом, если, например, слияние связывающий домен-иммуноглобулин человека экспрессируют в бактериях, то кодоны можно оптимизировать для использования бактериями. В случае небольших кодирующих областей ген можно синтезировать в виде отдельного олигонуклеотида. Для более крупных белков можно использовать сплайсинг различных олигонуклеотидов, мутагенез или другие способы, известные специалистам в данной области. Последовательности нуклеотидов в плазмидах, которые являются регуляторными областями, такие как промоторы и операторы, функционально связывают друг с другом для транскрипции. Последовательность нуклеотидов, кодирующая слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, также может включать ДНК, кодирующую сигнал секреции, при этом полученный в результате пептид является белком-предшественником. Полученный в результате процессированный белок можно извлечь из периплазматического пространства или среды для ферментации.

В предпочтительных вариантах плазмиды ДНК также содержат последовательность терминации транскрипции. В используемом в данном описании смысле «область терминации транскрипции» является последовательностью, которая сигнализирует о терминации транскрипции. Полный терминатор транскрипции можно получить из гена, кодирующего белок, который может быть тем же самым или может отличаться от встроенного гена, кодирующего слияние связывающий домен-иммуноглобулин, или от источника промотора. Терминаторы транскрипции являются необязательными компонентами экспрессирующих систем согласно изобретению, но используются в предпочтительных вариантах.

Используемые в данном изобретении плазмиды включают промотор в фунциональной связи с ДНК, кодирующей представляющий интерес белок или полипептид, и предназначены для экспрессии белков в подходящем хозяине, который описан выше (например, бактерии, мыши или человеке), в зависимости от требуемого применения плазмиды (например, введение вакцины, содержащей последовательности, кодирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин). Подходящие промоторы для экспрессии белков и полипептидов согласно изобретению широко доступны и хорошо известны в данной области. Предпочтительны индуцируемые промоторы или конститутивные промоторы, которые связаны с регуляторными областями. Такие промоторы включают, но не ограничены указанным, промотор фага T7 и другие фаговые промоторы, подобные T7, такие как промоторы T3, T5 и SP6, промоторы trp, lpp и lac, такие как lacUV5, из E.coli; P10 или промотор гена полиэдрина экспрессирующей системы бакуловирус/клетка насекомого (смотри, например, патенты США No. 5243041, 5242687, 5266317, 4745051 и 5169784) и индуцируемые промоторы других эукариотических экспрессирующих систем. Для экспрессии белков такие промоторы встраивают в плазмиду в функциональной связи с регуляторной областью, такой как lac-оперон.

Предпочтительные области промоторов представляют собой области, которые являются индуцируемыми и функциональными в E.coli. Примеры подходящих индуцируемых промоторов и промоторных областей включают, но не ограничены указанным: оператор lac E.coli, отвечающий на изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG; смотри Nakamura et al., Cell 18: 1109-1117, 1979); регулируемые металлами элементы промотора металлотионеина, отвечающие на индукцию тяжелым металлом (например, цинк) (смотри, например, патент США No. 4870009, Evans et al.); промотор фага T7lac, отвечающий на IPTG (смотри, например патент США No. 4952496 и Studier et al., Meth. Enzymol. 185: 60-89, 1990) и промотор TAC.

Плазмиды могут необязательно включать ген или гены селектируемого маркера, которые функциональны в хозяине. Ген селектируемого маркера включает любой ген, который определяет фенотип бактериям, который позволяет идентифицировать и избирательно выращивать трансформированные бактериальные клетки среди подавляющего большинства нетрансформированных клеток. Подходящие гены селектируемого маркера для бактериальных хозяев, например, включают ген резистентности к ампициллину (Amp^r), ген резистентности к тетрациклину (Tc^r) и ген резистентности к канамицину (Kan^r). В настоящее время предпочтительным является ген резистентности к канамицину.

Плазмиды также могут включать ДНК, кодирующую сигнал секреции, функционально связанного белка. Подходящие для применения сигналы секреции широко доступны и хорошо известны в данной области. Можно использовать прокариотические и эукариотические сигналы секреции, функциональные в E.coli. Предпочтительные в настоящее время сигналы секреции включают, но не ограничены указанным, сигналы, кодируемые следующими генами E.coli: ompA, ompT, ompF, ompC, бета-лактамазы и щелочной фосфатазы, и тому подобными (von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985). Кроме того, можно использовать сигнал секреции бактериального гена pelB (Lei et al., J. Bacteriol. 169: 4379, 1987), сигнал секреции phoA и cek2, функциональный в клетке насекомого. Наиболее предпочтительным сигналом секреции является сигнал секреции ompA E.coli. Также можно использовать другие прокариотические и эукариотические сигналы секреции, известные специалистам в данной области (смотри, например, von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985). Используя способы, приведенные в данном описании, специалист в данной области может манипулировать сигналами секреции, которые являются функциональными либо в дрожжевых клетках, клетках насекомых, либо в клетках млекопитающих, чтобы секретировать белки из указанных клеток.

Предпочтительные плазмиды для трансформации клеток E.coli включают экспрессирующие векторы pET (например, pET-11a, pET-12a-c, pET-15b; смотри патент США No. 4952496; доступные из Novagen, Madison, WI). Другие предпочтительные плазмиды включают плазмиды pKK, в частности pKK 223-3, которая содержит промотор tac (Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6929, 1984; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; патенты США No. 5122463, 5173403, 5187153, 5204254, 5212058, 5212286, 5215907, 5220013, 5223483 и 5229279). Плазмиду pKK модифицировали заменой гена устойчивости к ампициллину геном устойчивости к канамицину (доступна из Pharmacia; получена из pUC4K, смотри, например, Vieira et al. (Gene 19: 259-268, 1982; и патент США No. 4719179). Бакуловирусные векторы, такие как pBlueBac (также называемый pJVETL и его производные), в частности, pBlueBac III (смотри, например, патенты США No. 5278050, 5244805, 5243041, 5242687, 5266317, 4745051 и 5169784; доступен из Invitrogen, San Diego) также можно использовать для экспрессии полипептидов в клетках насекомых. Другие плазмиды включают плазмиды pIN-IIIompA (смотри патент США No. 4575013; смотри также Duffaud et al., Meth. Enz. 153: 492-507, 1987), такие как pIN-IIIompA2.

Предпочтительно молекула ДНК реплицируется в бактериальных клетках, предпочтительно в E.coli. Предпочтительная молекула ДНК также включает бактериальное начало репликации, чтобы обеспечить сохранение молекулы ДНК в бактериях из поколения в поколение. Таким образом, можно получить большие количества молекулы ДНК путем репликации в бактериях. Предпочтительные бактериальные начала репликации включают, но не ограничены указанным, начала репликации fl-ori и col E1. Предпочтительные хозяева содержат хромосомные копии ДНК, кодирующей РНК-полимеразу T7, функционально связанные с индуцируемым промотором, таким как промотор lacUV (смотри патент США No. 4952496). Такие хозяева включают, но не ограничены указанным, лизогенные штаммы E.coli HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) и BL21(DE3). Предпочтительным является штамм BL21(DE3). Штаммы pLys дают низкие уровни лизоцима T7, природного ингибитора РНК-полимеразы T7.

Представленные молекулы ДНК также могут содержать ген, кодирующий белок-репрессор. Белок-репрессор способен репрессировать транскрипцию с промотора, который содержит последовательности нуклеотидов, с которыми связывается белок-репрессор. Промотор может быть дерепрессирован путем изменения физиологических условий в клетке. Например, изменение можно осуществить путем добавления в среду роста молекулы, которая ингибирует способность взаимодействовать с оператором или с регуляторными белками или другими областями ДНК, или путем изменения температуры ростовых сред. Предпочтительные белки-репрессоры включают, но не ограничены указанным, репрессор lacI E.coli, чувствительный к индукции IPTG, чувствительный к температуре репрессор λ cI857, и тому подобные. Предпочтительным является репрессор lacI E.coli.

В общем, рекомбинантные конструкции согласно данному изобретению также будут содержать элементы, необходимые для транскрипции и трансляции. В частности, такие элементы предпочтительны в тех случаях, когда рекомбинантная экспрессирующая конструкция, содержащая последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, предназначена для экспрессии в клетке-хозяине или организме. В некоторых вариантах данного изобретения предпочтительную для типа клеток или специфичную для типа клеток экспрессию гена, кодирующего слияние связывающий домен-иммуноглобулин, можно достичь, помещая ген под контроль промотора. Выбор промотора будет зависеть от типа клеток, которые необходимо трансформировать, и степени или типа требуемого контроля. Промоторы могут быть конститутивными или активными и могут, кроме того, быть специфичными для типа клеток, тканеспецифичными, специфичными для отдельных клеток, специфичными для события, временно специфичными или индуцируемыми. Предпочтительными являются промоторы, специфичные для типа клеток, и промоторы, специфичные для определенного события. Примеры конститутивных или неспецифичных промоторов включают ранний промотор SV40 (патент США No. 5118627), поздний промотор SV40 (патент США No. 5118627), промотор раннего гена CMV (патент США No. 5168062) и аденовирусный промотор. Кроме вирусных промоторов в контексте данного изобретения также применимы клеточные промоторы. В частности, применимы клеточные промоторы так называемых генов домашнего хозяйства. Предпочтительны вирусные промоторы, так как, как правило, они являются более сильными промоторами, чем клеточные промоторы. Промоторные области идентифицированы в генах многих эукариот, включая высших эукариот, так что специалисты в данной области легко могут выбрать подходящие промоторы для применения в конкретном хозяине.

