Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ

Настоящая заявка подана 23 марта 2012 года в виде международной заявки на выдачу патента PCT на имя Онкологического исследовательского центра имени Фреда Хатчинсона, национальной корпорации США, заявителя для случая указания всех стран, за исключением США, и Stanley R. Riddell, гражданина Канады, и Michael Hudecek, гражданина Германии, заявителей для случая указания только США, и испрашивает приоритет на основании заявки на выдачу патента США с регистрационным номером 61/466552, поданной 23 марта 2011 года, содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биомедицины и, в частности, к способам, применимым для терапии злокачественных опухолей. В частности, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам и композициям для проведения клеточной иммунотерапии.

Заявление относительно финансируемого из федерального бюджета исследования

Настоящее изобретение осуществлено при поддержке правительства в форме грантов R01CA18029 Департамента здравоохранения и социального обеспечения США, Национального института здравоохранения и гранта SCORE общества исследования лейкоза и лимфомы. Правительство Соединенных Штатов Америки имеет определенные права на изобретение.

Уровень техники

Исследования на грызунах показали, что адоптивная иммунотерапия с использованием специфичных для антигена T-клеток является эффективной в случае злокачественной опухоли и инфекций, и имеются данные о том, что такой способ обеспечивает терапевтическую активность у человека^1-8. Для клинических применений необходимо выделить T-клетки с требуемой антигенной специфичностью или сконструировать T-клетки так, чтобы они экспрессировали рецепторы, которые нацелены на инфицированные или трансформированные клетки, и затем размножить такие клетки в культуре^9-14. Перенос клонов T-клеток представляет интерес, поскольку он обеспечивает контроль специфичности и функции и облегчает оценку продолжительности жизни, токсичности и эффективности in vivo. Кроме того, при осуществлении аллогенной трансплантации стволовых клеток введение реципиентам T-клеточных клонов от донора, мишенью которых являются патогены или злокачественные клетки, может обеспечить возможность избегания болезни трансплантат-против-хозяина, которое возникает при инфузии не подвергнутых селекции T-клеток донора^3,4,15. Однако из клинических исследований очевидно, что эффективность культивируемых T-клеток, особенно клонированных T-клеток CD8+, часто ограничена их неспособностью персистировать после адоптивного переноса^16,17.

Пул лимфоцитов, из которого могут быть получены T-клетки для адаптивной иммунотерапии, может содержать наивные и долгоживущие контактировавшие с антигенами T-клетки памяти (T_M). T_M можно разделить на подгруппы центральных клеток памяти (T_CM) и эффекторных клеток памяти (T_EM), которые отличаются по фенотипу, свойствам хоминга и функции¹⁸. T_CM CD8+ экспрессируют CD62L и CCR7 на клеточной поверхности, которые стимулируют миграцию в лимфатические узлы и быстро пролиферируют при повторной экспозиции с антигеном. T_EM CD8+ не имеют CD62L на клеточной поверхности и предпочтительно мигрируют в периферические ткани и проявляют немедленную эффекторную функцию¹⁹. В ответ на антигенную стимуляцию T_CM и T_EM CD8+ дифференцируются в цитолитические эффекторные T-клетки (T_E), которые экспрессируют высокий уровень гранзимов и перфорина, но являются короткоживущими²⁰. Таким образом, короткое время жизни T-клеток в испытаниях по клинической иммунотерапии просто может быть результатом их дифференцировки во время культивирования in vitro в T_E, гибель которых предопределена^17,21,22. Существует необходимость в идентификации клеточных популяций и способах, которые обеспечивают повышенную жизнеспособность адоптивно переносимых T-клеток in vivo.

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам и композициям для придания и/или усиления иммунных ответов, опосредованных клеточной иммунотерапией, такой как иммунотерапия посредством адоптивного переноса специфичных для опухоли, специфичных для подгруппы генетически модифицированных T-клеток CD4+, при этом T-клетки CD4+ придают и/или усиливают способность T-клеток CD8+ поддерживать противоопухолевую реактивность и увеличивать и/или максимизировать специфичную для опухоли пролиферацию.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или нарушение, посредством введения субъекту препарата генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, при этом препарат цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена с внеклеточным вариабельным доменом антитела, специфичным по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточным доменом передачи сигнала T-клеточных или других рецепторов, таким как костимулирующие домены; и препарата генетически модифицированных хелперных T-лимфоцитов, которые проявляют преобладающий Th1-фенотип, а также продуцируют другие цитокины, вызывают прямое распознавание опухоли и усиливают способность препаратов генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов опосредовать клеточный иммунный ответ, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора. Возможны различные модификации указанного выше способа. Например, химерные рецепторы антигена, модифицирующие T-клетку CD4+ и T-клетку CD8+, могут быть одинаковыми или разными. В альтернативных вариантах T-клетки могут быть модифицированы рекомбинантным рецептором T-клеток (TCR). TCR может быть специфичным по отношению к антигену, патогену или опухоли. Существуют TCR для многих опухолевых антигенов меланомы (например, MART1, gp100), лейкоза (например, WT1, минорные антигены гистосовместимости), рака молочной железы (например, her2, NY-BR1).