Также можно использовать индуцируемые промоторы. Указанные промоторы включают LTR MMTV (PCT WO 91/13160), индуцируемый дексаметазоном; промотор металлотионеина, индуцируемый тяжелыми металлами; и промоторы с элементами ответа на цАМФ, индуцируемые цАМФ. При использовании индуцируемого промотора последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, может быть доставлена в клетку с помощью экспрессирующей конструкции согласно данному изобретению, и она может находиться в покое вплоть до добавления индуктора. Это обеспечивает контроль времени выработки генного продукта.

Специфичные для события промоторы активны или стимулируются только в том случае, когда происходит определенное событие, такое как образование опухоли или вирусная инфекция. LTR HIV является хорошо известным примером промотора, специфичного для события. Промотор неактивен, если не присутствует продукт гена tat, который появляется при вирусной инфекции. Некоторые промоторы, специфичные для определенного события, также являются тканеспецифичными.

Кроме того, можно использовать промоторы, регуляция которых осуществляется согласованно с конкретным клеточным геном. Например, промоторы генов, которые экспрессируются согласованно, можно использовать в том случае, когда необходима экспрессия конкретного гена, кодирующего слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, вместе с экспрессией одного или более дополнительных эндогенных или введенных экзогенно генов. Указанный тип промотора особенно пригоден в том случае, когда известен характер экспрессии гена, относящейся к индукции иммунного ответа в конкретной ткани иммунной системы, с тем чтобы можно было активировать или другим образом привлечь специфичные иммунокомпетентные клетки в такой ткани к участию в иммунном ответе.

Кроме промотора, могут быть встроены репрессирующие последовательности, негативные регуляторы или тканеспецифичные сайленсеры, чтобы уменьшить неспецифичную экспрессию генов, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, в определенных ситуациях, таких как, например, ситуация, когда у хозяина временно ослабляют иммунитет, что является частью методики лечения. В промоторную область можно встроить различные репрессирующие элементы. Репрессия транскрипции не зависит от ориентации репрессирующих элементов или расстояния от промотора. Одним из типов репрессирующей последовательности является последовательность инсулятора. Такие последовательности ингибируют транскрипцию (Dunaway et al., Mol. Cell. Biol. 17: 182-9, 1997; Gdula et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9378-83, 1996, Chan et al., J. Virol. 70: 5312-28, 1996; Scott and Geyer, EMBO J. 14: 6258-67, 1995; Kalos and Fournier, Mol. Cell. Biol. 15: 198-207, 1995; Chung et al., Cell 74: 505-14, 1993) и будут подавлять фоновую транскрипцию.

Репрессирующие элементы также идентифицированы в промоторных областях генов коллагена типа II (хряща), холинацетилтрансферазы, альбумина (Hu et al., J. Cell Growth Differ. 3(9): 577-588, 1992), фосфоглицераткиназы (PGK-2) (Misuno et al., Gene 119 (2): 293-297, 1992) и в гене 6-фосфофрукто-2-киназы/фруктоза-2,6-бифосфатазы (Lemaigre et al., Mol. Cell Biol. 11 (2): 1099-1106). Кроме того, идентифицирован негативный регуляторный элемент Tse-1 в ряде генов, специфичных для печени, и было показано, что он блокирует индукцию активации гена в гепатоцитах, опосредованную элементом ответа на цАМФ (CRE) (Boshart et al., Cell 61 (5): 905-916, 1990).

В предпочтительных вариантах в конструкцию включают элементы, которые увеличивают экспрессию требуемого продукта. Такие элементы включают внутренние сайты связывания рибосомы (IRES; Wang and Siddiqui, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203: 99, 1995; Ehrenfeld and Semler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203: 65, 1995; Rees et al., Biotechniques 20: 102, 1996; Sugimoto et al., Biotechnology 12: 694, 1994). IRES повышают эффективность трансляции. Другие последовательности также могут усиливать экспрессию. В случае некоторых генов последовательности особенно на 5'-конце ингибируют транскрипцию и/или трансляцию. Указанные последовательности обычно представляют собой палиндромы, которые могут образовать структуры шпилек. Как правило, любые такие последовательности в нуклеиновой кислоте, которую необходимо доставить, делетируют. Чтобы подтвердить или выяснить, какие последовательности влияют на экспрессию, анализируют уровни экспрессии транскрипта или транслированного продукта. Уровни транскрипта можно анализировать любым известным способом, включая Нозерн-блот-гибридизацию, защиту зонда от РНКазы и тому подобное. Уровни белка можно анализировать любым известным способом, включая ELISA, Вестерн-блот, иммуноцитохимию или другие хорошо известные способы.

В конструкции, кодирующие слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, согласно данному изобретению можно включить другие элементы. В предпочтительных вариантах конструкция содержит последовательность терминации транскрипции, включая последовательность полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга и энхансер. Также можно включать другие элементы, пригодные для экспрессии и поддержания конструкции в клетках млекопитающих или других эукариотических клетках (например, начало репликации). Так как конструкции обычно получают в бактериальных клетках, включают элементы, которые являются необходимыми или которые усиливают воспроизведение в бактериях. Такие элементы включают начало репликации, селектируемый маркер и тому подобное.

Как показано в данном описании, можно обеспечить дополнительный уровень регуляции экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, доставляемых в клетки с помощью конструкций согласно изобретению, путем одновременной доставки двух или более дифференцированно регулируемых конструкций нуклеиновых кислот. Использование такого подхода на основе различных конструкций нуклеиновых кислот может обеспечить возможность координированной регуляции иммунного ответа, такой, например, как пространственно-временная координация, которая зависит от типа клеток и/или присутствия другого экспрессированного кодируемого компонента. Специалистам в данной области будет понятно, что различных уровней регулируемой экспрессии гена можно добиться сходным образом путем выбора подходящих регуляторных последовательностей, включая, но не ограничивая указанным, промоторы, энхансеры и другие хорошо известные регуляторные элементы генов.

Данное изобретение также относится к векторам и конструкциям, полученным на основе известных векторов, которые включают нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению, и, в частности, к «рекомбинантным экспрессирующим конструкциям», которые содержат любые нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки и полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин согласно изобретению, которые приведены выше; к клеткам-хозяевам, которые генетически сконструированы с векторами и/или конструкциями согласно изобретению, и к способам введения экспрессирующих конструкций, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие такие слитые полипептиды и слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно изобретению, или их фрагменты или варианты, методами на основе рекомбинации. Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин можно экспрессировать практически в любой клетке-хозяине под контролем соответствующих промоторов в зависимости от природы конструкции (например, тип промотора, который описан выше) и от природы требуемой клетки-хозяина (например, является ли она терминально постмитотически дифференцированной или активно делящейся; например, находится ли экспрессирующая конструкция в клетке-хозяине в виде эписомы или интегрирована в геном клетки-хозяина). Соответствующие клонирующие и экспрессирующие векторы для применения в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989); как указано выше, в особенно предпочтительных вариантах изобретения рекомбинантную экспрессию проводят в клетках млекопитающих, которые были трансфицированы или трансформированы рекомбинантной экспрессирующей конструкцией согласно данному изобретению.

Обычно конструкции получают из плазмидных векторов. Предпочтительной конструкцией является модифицированный вектор pNASS (Clontech, Palo Alto, CA), который имеет последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие ген резистентности к ампициллину, сигнал полиаденилирования и сайт промотора T7. Другие подходящие экспрессирующие векторы млекопитающих хорошо известны (смотри, например, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., выше; смотри также, например, каталоги Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ; и другие). Можно получить предпочтительные в настоящее время конструкции, которые содержат последовательность, кодирующую дигидрофолатредуктазу (DHFR) под подходящим регуляторным контролем, для обеспечения повышенных уровней продукции слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, при этом указанные уровни являются результатом амплификации генов после применения соответствующего агента селекции (например, метотрексата).

Как правило, рекомбинантные экспрессирующие векторы будут содержать начала репликации и селектируемые маркеры, позволяющие трансформировать клетку-хозяина, и промотор, полученный из высоко экспрессируемого гена, чтобы направлять транскрипцию ниже расположенной структурной последовательности, которая описана выше. Осуществляют сборку гетерологичной структурной последовательности в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции. Таким образом, например, представленные в данном описании нуклеиновые кислоты, кодирующие слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, можно включить в любой из множества конструкций экспрессирующих векторов в виде рекомбинантной экспрессирующей конструкции для экспрессии слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин в клетке-хозяине. В некоторых предпочтительных вариантах конструкции включены в композиции, которые вводят in vivo. Такие векторы и конструкции включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, например, производные SV40; бактериальные плазмиды; фаговую ДНК; дрожжевые плазмиды; векторы, полученные на основе комбинации плазмид и фаговой ДНК, ДНК вируса, такого как вирус оспы, аденовирус, поксвирус птиц и вирус бульбарного паралича или дефицитные по репликации ретровирусы, которые описаны ниже. Однако для получения рекомбинантной экспрессирующей конструкции можно использовать любой другой вектор, и в предпочтительных вариантах такой вектор будет способен к репликации и будет жизнеспособным в хозяине.

Соответствующую последовательность(ти) ДНК можно встроить в вектор различными способами. В общем последовательность ДНК встраивают в соответствующий сайт(ты) рестрикции эндонуклеазами способами, известными в данной области. Стандартные способы клонирования, выделения, амплификации и очистки ДНК, ферментативных реакций с участием ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы, эндонуклеаз рестрикции и тому подобных, и различные способы разделения являются известными и широко используемыми специалистами в данной области способами. Ряд стандартных способов описан, например, в Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. and John Wiley and Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Glover (Ed.) (1985 DNA Cloning Vol.I and II, IRL Press, Oxford, UK); Hames and Higgins (Eds.), (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK); и в других источниках.

Последовательность ДНК в экспрессирующем векторе функционально связана, по меньшей мере, с одной подходящей последовательностью регуляции экспрессии (например, конститутивным промотором или регулируемым промотором), чтобы направлять синтез мРНК. Типичные примеры таких последовательностей регуляции экспрессии включают промоторы эукариотических клеток или их вирусов, которые описаны выше. Промоторные области можно выбрать из любого требуемого гена, используя векторы CAT (хлорамфениколтрансфераза) или другие векторы с селектируемыми маркерами. Эукариотические промоторы включают предранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промотор SV40, LTR ретровируса и промотор металлотионеина-I мыши. Выбор соответствующего вектора и промотора хорошо известен специалисту в данной области, и получение некоторых особенно предпочтительных рекомбинантных экспрессирующих конструкций, содержащих, по меньшей мере, один промотор или регулируемый промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин, приведено в данном описании.

Транскрипцию ДНК, кодирующей полипептиды согласно данному изобретению, высшими эукариотами можно увеличить путем встраивания в вектор последовательности энхансера. Энхансеры являются цис-действующими элементами ДНК, обычно длиной примерно от 10 до 300 п.о., которые действуют на промотор, усиливая его транскрипцию. Примеры включают энхансер SV40 у конца начала репликации, п.о. от 100 до 270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы у конца начала репликации и аденовирусные энхансеры.

Как указано в данном описании в некоторых вариантах, вектор может представлять собой вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор (Miller et al., 1989 BioTechniques 7: 980; Coffin and Varmus, 1996 Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). Например, ретровирусы, из которых могут быть получены ретровирусные плазмидные векторы, включают, но не ограничены указанным, вирус лейкоза мышей Молони, вирус некроза селезенки, ретровирусы, такие как вирус саркомы Рауса, вирус саркомы Харви, вирус лейкоза птиц, вирус лейкоза обезьяны гиббона, вирус иммунодефицита человека, аденовирус, вирус миелопролиферативной саркомы и вирус опухоли молочной железы.

Ретровирусы являются РНК-вирусами, которые могут реплицироваться и интегрировать в геном клетки-хозяина посредством промежуточного продукта ДНК. Указанный промежуточный продукт ДНК или провирус может быть стабильно интегрирован в ДНК клетки-хозяина. Согласно некоторым вариантам данного изобретения вакцина может содержать ретровирус, в который введен чужеродный ген, который кодирует чужеродный белок, вместо нормальной ретровирусной РНК. Когда ретровирусная РНК проникает в клетку-хозяина при инфекции, чужеродный ген также вводится в клетку и затем может интегрироваться в ДНК клетки-хозяина, как будто он является частью ретровирусного генома. Экспрессия указанного чужеродного гена в хозяине приводит к экспрессии чужеродного белка.

Большинство ретровирусных векторных систем, которые были разработаны для генной терапии, основаны на ретровирусах мышей. Такие ретровирусы существуют в двух формах, в виде свободных вирусных частиц, называемых вирионами, или в виде провирусов, интегрированных в ДНК клетки-хозяина. Вирионная форма вируса содержит структурные и ферментные белки ретровируса (включая фермент обратной транскриптазы), две РНК-копии вирусного генома и части плазматической мембраны клетки-источника, содержащие гликопротеины вирусной оболочки. Ретровирусный геном организован в виде четырех основных областей: длинный концевой повтор (LTR), который содержит цис-действующие элементы, необходимые для инициации и терминации транскрипции, и расположен как с 5'-, так и с 3'-стороны кодирующих генов, и три кодирующих гена gag, pol и env. Три указанных гена gag, pol и env кодируют, соответственно, внутренние вирусные структуры, ферментные белки (такие как интеграза) и гликопротеин оболочки (называемый gp70 и p15e), который придает инфекционность и определяет пределы специфичности вируса в отношении хозяина, а также пептид «R» с неопределенной функцией.

Разработаны отдельные линии пакующих клеток и линии клеток, продуцирующих векторы, в связи с безопасностью в отношении применения ретровирусов, включая их применение в вакцинах, как описано в данном изобретении. Коротко, в указанном способе используют два компонента, ретровирусный вектор и линию пакующих клеток (PCL). Ретровирусный вектор содержит длинные концевые повторы (LTR), чужеродную ДНК, которую необходимо перенести, и пакующую последовательность (y). Указанный ретровирусный вектор не будет репродуцироваться сам по себе, поскольку гены, которые кодируют структурные белки и белки оболочки, не включены в векторный геном. PCL содержит гены, кодирующие белки gag, pol и env, но не содержит сигнала упаковки «y». Таким образом, сама PCL может только образовывать пустые вирусные частицы. В указанном общем способе ретровирусный вектор вводят в PCL, создавая, тем самым, линию клеток, продуцирующих вектор (VCL). Указанная VCL производит частицы вирионов, содержащие только геном ретровирусного вектора (чужеродный), и поэтому ранее его считали безопасным ретровирусным вектором для терапевтического применения.

«Конструкция ретровирусного вектора» относится к конструкции, которая в предпочтительных вариантах изобретения способна направлять экспрессию представляющей интерес последовательности(тей) или гена(ов), таких как последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин. Коротко, конструкция ретровирусного вектора должна включать 5'-LTR, сайт связывания тРНК, сигнал упаковки, начало синтеза второй цепи ДНК и 3'-LTR. В векторную конструкцию можно включать широкое множество гетерологичных последовательностей, включая, например, последовательности, которые кодируют белок (например, цитотоксичный белок, связанный с заболеванием антиген, вспомогательную иммунную молекулу или замещенный ген) или которые являются пригодными в виде самой молекулы (например, рибозим или антисмысловая последовательность).

Конструкции ретровирусного вектора согласно данному изобретению легко можно сконструировать из широкого множества ретровирусов, включая, например, ретровирусы типа B, C и D, а также спумавирусы и лентивирусы (смотри, например, RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Такие ретровирусы легко можно получить из депозитариев и коллекций, таких как Американская коллекция типовых культур («ATCC»; Rockville, Maryland), или выделить из известных источников с использованием общедоступных способов. Любой из указанных выше ретровирусов можно легко использовать для того, чтобы собрать или сконструировать конструкции ретровирусного вектора, пакующие клетки или клетки-продуценты согласно данному изобретению, на основании представленного описания и стандартных способов рекомбинации (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, PNAS 82: 488, 1985).

Подходящие промоторы для применения в вирусных векторах обычно могут включать, но не ограничены указанным, ретровирусный LTR; промотор SV40 и промотор цитомегаловируса человека (CMV), описанный в Miller, et al., Biotechniques 7: 980-990 (1989), или любой другой промотор (например, клеточные промоторы, такие как эукариотические клеточные промоторы, включая, но не ограничивая указанным, промоторы гистонов, pol III и β-актина). Другие вирусные промоторы, которые можно использовать, включают, но не ограничены указанным, аденовирусные промоторы, промоторы тимидинкиназы (TK) и промоторы парвовируса B19. Выбор подходящего промотора будет очевиден для специалистов в данной области, исходя из инструкций, приведенных в данном описании, и может осуществляться из числа регулируемых промоторов или промоторов, которые описаны выше.

Как описано выше, ретровирусный плазмидный вектор используют для трансдукции линий пакующих клеток, чтобы образовать линии клеток-продуцентов. Примеры пакующих клеток, которые можно трансфицировать, включают, но не ограничены указанным, линии клеток PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 и DAN, которые описаны в Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990). Пакующие клетки можно трансдуцировать вектором с помощью любого способа, известного в данной области. Такие способы включают, но не ограничены указанным, электропорацию, применение липосом и преципитацию CaPO₄. Альтернативно ретровирусный плазмидный вектор может быть инкапсулирован в липосому или связан с липидом и затем введен в хозяина.

Линия клеток-продуцентов создает инфекционные ретровирусные векторные частицы, которые содержат последовательность(ти) нуклеиновой кислоты, кодирующую слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин. Затем такие ретровирусные векторные частицы можно использовать для того, чтобы трансдуцировать эукариотические клетки, либо in vitro, либо in vivo. Трансдуцированные эукариотические клетки будут экспрессировать последовательность(ти) нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид или слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин. Эукариотические клетки, которые можно трансдуцировать, включают, но не ограничены указанным, эмбриональные стволовые клетки, а также гематопоэтические стволовые клетки, гепатоциты, фибробласты, циркулирующие периферические мононуклеарные и полиморфноядерные клетки крови, включая миеломоноцитарные клетки, лимфоциты, миобласты, тканевые макрофаги, дендритные клетки, клетки Купфера, лимфоидные и ретикулоэндотелиальные клетки лимфатических узлов и селезенки, кератиноциты, эндотелиальные клетки и бронхиальные эпителиальные клетки.