В другом варианте настоящее изобретение относится к композиции для адаптивной клеточной иммунотерапии, содержащей препарат генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов CD8+, который вызывает клеточный иммунный ответ, при этом препарат цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена с внеклеточным вариабельным доменом антитела, специфичным по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного или других рецепторов, такой как костимулирующий домен, и препарат генетически модифицированных хелперных T-лимфоцитов, которые проявляют преимущественный Th1-фенотип, а также продуцируют другие цитокины, вызывают прямое распознавание опухоли и усиливают способность препаратов генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов опосредовать клеточный иммунный ответ, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена с внеклеточным вариабельным доменом антитела, специфичным по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к композиции для адаптивной клеточной иммунотерапии, содержащей препарат модифицированных химерным рецептором антигена специфичных для опухоли цитотоксических T-лимфоцитов CD8+, который вызывает клеточный иммунный ответ, при этом препарат цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточное одноцепочечное антитело, специфичное по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора, и модифицированные антиген-реактивным химерным рецептором антигена наивные хелперные T-клетки CD4+, которые получены из CD45RO-негативных, CD62L-позитивных CD4-позитивных T-клеток, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте настоящее изобретение относится к композиции для адаптивной клеточной иммунотерапии, содержащей препарат антиген-специфичных цитотоксических T-лимфоцитов CD8+, который вызывает клеточный иммунный ответ и содержит T-клетки CD8+, полученные от пациента, вместе с антиген-реактивными модифицированными химерным рецептором антигена хелперными T-клетками CD4+, которые вызывают цитокиновый ответ Th1-типа и усиливают иммунный ответ CD8+ на патогены, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена с внеклеточным вариабельным доменом антитела, специфичным по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В другом варианте настоящее изобретение относится к композиции для адаптивной клеточной иммунотерапии, содержащей антиген-реактивные модифицированные химерным рецептором антигена хелперные T-клетки CD4+, которые вызывают прямое распознавание опухоли и усиливают иммунный ответ CD8+ на патогены, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу производства композиции для адаптивной иммунотерапии посредством получения препарата модифицированных химерным рецептором антигена специфичных для опухоли цитотоксических T-лимфоцитов CD8+, который вызывает клеточный иммунный ответ, и антиген-реактивного химерного рецептора антигена, при этом препарат модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена с внеклеточным вариабельным доменом антитела, специфичным по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный модуль передачи сигнала T-клеточного рецептора; и получения модифицированной наивной хелперной T-клетки CD4+, которая вызывает цитокиновый ответ Th1-типа, при этом препарат модифицированных хелперных T-лимфоцитов содержит клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена с внеклеточным вариабельным доменом антитела, специфичным по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу производства композиции для адаптивной иммунотерапии посредством получения модифицированной наивной хелперной T-клетки CD4+, которая вызывает цитокиновый ответ Th1-типа, при этом препарат модифицированных хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора, и объединения модифицированных наивных хелперных T-клеток CD4+ с препаратом антиген-специфичных цитотоксических центральных T-лимфоцитов памяти CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена с внеклеточным вариабельным домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного или других рецепторов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или нарушение, посредством введения субъекту препарата генетически модифицированных хелперных T-лимфоцитов, при этом препарат модифицированных хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный модуль передачи сигнала T-клеточного рецептора.