В качестве другого примера варианта изобретения, в котором используют вирусный вектор, чтобы получить экспрессирующую конструкцию слияния связывающий домен-иммуноглобулин, в одном предпочтительном варианте клетки-хозяева, трансдуцированные рекомбинантной вирусной конструкцией, направляющей экспрессию слитых полипептидов или слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, могут продуцировать вирусные частицы, содержащие экспрессированные слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, которые получены из частей мембраны клетки-хозяина, захваченными вирусными частицами во время активной репликации вируса (бадинга).

В другом аспекте данное изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим описанные выше рекомбинантные конструкции, экспрессирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин. Клетки-хозяева генетически конструируют (трансдуцируют, трансформируют или трансфицируют) векторами и/или экспрессирующими конструкциями согласно данному изобретению, которые могут, например, представлять собой клонирующие вектор, челночный вектор или экспрессирующую конструкцию. Вектор или конструкция, например, может быть в форме плазмиды, вирусной частицы, фага и т.д. Сконструированные клетки-хозяева можно культивировать в обычных питательных средах, модифицированных так, чтобы они подходили для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации отдельных генов, таких как гены, кодирующие слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин. Условия культивирования конкретных клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, такие как температура, pH и тому подобное, будут очевидны для специалиста в данной области.

Клеткой-хозяином может быть клетка высшего эукариота, такая как клетка млекопитающего, или клетка низшего эукариота, такая как клетка дрожжей, или клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка, такая как бактериальная клетка. Типичные примеры подходящих клеток-хозяев согласно данному изобретению включают, но не ограничены указанным, бактериальные клетки, такие как E.coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; клетки грибков, таких как дрожжи; клетки насекомых, такие как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как клетки CHO, COS или 293; аденовирусы; растительные клетки, или любая подходящая клетка, уже адаптированная к размножению in vitro или введенная в культуру de novo. Предполагается, что специалисты в данной области свободно могут выбрать подходящего хозяина, исходя из инструкций, приведенных в данном описании.

Различные системы на основе культур клеток млекопитающих также можно использовать, чтобы экспрессировать рекомбинантный белок. Примеры экспрессирующих систем млекопитающих включают линии фибробластов почки обезьяны COS-7, описанные Gluzman, Cell 23: 175 (1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать совместимый вектор, например, линии клеток C127, 3T3, CHO, HeLa и BHK. Экспрессирующие векторы млекопитающих будут содержать начало репликации, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосомы, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, например, последовательности, приведенные при описании, касающемся получения конструкций, экспрессирующих слияние связывающий домен-иммуноглобулин. Последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсинга и полиаденилирования SV40, можно использовать для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов. Введение конструкции в клетку-хозяина осуществляют различными способами, с которыми будут знакомы специалисты в данной области, включая, но не ограничивая указанным, например, трансфекцию с помощью фосфата кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном или электропорацию (Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology).

Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению можно приготовить в фармацевтических композициях для введения согласно хорошо известным способам. Фармацевтические композиции обычно содержат одну или более рекомбинантных экспрессирующих конструкций и/или продуктов экспрессии таких конструкций в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем. Такие носители должны быть нетоксичными по отношению к реципиенту при используемых дозах и концентрациях. В случае композиций на основе нуклеиновых кислот или в случае композиций, содержащих продукты экспрессии рекомбинантных конструкций согласно данному изобретению, следует вводить примерно от 0,01 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела, обычно интрадермальным, подкожным, внутримышечным или внутривенным путем или другими путями. Предпочтительная доза составляет примерно от 1 мкг/кг до примерно 1 мг/кг, при этом особенно предпочтительная - примерно от 5 мкг/кг до 200 мкг/кг. Специалистам в данной области будет понятно, что количество и частота введения будет зависеть от ответа хозяина. «Фармацевтически приемлемые носители» для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R.Gennaro edit. 1985). Например, можно использовать стерильный физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер при физиологическом pH. Фармацевтические композиции могут содержать консерванты, стабилизаторы, красители и даже корригенты. Например, в качестве консервантов могут быть добавлены бензоат натрия, сорбиновая кислота и сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты. Там же, 1449. Дополнительно можно использовать антиоксиданты и суспендирующие агенты. Там же.

«Фармацевтически приемлемая соль» относится к солям соединений согласно данному изобретению, полученным в результате комбинации таких соединений и органической и неорганической кислоты (кислотно-аддитивные соли) или органического или неорганического основания (основно-аддитивная соль). Соединения согласно данному изобретению можно использовать либо в виде свободного основания, либо в форме солей, при этом считается, что обе формы входят в объем данного изобретения.

Фармацевтические композиции, которые содержат одну или более конструкций, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин (или продукты их экспрессии), могут быть в любой форме, которая позволяет вводить композицию пациенту. Например, композиция может быть в форме твердого вещества, жидкости или газа (аэрозоль). Типичные пути введения включают без ограничения пероральный, местный, парентеральный (например, подъязычный или буккальный), подъязычный, ректальный, вагинальный или интраназальный. Термин «парентеральный» в используемом в данном описании смысле включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудинные, внутрикавернозные, интратекальные, внутриканальные, интрауретральные инъекции или инфузии. Фармацевтическую композицию готовят так, чтобы она позволяла находящимся в ней активным ингредиентам быть биодоступными при введении композиции пациенту. Композиции, которые будут вводить пациенту, имеют форму одной или более дозированных единиц, при этом, например, таблетка может быть однократной единицей дозирования, а емкость, содержащая одно или более соединений согласно изобретению в аэрозольной форме, может содержать большое количество единиц дозирования.

В случае перорального введения может присутствовать эксципиент и/или связывающее вещество. Примерами являются сахароза, каолин, глицерин, декстрины крахмала, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза и этилцеллюлоза. Могут присутствовать красящие агенты и/или корригенты. Можно использовать покрывающую оболочку.

Композиция может быть в форме жидкости, например, эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии. В качестве двух примеров жидкость может быть использована для перорального введения или доставки путем инъекции. Предпочтительные композиции, в том случае, если они предназначены для перорального введения, содержат кроме одной или более конструкций или экспрессированных продуктов слияния связывающий домен-иммуноглобулин один или более подсластителей, консервантов, красителей/усилителей цвета и вкуса. В композицию, предназначенную для введения путем инъекции, могут быть включены одно или более поверхностно-активных веществ, консервантов, увлажнителей, диспергирующих агентов, суспендирующих агентов, буферов, стабилизаторов и агентов для изотоничности.

Жидкая фармацевтическая композиция, используемая в данном изобретении, либо в форме раствора, суспензии, либо в другой подобной форме может включать в себя один или более из следующих вспомогательных веществ: стерильные разбавители, такие как вода для инъекции, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотоничный раствор хлорида натрия, жирные масла, такие как синтетические моно- и диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспедирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с многократными дозами, сделанные из стекла или пластика. Предпочтительным вспомогательным средством является физиологический раствор. Инъекционные фармацевтические композиции предпочтительно являются стерильными.

Также желательным может быть включение в препарат других компонентов, таких как носители для доставки, включая, но не ограничивая указанным, соли алюминия, эмульсии типа «вода в масле», биодеградируемые масляные носители, эмульсии типа «масло в воде», биодеградируемые микрокапсулы и липосомы. Примеры иммуностимулирующих веществ (адъювантов) для применения в таких носителях включают N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин (MDP), липополисахариды (ЛПС), глюкан, IL-12, GM-CSF, гамма-интерферон и IL-15.

Хотя в фармацевтических композициях согласно данному изобретению можно использовать любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области, тип носителя будет зависеть от способа введения и от того, требуется ли длительное высвобождение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из указанных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Также в качестве носителей для фармацевтических композиций согласно данному изобретению можно использовать биодеградируемые микросферы (например, полилактид-галактид). Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах США No. 4897268 и 5075109. В этом отношении предпочтительно, чтобы микросфера была больше, чем примерно 25 микрон.

Фармацевтические композиции также могут содержать разбавители, такие как буферы, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, полипептиды с низкой молекулярной массой (примерно менее 10 остатков), белки, аминокислоты, углеводы, включая глюкозу, сахарозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как EDTA, глутатион и другие стабилизаторы и эксципиенты. Примером подходящих разбавителей являются нейтральный забуференный раствор соли или физиологический раствор, смешанный с неспецифичным сывороточным альбумином. Предпочтительно продукт готовят в виде лиофилизата с использованием в качестве разбавителей подходящих растворов эксципиентов (например, сахарозы).

Как описано выше, данное изобретение включает композиции, способные доставлять молекулы нуклеиновых кислоты, кодирующие слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин. Такие композиции включают рекомбинантные вирусные векторы (например, ретровирусы (смотри WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 и WO 94/03622), аденовирус (смотри Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4: 403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130-134, 1993 и Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994), поксвирус (смотри патент США No. 4769330; патент США No. 5017487 и WO 89/01973)), рекомбинантные экспрессирующие конструкции нуклеиновых кислот в комплексе с поликатионной молекулой (смотри WO 93/03709) и нуклеиновые кислоты, связанные с липосомами (смотри Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851, 1987). В некоторых вариантах ДНК может быть связана с убитым или инактивированным аденовирусом (смотри Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6094, 1992). Другие подходящие композиции включают ДНК-лиганд (смотри Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989) и комбинации липид-ДНК (смотри Felgner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 7413-7417, 1989).

Кроме прямых способов in vivo, можно использовать способы ex vivo, при которых клетки извлекают из хозяина, модифицируют и помещают в того же самого или другого животного-хозяина. Очевидно, что можно использовать любую из указанных выше композиций для введения слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, в клетки ткани в условиях ex vivo. Протоколы вирусных, физических и химических способов захвата хорошо известны в данной области.

Таким образом, данное изобретение применимо для лечения пациентов, имеющих B-клеточное расстройство или злокачественное состояние, или для обработки культур клеток, полученных от такого пациента. В используемом в данном описании смысле термин «пациент» относится к любому теплокровному животному, предпочтительно человеку. Пациент может страдать раком, таким как B-клеточная лимфома, или может быть здоровым (т.е. не имеющим выявляемого заболевания или инфекции). «Культура клеток» представляет собой любой препарат, поддающийся обработке ex vivo, например, препарат, содержащий иммунокомпетентные клетки или выделенные клетки иммунной системы (включая, но не ограничивая указанным, T-клетки, макрофаги, моноциты, B-клетки и дендритные клетки). Такие клетки можно выделять любым из множества способов, хорошо известных специалистам в данной области (например, центрифугирование в градиенте плотности фикол-гипак). Клетки могут быть (но необязательно) выделены от пациента, пораженного B-клеточным расстройством или злокачественной опухолью, и могут быть повторно введены пациенту после обработки.

Жидкая композиция, предназначенная либо для парентерального, либо для перорального введения, должна содержать такое количество конструкции, кодирующей слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, или экспрессированного продукта, чтобы можно было получить подходящую дозу. Обычно такое количество составляет, по меньшей мере, 0,01% мас. конструкции слияния связывающий домен-иммуноглобулин или экспрессированного продукта в композиции. В том случае если композиция предназначена для перорального введения, такое количество может варьировать от 0,1 до примерно 70% от массы композиции. Предпочтительные пероральные композиции содержат примерно от 4% до 50% конструкции слияния связывающий домен-иммуноглобулин или экспрессированного продукта(тов). Предпочтительные композиции и препараты готовят так, чтобы парентеральная дозированная лекарственная форма содержала от 0,01 до 1% активного компонента по массе.

Фармацевтическая композиция может быть предназначена для местного введения, и в этом случае удобный носитель может содержать раствор, эмульсию, мазь или гелевую основу. Основа, например, может содержать один или более из следующих компонентов: петролатум, ланолин, полиэтиленгликоли, пчелиный воск, минеральное масло, разбавители, такие как вода и спирт, и эмульгаторы и стабилизаторы. В фармацевтической композиции для местного введения могут присутствовать загустители. В случае планируемого трансдермального введения композиция может включать трансдермальный пластырь или устройство для ионтофореза. Местные композиции могут содержать концентрацию конструкции слияния связывающий домен-иммуноглобулин или экспрессированного продукта примерно от 0,1 до 10% мас./об. (масса на единицу объема).

Композиция может быть предназначена для ректального введения, например, в форме суппозитория, который будет расплавляться в прямой кишке и высвобождать лекарственное средство. Композиция для ректального введения может содержать масляную основу в качестве подходящего нераздражающего эксципиента. Такие основы включают без ограничения ланолин, масло какао и полиэтиленгликоль.

В способах согласно изобретению конструкции, кодирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин, или экспрессированный продукт(ты) можно вводить с использованием вкладки(док), гранулы(нул), композиции(ций) замедленного высвобождения, пластыря(рей) или композиции(ций) быстрого высвобождения.

Следующие примеры предлагаются с целью иллюстрации, но не с целью ограничения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

КЛОНИРОВАНИЕ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ 2H7 И КОНСТРУИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ 2H7scFv-Ig

Данный пример иллюстрирует клонирование молекул кДНК, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального антитела 2H7. Данный пример также демонстрирует конструирование, секвенирование и экспрессию 2H7scFv-Ig.

Клетки гибридомы, экспрессирующие моноклональное антитело 2H7, которое специфично связывается с CD20, использовали в качестве исходного материала. Перед сбором клетки гибридомы поддерживали в логарифмической фазе роста в течение нескольких дней в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) с добавлением глутамина, пирувата, не-необходимых аминокислот DMEM и пенициллина-стрептомицина. Клетки осаждали из культуральной среды центрифугированием и использовали 2×10⁷ клеток, чтобы получить РНК. РНК из продуцирующих 2H7 клеток гибридомы выделяли с использованием набора для выделения суммарной РНК Pharmingen (San Diego, CA) (№ в каталоге 45520K) согласно инструкциям производителя, прилагаемым к набору. Один микрограмм (1 мкг) суммарной РНК использовали в качестве матрицы для получения кДНК с помощью обратной транскрипции. Смешивали РНК и 300 нг случайных праймеров и денатурировали при 72°C в течение 10 минут перед добавлением фермента. Обратную транскриптазу Superscript II (Life Technologies) добавляли к РНК плюс смесь праймеров в общем объеме 25 мкл в присутствии 5X буфера для синтеза второй цепи и 0,1 М ДТТ, поставляемых вместе с ферментом. Реакции обратной транскрипции позволяли продолжаться при 42°C в течение одного часа.

2H7-кДНК, созданную в обратно-транскриптазной реакции со случайными праймерами, и праймеры, специфичные для V-области, использовали для того, чтобы с помощью ПЦР амплифицировать вариабельные области легкой и тяжелой цепи антитела 2H7. Праймеры, специфичные для V-области, конструировали, ориентируясь на опубликованную последовательность (GenBank, депозитарные номера M17954 для V_L и M17953 для V_H). Конструировали две вариабельных цепи с совместимыми концевыми последовательностями, так чтобы можно было собрать scFv лигированием двух V-областей после амплификации и расщепления ферментами рестрикции.

Пептидный линкер (gly₄ser)₃, который необходимо встроить между двумя V-областями, встраивали путем добавления дополнительных нуклеотидов к антисмысловому праймеру для V_L 2H7. Также встраивали сайт рестрикции Sac I в место соединения двух V-областей. Смысловой праймер, используемый для амплификации V_L 2H7, который содержал сайт рестрикции HindIII и лидерный пептид легкой цепи, представлял собой 5'-gtc aag ctt gcc gcc atg gat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3' (SEQ ID NO: 23). Антисмысловой праймер представлял собой 5'-gtc gtc gag ctc cca cct cct cca gat cca cca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc agc tcc agc ttg gtc cc-3' (SEQ ID NO: 24). Рамка считывания V-области указана в виде приведенного жирным шрифтом, подчеркнутого кодона. Сайты Hind III и SacI показаны подчеркнутыми, изображенными курсивом последовательностями.

Домен V_H амплифицировали без лидерного пептида, но с

включенным 5'-сайтом рестрикции SacI для слияния с V_L и сайтом рестрикции BclI на 3'-конце для слияния с различными хвостами, включая Fc-домен IgG1 человека и укороченные формы лиганда CD40, CD154. Смысловой праймер представлял собой 5'-gct gct gag ctc tca ggc tta tct аса gca agt ctg g-3' (SEQ ID NO: 25). Сайт SacI указан курсивом и подчеркнутым шрифтом, а рамка считывания кодона для первой аминокислоты домена V_H указана жирным, подчеркнутым шрифтом. Антисмысловой праймер представлял собой 5'-gtt gtc tga tca gag acg gtg acc gtg gtc cc-3' (SEQ ID NO: 26). Сайт BclI указан курсивом, подчеркнутым шрифтом, а последний серин последовательности домена V_H указан жирным, подчеркнутым шрифтом.

Сборку scFv-Ig осуществляли встраиванием HindIII-BclI - фрагмента 2H7scFv в pUC19, содержащую шарнирную, CH2- и CH3-области IgG1 человека, которую расщепляли ферментами рестрикции HindIII и BclI. После лигирования продуктами лигирования трансформировали бактерии DH5α. Проводили скрининг позитивных клонов в отношении точно встроенных фрагментов с использованием сайта SacI в соединении V_L-V_H 2H7 в качестве диагностического сайта. кДНК 2H7scFv-Ig подвергали циклу секвенирования в термоциклере PE 9700, используя программу, рассчитанную на 25 циклов при денатурации при 96°C в течение 10 секунд, отжиге при 50°C в течение 30 секунд и удлинении при 72°C в течение 4 минут. Праймерами для секвенирования были прямой и обратный праймеры pUC и внутренний праймер, который отжигается с доменом CH2 человека в части константной области IgG. Реакции секвенирования выполняли, используя готовую смесь для секвенирования с терминаторами, меченными красителем Big Dye (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), согласно инструкциям производителя. Затем образцы очищали, используя колонки Centrisep (№ в каталоге CS-901, Princeton Separations, Adelphia, N.J.), элюаты сушили в вакуумной сушилке Savant, денатурировали в реагенте для супрессии матрицы (PE-ABI) и анализировали в генетическом анализаторе ABI 310 (PE-Applied Biosystems). Последовательность редактировали, транслировали и анализировали, используя Vector Nti, версию 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). На фигуре 1 показана кДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность конструкции 2H7scFv-Ig.