Указанные и другие варианты осуществления изобретения описаны далее в сопровождающем описании, чертежах и формуле изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает фенотип и анализ экспрессии химерного рецептора антигена (CAR) в CAR-трансдуцированной лентивирусом, кодирующим ROR1-CAR, и нетрансдуированной линии T-клеток CD8+ в качестве контроля. Кассета ROR1-CAR содержит укороченный EGFR, который служит в качестве маркера трансдукции и может быть выявлен по окрашиванию моноклональными анти-EGFR-антителами. Укороченный слитый белок Fc-ROR1 связывается непосредственно с антиген-связывающим доменом ROR1-CAR и избирательно окрашивает ROR1-CAR-трансдуцированную, но не окрашивает нетрансдуцированную контрольную T-клеточную линию. Экспрессию ROR1-CAR на клеточной поверхности T-клеток CD8+ измеряют непосредственно по связыванию со слитым белком ROR1-Fc и опосредованно по экспрессии укороченного EGFR, который закодирован в векторе ниже последовательности 2A.

Фиг. 2 показывает цитолитическую активность T-клеток CD8+, экспрессирующих ROR1-специфичный химерный рецептор антигена, против панели ROR1-позитивных линий опухолевых клеток человека (K562) и первичных опухолевых клеток (B-CLL) и аутологичных нормальных B-клеток в анализе высвобождения ⁵¹Cr. В соответствии с равномерной экспрессией ROR1 на злокачественных, но не на зрелых нормальных B-клетках генетически модифицированные T-клетки CD8+ ROR1-CAR лизировали только опухолевые клетки ROR1+, но не лизировали зрелые нормальные B-клетки. T-клетки CD8+ ROR1-CAR проявляли специфичную литическую активность против ROR1-позитивных опухолевых клеток, включая первичные CLL, но не против нормальных B-клеток.

Фиг. 3 показывает фенотип и экспрессию CAR в ROR1-CAR-трансдуцированной и нетрансдуцированной T-клеточной линии CD4+ в качестве контроля. Экспрессию ROR1-CAR на клеточной поверхности T-клеток CD4+ измеряют на основании специфичного связывания со слитым белком ROR1-Fc. Укороченный слитый белок Fc-ROR1, но не белок Fc отдельно, непосредственно связывается с ROR1-CAR и избирательно окрашивает ROR1-CAR-трансдуцированную, но не окрашивает нетрансдуцированную контрольную T-клеточную линию CD4+, подтверждая экспрессию ROR1-CAR на клеточной поверхности и связывание с белком ROR1. Экспрессию ROR1-CAR на клеточной поверхности T-клеток CD4+ измеряют на основании специфичного связывания со слитым белком ROR1-Fc, но не с контрольным слитым белком Fc.

Фиг. 4 (т.е. Фиг. 4A-4B вместе) показывают слабую, но специфичную цитолитическую активность T-клеток CD4+ ROR1-CAR в анализе высвобождения ⁵¹Cr против панели ROR1-позитивных опухолевых клеток, включая первичные CLL, линию лимфомы из клеток мантийной зоны Jeko-1, клетки K562, которые были стабильно трансфицированы ROR1 (K562/ROR1), но не наивные ROR1-негативные клетки K562. T-клетки CD4+ ROR1-CAR проявляют слабую, но специфичную литическую активность против ROR1-позитивных опухолевых клеток.

Фиг. 5 (т.е. Фиг. 5A-5B вместе) показывают результаты ELISA IFNγ (Фиг.5A) и мультиплексного анализа цитокинов (Фиг.5B). Секреция цитокинов в линиях T-клеток ROR1-CAR CD4+ и CD8+. T-клетки CD4+ ROR1-CAR и CD8 ROR1-CAR совместно инкубировали с опухолевыми клетками ROR1+ и измеряли уровни гамма-интерферона (IFNg) в ELISA (5A), и IFNg, TNFα, IL-2, IL-4, IL-10 и IL-17 измеряли в анализе Luminex (5B). ROR1-CAR-модифицированные T-клетки CD4+ специфично узнают ROR1-позитивные опухолевые клетки и линии опухолевых клеток и продуцируют большие количества Th1-цитокинов, включая IFN-γ, TNF-α и особенно IL-2, чем ROR1-CAR-модифицированные T-клетки CD8+. Полученные данные демонстрируют, что T-клетки CD4+ ROR1-CAR проявляют хелперные эффекторные функции после стимуляции с использованием ROR1-CAR и в дополнение к опосредованию прямой противоопухолевой реактивности также могут быть использованы для повышения способности ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD8+ опосредовать клеточный иммунный ответ.