ПРИМЕР 2

ЭКСПРЕССИЯ 2H7-ScFv-Ig В СТАБИЛЬНЫХ ЛИНИЯХ КЛЕТОК CHO

Данный пример иллюстрирует экспрессию 2H7scFv-Ig в эукариотической линии клеток и характеристику экспрессированного 2H7scFv-Ig с помощью SDS-ПААГ и функциональных анализов, включающих ADCC и фиксацию комплемента.

HindIII-XbaI-фрагмент 2H7scFv-Ig (~1,6 т.п.н.) с правильной последовательностью встраивали в экспрессирующий вектор млекопитающих pD18, и ДНК позитивных клонов амплифицировали, используя наборы для получения плазмид QIAGEN (QIAGEN, Valencia, CA). Затем рекомбинантную плазмидную ДНК (100 мкг) линеаризовали в несущественном участке путем расщепления AscI, очищали фенольной экстракцией и ресуспендировали в среде для культуры ткани Excell 302 (№ в каталоге 14312-79P, JRH Biosciences, Lenexa, KS). Клетки для трансфекции, клетки CHO DG44, поддерживали в логарифмической фазе роста и собирали 10⁷ клеток для каждой реакции трансфекции. Линеаризованную ДНК добавляли к клеткам CHO в общем объеме 0,8 мл для электропорации.

Стабильной продукции слитого белка 2H7scFv-Ig (SEQ ID NO: 10) добивались путем электропорации селектируемой, способной к амплификации плазмиды pD18, содержащей кДНК 2H7scFv-Ig под контролем промотора CMV, в клетки яичника китайского хомячка (CHO). Кассету, экспрессирующую 2H7, субклонировали ниже промотора CMV в векторном сайте множественного клонирования в виде HindIII-XbaI-фрагмента длиной ~1,6 т.п.н. Вектор pD18 является модифицированной версией pcDNA3, кодирующей селектируемый маркер DHFR с ослабленным промотором, чтобы увеличить давление отбора для плазмиды. Плазмидную ДНК получали, используя наборы Qiagen maxiprep, и очищенную плазмиду линеаризовали в уникальном сайте AscI перед фенольной экстракцией и осаждением этанолом. ДНК спермы лосося (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) добавляли в качестве ДНК-носителя и по 100 мкг плазмидной ДНК и ДНК носителя использовали для трансфекции 10⁷ клеток CHO DG44 посредством электропорации. Клетки выращивали в логарифмической фазе в среде Excell 302 (JRH Biosciences), содержащей глутамин (4 мМ), пируват, рекомбинантный инсулин, пенициллин-стрептомицин и не-необходимые аминокислоты 2X DMEM (все из Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), в дальнейшем называемой «полной средой Excell 302». Среды для нетрансфицированных клеток также содержали HT (разбавленный из 100X раствора гипоксантина и тимидина) (Life Technologies). Среды для трансфекции в условиях селекции содержали различные уровни метотрексата (Sigma-Aldrich) в качестве селектирующего агента в пределах от 50 нМ до 5 мкМ. Электропорацию проводили при 275 вольтах, 950 мкF. Трансфицированным клеткам давали возможность восстановиться в течение ночи в неселективной среде перед высеванием на селективные среды в 96-луночные планшеты с плоским дном (Costar) при различных серийных разведениях в пределах от 125 клеток/лунку до 2000 клеток/лунку. Культуральной средой для клонирования клеток была полная среда Excell 302, содержащая 100 нМ метотрексата. После достаточного разрастания клонов проводили скрининг серийных разведений надосадков культуры из маточных лунок в отношении связывания с трансфицированными клетками CD20-CHO. Клоны с самой высокой продукцией слитого белка размножали во флаконах Т25, а затем Т75, чтобы получить соответствующие количества клеток для замораживания и для крупномасштабного получения 2H7scFv-Ig. Затем увеличивали уровни продуцирования в культурах из трех клонов с помощью прогрессирующей амплификации в культуральной среде, содержащей метотрексат. При каждом последующем пассаже клеток полная среда Excell 302 содержала увеличенную концентрацию метотрексата, так что могли выжить только клетки с амплифицированной DHFR-плазмидой.

Надосадки клеток СНО, экспрессирующих 2H7scFv-Ig, собирали, фильтровали через экспресс-фильтры PES, 0,2 мкм (Nalgene, Rochester, NY) и пропускали через колонку с белком А-агарозой (IPA 300 сшитая агароза) (Repligen, Needham, MA). Колонку промывали PBS и затем связанный белок элюировали, используя 0,1 М цитратный буфер, pH 3,0. Фракции собирали и элюированный белок нейтрализовали, используя 1М Трис, рН 8,0, перед диализом в течение ночи в PBS. Концентрацию очищенного 2H7scFv-Ig (SEQ ID NO: 15) определяли по поглощению при 280 нм. Коэффициент экстинкции 1,77 определяли, используя сервисные программы для анализа белков в пакете компьютерных программ Vector Nti, версия 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). Указанная программа использует данные об аминокислотном составе для расчета коэффициентов экстинкции.

Уровни продуцирования 2H7scFv-Ig трансфицированными стабильными клетками СНО анализировали проточной цитометрией. Очищенному 2H7scFv-Ig к клеткам СНО давали возможность связаться с клетками СНО, которые экспрессировали CD20 (CD20-CHO) и анализировали проточной цитометрией, используя конъюгированный с флуоресцеином второй реагент против IgG человека (номера в каталоге Н10101 и Н10501, CalTag, Burlingame, CA). На фигуре 2 (вверху) показана стандартная кривая, полученная путем титрования связывания 2H7scFv-Ig с CD20-CHO. При каждой концентрации 2H7scFv-Ig показана средняя яркость сигнала флуоресцеина в линейных единицах. Затем надосадкам, собранным из Т-флаконов, содержащих стабильные клоны клеток СНО, экспрессирующих 2H7scFv-Ig, давали возможность связаться с CD20-CHO и связывание анализировали проточной цитометрией. Измеряли сигнал флуоресцеина, генерируемый 2H7scFv-Ig, находящимся в надосадках, и концентрацию 2H7scFv-Ig в надосадках рассчитывали на основе стандартной кривой (фигура 2, внизу).

Очищенный 2H7scFv-Ig (SEQ ID NO:15) анализировали с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидных гелях. Образцы 2H7scFv-Ig, очищенные независимыми прогонами через колонку с белок А-агарозой, кипятили в буфере для образцов с SDS без восстановления дисульфидных связей и наносили на 10% Трис-BIS-гели с SDS (№ в каталоге NP0301, Novex, Carlsbad, CA). Двадцать микрограммов каждой очищенной партии наносили на гели. Белки после электрофореза визуализировали окрашиванием Кумасси синим (Pierce Gel Code Blue Stain Reagent, № в каталоге 24590, Pierce, Rockford, IL), и краситель удаляли в дистиллированной воде. В тот же самый гель включали маркеры молекулярной массы (предварительно окрашенные стандарты Kaleidoscope, № в каталоге 161-0324, Bio-Rad, Hercules, CA). Результаты представлены на фигуре 3. Цифрами над дорожками обозначены независимые партии очистки. Молекулярные массы маркеров размера в килодальтонах указаны с левой стороны фигуры. Дальнейшие эксперименты с использованием альтернативных условий приготовления образцов показали, что восстановление дисульфидных связей кипячением в буфере для образцов с SDS, содержащем ДТТ или 2-меркаптоэтанол, вызывает агрегацию 2H7scFv-Ig.

Можно контролировать ряд других иммунологических параметров, используя стандартные анализы, которые хорошо известны в данной области. Анализы включают, например, анализ антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC), анализ вторичных гуморальных ответов in vitro, анализ различных субпопуляций клеток периферической крови или мононуклеарных лимфоидных клеток проточной иммуноцитофлуорометрией с использованием хорошо установленных систем маркерных генов, иммуногистохимию или другие подходящие анализы. Указанные и другие анализы можно, например, найти в Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5-th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC.

Способность 2H7scFv-Ig убивать CD20-позитивные клетки в присутствии комплемента тестировали с использованием B-клеточных линий Ramos и Bjab. В анализе использовали комплемент кролика (Pel-Freez, Rogers, AK) при конечном разведении 1/10. Очищенный 2H7scFv-Ig инкубировали с B-клетками и комплементом в течение 45 минут при 37°C с последующим подсчетом живых и мертвых клеток путем исключения при окрашивании трипановым синим. Результаты на фигуре 4A показывают, что в присутствии комплемента кролика 2H7scFv-Ig лизировал B-клетки, экспрессирующие CD20.

Способность 2H7scFv-Ig убивать CD20-позитивные клетки в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) тестировали путем измерения высвобождения ⁵¹Cr из меченых клеток Bjab в 4-часовом анализе, используя соотношение PBMC к клеткам Bjab 100:1. Результаты, показанные на фигуре 4B, свидетельствуют, что 2H7scFv-Ig может опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), поскольку высвобождение ⁵¹Cr было выше в присутствии PBMC и 2H7scFv-Ig вместе, чем в присутствии либо PBMC, либо только 2H7scFv-Ig.

ПРИМЕР 3

ВЛИЯНИЕ ОДНОВРЕМЕННОГО ЛИГИРОВАНИЯ CD20 И CD40 НА РОСТ НОРМАЛЬНЫХ B-КЛЕТОК И НА ЭКСПРЕССИЮ CD95 И ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА

Данный пример иллюстрирует влияние сшивания CD20 и CD40, экспрессированных на клеточной поверхности, на пролиферацию клеток.

Покоящиеся в результате высокой плотности B-клетки выделяли из миндалевидной железы человека в ступенчатом градиенте перкола и T-клетки удаляли с помощью E-розеткообразования. Пролиферацию покоящихся тонзиллярных B-клеток с высокой плотностью измеряли по поглощению ³[H]-тимидина в течение последних 12 часов 4-дневного эксперимента. Пролиферацию измеряли в культурах в четырех повторах, рассчитывая средние значения и стандартные отклонения, как показано. Мышиные мАт против CD20 человека, 1F5 (анти-CD20), использовали отдельно или сшивали с анти-мышиным ĸ мАт, 187.1 (анти-CD20XL). Активацию CD40 осуществляли с использованием растворимого CD154 человека, слитого с мышиным CD8 (CD154) (Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4212-21 (1992)), и сшивание CD40 осуществляли, используя анти-мышиное CD8 мАт, 53-6 (CD154XL). Указанный способ позволял осуществлять одновременное сшивание CD20 и CD40 на поверхности клеток. Результаты представлены на фигуре 5.

Оценивали влияние сшивания CD20 и CD40 на клетки Ramos, линию B-клеточной лимфомы. Клетки Ramos анализировали в отношении экспрессии CD95 (Fas) и определяли процент апоптоза через восемнадцать часов после обработки (без козьего анти-мышиного IgG (GAM)) и/или сшивания (+GAM) с использованием мышиного мАт, которое специфично связывает CD20 (1F5) и CD40 (G28-5). Контрольные клетки обрабатывали контрольным антителом несвязывающего изотипа (64.1), специфичным по отношению к CD3.

Обработанные клетки Ramos собирали, инкубировали с ФИТЦ-анти-CD95 и анализировали проточной цитометрией, чтобы определить относительный уровень экспрессии Fas на поверхности клеток после сшивания CD20 или CD40. Данные указаны на графике в виде средней флуоресценции клеток после обработки указанными стимулами (фигура 6A).

Обработанные клетки Ramos из того же эксперимента собирали и измеряли связывание аннексина V, чтобы показать процент апоптоза в обработанных культурах. Апоптоз измеряли по связыванию аннексина V через 18 часов после сшивания CD20 и CD40 с использованием 1F5 и G28-5 с последующим сшиванием GAM.

Связывание аннексина V измеряли, используя набор ФИТЦ-аннексин V (№ в каталоге PN-IM2376, Immunotech, Marseille, France). Известно, что связывание аннексина V является ранним событием в продвижении клеток к апоптозу. Апоптоз или запрограммированная гибель клеток является процессом, характеризующимся каскадом катаболических реакций, приводящих к гибели клеток в результате суицида. В ранней фазе апоптоза перед тем, как клетки изменяют морфологию и происходит гидролиз ДНК, целостность клеточных мембран сохраняется, но клетки теряют асимметричность фосфолипидов своих мембран, выводя на поверхность клеток отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин. Аннексин V, белок, связывающий кальций и фосфолипиды, предпочтительно и с высокой аффинностью связывается с фосфатидилсерином. Результаты, демонстрирующие влияние сшивания обоих CD20 и CD40 на экспрессию рецептора (CD95), представлены на фигуре 6А. Влияние сшивания обоих CD20 and CD40 на связывание аннексина V с клетками показано на фигуре 6B.

ПРИМЕР 4

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СЛИТЫХ БЕЛКОВ 2H7ScFv-CD154

Чтобы сконструировать молекулу, способную связывать CD20 и CD40, кДНК, кодирующую 2H7scFv сливали с кДНК, кодирующей CD154, лиганд CD40. кДНК 2H7scFv, кодируемую HindIII-BclI-фрагментом, извлекали из конструкции 2H7scFv-Ig и встраивали в вектор pD18 вместе с BamHI-XbaI-фрагментом кДНК, кодирующим внеклеточный домен CD154 человека. Внеклеточный домен кодируется карбоксильным концом CD154, подобно другим мембранным белкам типа II.

Внеклеточный домен CD154 человека амплифицировали в ПЦР, используя кДНК, полученную с помощью случайных праймеров и РНК из T-лимфоцитов человека, активированных ФГА (фитогемагглютинин). Наборы праймеров включали два разных 5'- или смысловых праймера, которые создавали соединения слияния в двух разных положениях во внеклеточном домене CD154. Конструировали два разных соединения слияния, результатом которых была короткая или укороченная форма (форма S4), включающая аминокислоты 108 (Glu)-261 (Leu)+(Glu), и длинная или полная форма (форма L2), включающая аминокислоты 48 (Arg)-261 (Leu)+(Glu) внеклеточного домена CD154, которые конструировали в виде BamHI-XbaI-фрагментов. Смысловой праймер, который сливает два разных укороченных внеклеточных домена с 2H7scFv, содержит BamHI-сайт для клонирования. Смысловой праймер для формы S4 кДНК CD154 обозначен SEQ ID NO: 11 или CD154BAM108 и кодирует 34-мер следующей последовательности: 5'-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctt tga aat gca a-3', в то время как антисмысловой праймер обозначен SEQ ID NO: 12 или CD154XBA и кодирует 44-мер следующей последовательности: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'.

Олигонуклеотидные праймеры, используемые при амплификации длинной формы (L2) внеклеточного домена CD154, кодирующей аминокислоты 48 (Arg)-261 (Leu)+(Glu), представляли собой следующие праймеры: Смысловой праймер, обозначенный CD154 BAM48 (SEQ ID NO: 13), кодировал 35-мер со следующей последовательностью: 5'-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3'. Антисмысловой праймер, обозначенный CD154XBA (SEQ ID NO:__), кодировал 44-мер: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'. Другие условия реакции ПЦР были идентичны условиям, используемым для амплификации 2H7scFv (смотри пример 1). ПЦР-фрагменты очищали с помощью наборов для быстрой ПЦР (QIAGEN, San Diego, CA), элюировали 30 мкл ddH₂O и расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHI и XbaI (Roche) в реакционном объеме 40 мкл при 37°С в течение 3 часов. Фрагменты очищали в геле, очищали с использованием наборов QIAEX согласно инструкциям производителя (QIAGEN) и лигировали вместе с HindIII-BclI-фрагментом 2Н7 в экспрессирующий вектор pD18, расщепленный HindIII+XbaI. Реакционными смесями для лигирования трансформировали химически компетентные бактерии DН5-альфа и бактерии высевали на LB-чашки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты выращивали в течение ночи при 37°С и выделенные колонии использовали для инокуляции 3 мл жидкой среды в бульон Луриа, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Проводили скрининг клонов после получения миниплазмид (QIAGEN) для встраивания 2H7scFv и фрагмента внеклеточного домена CD154.

Конструкции кДНК 2H7scFv-CD154 подвергали циклическому секвенированию в термоциклере РЕ 9700, используя программу, рассчитанную на 25 циклов, которая включает денатурацию при 96°С, 10 секунд, отжиг при 50°С в течение 5 секунд и изменено при 60°С в течение 4 минут. Используемыми для секвенирования праймерами были прямой праймер pD18 (SEQ ID NO: 30: 5'-gtctatataagcagagctctggc-3') и обратный праймер pD18 (SEQ ID NO: 31: 5'-cgaggctgatcagcgagctctagca-3'). Кроме того, использовали внутренний праймер, который обладал гомологией с последовательностью CD154 человека (SEQ ID NO: 32: 5'-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3'). Реакционные смеси содержали 3,2 пмоль праймеров, примерно 200 нг матрицы ДНК и 8 мкл смеси для секвенирования. Реакции секвенирования выполняли, используя готовую смесь для секвенирования с терминаторами, меченными красителем Big Dye (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) согласно инструкциям производителя. Затем образцы очищали с использованием колонок Centrisep (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Элюаты сушили в скоростной вакуумной сушилке Savant, денатурировали в 20 мкл реагента для супрессии матрицы (ABI) при 95°С в течение 2 минут и анализировали в генетическом анализаторе ABI 310 (PE-Applied Biosystems). Последовательность редактировали, транслировали и анализировали, используя Vector Nti, версия 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). Последовательность кДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность 2H7scFv-CD154 L2 представлены на фигуре 7А, а последовательность кДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность 2H7scFv-CD154 S4 представлены на фигуре 7В.