На Фиг. 6 изображены результаты исследования пролиферации, показывающие, что T-клетки CD4+ ROR1-CAR индуцированы к пролиферации после стимуляции линиями ROR1-позитивных опухолевых клеток и первичными опухолевыми клетками (анализ CFSE) и что процент пролиферирующих клеток и количество клеточных делений, которым подвергалась подгруппа пролиферирующих клеток, были значимо выше по сравнению с ROR1-CAR-модифицированными T-клетками CD8+. T-клетки CD4+ ROR1-CAR сильнее пролиферируют после стимуляции ROR1-позитивными опухолевыми клетками (K562/ROR1, первичные CLL и Jeko MCL) по сравнению с CTL CD8+ ROR1-CAR.

Фиг. 7: Поликлональные не подвергнутые селекции T-клетки CD4+ ROR1 CAR помогают CTL CD8+ ROR1-CAR, стимулируя их пролиферацию в ответ на опухоль. T-клетки CD4+ ROR1-CAR (полученные из общей массы T-клеток CD4+) значимо увеличивали пролиферацию поликлональных не подвергнутых селекции CTL CD8+ ROR1-CAR (18% в отдельной культуре → 31,5% после совместного культивирования с T-клетками CD4+ CAR).

Фиг. 8 (т.е. Фиг. 8A-8D вместе) показывает образование линий T-клеток CD4+ CAR из очищенных с использованием проточной сортировки подгрупп наивных, центральных и эффекторных клеток памяти CD4+ и анализ функции T-клеток. Профиль цитокинов и пролиферативная способность свидетельствуют, что T-клетки CD4+ ROR1-CAR, полученные из наивных T-клеток CD4+, могут быть наиболее подходящими в качестве помощников для CTL CD8+. Сходные данные получали в экспериментах, в которых сравнивали функцию T-клеточных линий CD4+ CAR, экспрессирующих CD19-специфичный CAR. На фиг. 8A показана очистка с использованием проточной сортировки наивных, центральных и эффекторных T-клеток памяти CD4+ на основе экспрессии CD45RA, CD45RO, CD62L. На фиг. 8B показан анализ пролиферации T-клеточных линий ROR1-CAR, которые были получены с использованием лентивирусной трансдукции очищенных сортировкой наивных, центральных и эффекторных T-клеток памяти CD4+ (анализ CFSE). На фиг. 8C показан анализ секреции цитокинов в T-клеточных линиях ROR1-CAR, полученных из очищенных сортировкой наивных, центральных и эффекторных T-клеток памяти CD4+ (анализ Luminex). На фиг. 8D показан анализ секреции цитокинов в T-клеточных линиях CD19-CAR, полученных из очищенных сортировкой наивных, центральных и эффекторных T-клеток памяти CD4+ (анализ Luminex). Профиль цитокинов, полученный в мультиплексном анализе цитокинов (Фиг. 8B), и пролиферативная способность на основании окрашивания CFSE (Фиг. 8C) показывают, что ROR1-CAR-модифицированные T-клетки CD4+, полученные из подгруппы наивных клеток, продуцировали более высокие уровни Th1-цитокинов и сильнее пролиферировали после стимуляции ROR1-позитивными опухолевыми клетками, что свидетельствует о том, что они могут быть наиболее подходящими для усиления CTL CD8+ ROR1-CAR. Анализ секреции цитокинов в T-клеточных линиях CD19-CAR, полученных из очищенных сортировкой наивных центральных и эффекторных T-клеток памяти CD4+ (анализ Luminex), демонстрирует, что активность подгрупп T-клеток CD4 может быть распространена на многие CAR.

Фиг. 9 показывает совместное культивирование ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD8+ с ROR1-CAR-модифицированными T-клетками CD4+ (но не с нетрансдуцированными контрольными T-клетками CD4+). Совместное культивирование CTL CD8+ ROR1-CAR и T-клеточных линий CD4+ ROR1-CAR, полученных из подгрупп наивных, центральных и эффекторных клеток памяти, для определения оптимального сочетания T-клеток CD8+ и CD4+, которое может обеспечить возможность максимальной пролиферации CTL CD8+ ROR1-CAR. Наивные T-клетки CD4 ROR1-CAR обеспечивают наибольшую пролиферацию центральных CTL-клеток памяти ROR1-CAR CD8. Совместное культивирование приводит к увеличению специфичной для опухоли пролиферации подгруппы CD8+, и такая максимальная пролиферация подгруппы CD8+ наблюдается после совместного культивирования с T-клетками CD4+ ROR1-CAR, полученными из наивных T-клеток CD4+, что свидетельствует о том, что наивные T-клетки CD4+ наилучшим образом подходят для усиления эффекторной функции CTL-клеток CD8+.