Связывающая активность слитых белков 2H7scFv-CD154 (SEQ ID N0:33 и 34) одновременно с CD20 и CD40 определяли проточной цитометрией. В анализе использовали клеточные мишени СНО, которые экспрессируют CD20. После 45-минутной инкубации клеток CD20-CHO с надосадками из клеток, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей 2H7scFv-CD154, клетки CD20-CHO дважды промывали и инкубировали с конъюгированным с биотином слитым белком CD40-Ig в PBS/2% FBS. Через 45 мин клетки дважды промывали и инкубировали с меченым фикоэритрином (РЕ) стрептавидином в разведении 1:100 в PBS/2% FBS (Molecular Probes, Eugene OR). После дополнительной 30-минутной инкубации клетки промывали 2Х и анализировали проточной цитометрией. Результаты показывают, что молекула 2H7scFv-CDl54 способна связываться с CD20 на поверхности клеток и захватывать из раствора CD40, конъюгированный с биотином (фигура 8).

Чтобы определить влияние 2H7scFv-CDl54 на рост и жизнеспособность В-лимфоидных и лимфобластоидных линий клеток, клетки инкубировали с 2H7scFv-CDl54 L2 (SEQ ID NO:33) в течение 12 часов и затем оценивали связывание аннексина V. Связывание аннексина V измеряли, используя набор ФИТЦ-аннексина V (Immunotech, Marseille, France, № в каталоге PN-IM2376). Линии В-клеток инкубировали в культурах объемом 1 мл с разведениями концентрированных диализованных надосадков клеток, экспрессирующих секретируемые формы слитых белков 2H7scFv-CDl54. Результаты представлены на фигуре 9.

Скорость роста линии В-лимфоидных клеток Ramos в присутствии 2H7scFv-CDl54 оценивали по поглощению ³H-тимидина в течение последних 6 часов 24-часового культивирования. Влияние 2H7scFv-CDl54 на пролиферацию клеток показано на фигуре 10.

Пример 5

Конструирование и характеристика производных антител CytoxB

Антитела CytoxB получали из полипептида 2H7scFv-IgG. 2H7scFv (смотри пример 1) связывали с Fc-доменом IgG1 человека посредством измененного шарнирного домена (смотри фигуру 11). Остатки цистеина в шарнирной области заменяли остатками серина сайт-специфичным мутагенезом и другими способами, известными в данной области. Мутантный шарнир сливали либо с Fc-доменом дикого типа, чтобы создать одну конструкцию, обозначенную CytoB-MHWTG1C, либо сливали с мутантным Fc-доменом (CytoxBMHMG1C), который имел дополнительные мутации, введенные в домен CH2. Аминокислотные остатки в CH2, которые вовлечены в эффекторную функцию, показаны на фигуре 11. Мутации в одном или более из указанных остатков могут снизить связывание с FcR и опосредование эффекторных функций. В данном примере остаток лейцина 234, который, как известно в данной области, важен для связывания рецептора Fc, подвергали мутированию в слитом белке 2H7scFv, CytoxB[MG1H/MG1C]. В другой конструкции шарнирную область IgG1 человека заменяли частью шарнира IgA человека, который сливали с человеческим Fc-доменом дикого типа (CytoxB-IgAHWTHG1C) (смотри фигуру 11). Указанная мутантная шарнирная область позволяла экспрессировать смесь мономерных и димерных молекул, которые сохраняют функциональные свойства CH2- и CH3-доменов IgG1 человека. Конструировали синтетические рекомбинантные экспрессирующие кассеты кДНК указанных молекул и экспрессировали полипептиды в клетках CHODG44 согласно способам, описанным в примере 2.

Очищенные производные молекул слитого белка CytoxB-scFvIg анализировали в SDS-ПААГ согласно способам, описанным в примере 2. Полиакриламидные гели разгоняли в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях. На каждый гель наносили различные наборы маркеров молекулярной массы, предварительно окрашенные маркеры BioRad (BioRad, Hercules, CA) и маркеры молекулярной массы Novex Multimark. Картины миграции различных конструкций и ритуксимаба представлены на фигуре 12.

Способность различных производных молекул CytoxB-scFvIg опосредовать ADCC измеряли, используя в качестве мишени клетки B-лимфомы Bjab и свежеприготовленные PBMC человека в качестве эффекторных клеток (смотри пример 2). Отношения эффектор к мишени варьировали следующим образом: 70:1, 35:1 и 18:1, при этом количество клеток Bjab на лунку оставалось постоянным, а количество PBMC варьировали. Клетки Bjab метили в течение 2 часов ⁵¹Cr и разносили аликвотами при плотности клеток 5×10⁴ клеток/лунку в каждую лунку 96-луночных планшетов с плоским дном. Добавляли очищенные слитые белки или ритуксимаб при концентрации 10 мг/мл к различным разведениям PBMC. Спонтанное высвобождение измеряли без добавления PBMC или слитого белка и максимальное высвобождение измеряли при добавлении детергента (1% NP-40) в соответствующие лунки. Реакционные смеси инкубировали в течение 4 часов и собирали 100 мкл надосадка культуры в Lumaplate (Packard Instruments) и давали возможность высохнуть в течение ночи перед подсчетом высвобождения в имп/мин. Результаты представлены на фигуре 13.

Также измеряли зависимую от комплемента цитотоксическую (CDC) активность производных CytoxB. Реакции осуществляли, как описано в примере 2. Результаты представлены на фигуре 14 в виде процента погибших клеток к общему количеству клеток для каждой концентрации слитого белка.

ПРИМЕР 6

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO НА МАКАКАХ

Исходные исследования in vivo производных CytoxB выполняли на приматах, отличных от человека. На фигуре 15 показаны данные, характеризующие время полужизни CytoxB в сыворотке обезьян. Измерения проводили в образцах сыворотки, полученных от двух разных макак (J99231 и K99334) после того, как каждой макаке вводили дозы 6 мг/кг в дни, указанные стрелками. Для каждого образца имеющийся уровень 2H7scFvIg оценивали путем сравнения со стандартной кривой, полученной при связывании очищенного слитого белка CytoxB-(MHWTG1C)-Ig с клетками CD20-CHO (смотри пример 2). Данные приведены в виде таблицы на нижней панели фигуры 15.

Исследовали влияние слитого белка CytoxB-(MHWTG1C)Ig на уровни циркулирующих клеток CD40+у макак. Полный анализ крови выполняли в каждый из дней, указанных на фигуре 16. Кроме того, выполняли анализ FACS (флуоресцентно активируемый сортировщик клеток) на лимфоцитах периферической крови, используя специфичное по отношению к CD40 антитело, конъюгированное с флуоресцеином, чтобы выявить B-клетки в популяции клеток. Затем использовали процент позитивных клеток, чтобы рассчитать количество B-клеток в исходных образцах. Данные изображены графически в тысячах B-клеток на микролитр крови при измерении в указанные дни после инъекции (фигура 16).

ПРИМЕР 7

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ СЛИТОГО БЕЛКА АНТИ-CD19-scFv-Ig

Слитый белок анти-CD19-scFv-Ig конструировали, трансфицировали в эукариотические клетки и экспрессировали согласно способам, приведенным в примерах 1, 2 и 5 и стандартных в данной области. Вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи клонировали из РНК, выделенной из клеток гибридомы, продуцирующих антитело HD37, которое специфично связывается с CD19. Измеряли уровни экспрессии HD37scFv-IgAHWTG1C и HD37scFv-IgMHWTG1C и сравнивали со стандартной кривой, полученной с использованием очищенного HD37scFvIg. Результаты представлены на фигуре 17.

ПРИМЕР 8

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ СЛИТОГО БЕЛКА АНТИ-L6-scFv-Ig

Слитый белок scFv-Ig конструировали с использованием вариабельных областей, полученных из мАт против карциномы, L6. Слитый белок конструировали, трансфицировали в эукариотические клетки и экспрессировали согласно способам, представленным в примерах 1, 2 и 5 и стандартных в данной области. Измеряли уровни экспрессии L6scFv-IgAHWTG1C и L6scFv-IgMHWTG1C и сравнивали со стандартной кривой, полученной с использованием очищенного HD37scFvIg. Результаты представлены на фигуре 18.

ПРИМЕР 9

ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗЛИЧНЫХ СЛИТЫХ БЕЛКОВ scFv-Ig

Кроме уже описанного слитого белка scFv-Ig получали слитые белки G28-1 (анти-CD37)scFv-Ig, по существу, как описано в примерах 1 и 5. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей клонировали согласно способам, известным в данной области. ADCC-активность 2H7-MHWTG1C, 2H7-IgAHWTG1C, G28-1-MHWTG1C, G28-1-IgAHWTG1C, HD37-MHWTG1C и HD37-IgAHWTG1C определяли согласно способам, описанным выше (смотри пример 2). Результаты представлены на фигуре 19. ADCC-активность L6scFv-IgAHWTG1C и L6scFv-IgMHWTG1C измеряли, используя линию клеток карциномы легкого человека 2981. Результаты представлены на фигуре 20. Известно, что мышиное моноклональное антитело L6 не проявляет ADCC-активности.

Очищенные белки анализировали с помощью SDS-ПААГ при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Подготовку образцов и разгонку в гелях осуществляли, по существу, как описано в примерах 2 и 5. Результаты для слитых белков L6- и 2H7-scFv-Ig представлены на фигуре 21, а результаты для слитых белков G28-1 и HD37-scFv-Ig представлены на фигуре 22.

Из сказанного выше будет понятно, что хотя в данном описании в целях иллюстрации приведены конкретные варианты изобретения, могут быть осуществлены различные модификации, не отходя от сути и не превышая объем изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничено ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.