Фиг. 10 показывает превосходную способность T-клеточных линий CD4+ CAR, полученных из наивной подгруппы, усиливать специфичную для опухоли пролиферацию полученных из центральных CTL-клеток памяти CD8+ CAR в экспериментах по совместному культивированию с использованием CTL CD8+ CD19-CAR и T-клеточных линий CD4+ CD19-CAR, стимулированных линией лимфомы из клеток мантийной зоны CD19+ Jeko-1. Превосходная способность T-клеточных линий CD4+ CAR, полученных из наивной подгруппы, усиливать специфичную для опухоли пролиферацию полученных из центральных CTL-клеток памяти CD8+ CAR была подтверждена в экспериментах по совместному культивированию с использованием CTL CD8+ CD19-CAR и T-клеточных линий CD4+ CD19-CAR, стимулированных линий лимфомы из клеток мантийной зоны CD19+ Jeko-1.

Фиг. 11 показывает, что T-клетки CD8+ CAR и T-клетки CD4+ CAR независимо обеспечивают прямую противоопухолевую эффективность в модели лимфомы у иммунодефицитных мышей (NOD/SCID-Raji). Группам мышей (n=3) инокулировали экспрессирующие люциферазу светляка опухолевые клетки Raji посредством инъекции в хвостовую вену и обрабатывали однократной дозой 10×10⁶ T-клеток. Мыши получали либо CD19-CAR-трансдуцированные или контрольные ложно трансдуцированные T-клетки CD8+, полученные из центральных клеток памяти (A), либо CD19-CAR-трансдуцированные или контрольные ложно трансдуцированные T-клетки CD4+, полученные из наивных клеток (B). Опухолевую нагрузку и распределение анализировали, используя серийную визуализацию биолюминесценции.

Фиг. 12 показывает стимуляцию и синергетическое действие ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD4+ на противоопухолевую эффективность CTL CD8+ROR1-CAR в мышиной опухолевой модели системной лимфомы из клеток мантийной зоны (NSG/Jeko-1-ffLuc). Противоопухолевая эффективность ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD8+ и CD4+ в мышиной опухолевой модели системной агрессивной лимфомы из клеток мантийной зоны (NSG/Jeko-1). Анализ опухолевой нагрузки с использованием визуализации биолюминесценции после адоптивного переноса CTL CD8+ ROR1-CAR, T-клеток CD4+ ROR1-CAR или сочетания T-клеток ROR1-CAR CD8+ и CD4+. Все мыши получали одинаковые общие дозы T-клеток CAR.

Фиг. 13 показывает синергию T-клеток CD19-CAR CD8+ и CD4+ в мышиной модели системной лимфомы (NSG/Raji). Мышам NSG инокулировали трансдуцированные люциферазой светляка опухолевые клетки Raji. Приживление опухоли Raji подтверждали, используя визуализацию биолюминесценции на 6-й день после инокуляции опухоли (перед обработкой) (схема обработки показана на Фиг. A, приживление опухоли на основании биолюминесценции показано на Фиг. B). Затем группы мышей (n=5) обрабатывали либо CD19-CAR-модифицированными T-клетками CD8+, либо объединенным T-клеточным продуктом, который содержал T-клетки CD19-CAR CD8+ и CD4+. Все мыши получали одну и ту же общую дозу T-клеток (10×10⁶). Анализ опухолевой нагрузки с использованием визуализации биолюминесценции показал полное устранение опухолей Raji в когортах мышей, обработанных T-клетками CD8+ CD19-CAR, и у мышей, обработанных объединенным продуктом T-клеток CD19-CAR CD8+ и CD4+ (после обработки средние черный и серый столбики) B). Затем мышам вводили второй инокулят опухолевых клеток Raji и анализировали частоту встречаемости T-клеток CAR CD4+ и CD8+ в периферической крови и приживление опухоли. У мышей, обработанных объединенным продуктом T-клеток CAR CD8+ и CD4+ наблюдали значимо более высокие уровни T-клеток CAR CD8+ после инокуляции опухоли (нижние панели C) и полное отторжение инокулята Raji (после инокуляции опухоли правый серый столбик, B). Напротив, у мышей, которые получили только CTL CD8+ CD19-CAR, авторы не выявили увеличения количества T-клеток CAR после инокуляции опухоли (C), и опухолевые клетки Raji были способны приживаться (после инокуляции опухоли правый черный столбик, панель B).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

T-клетки, или T-лимфоциты, которые использованы в настоящем изобретении, могут быть получены от любого вида млекопитающего, предпочтительно приматов, включая мартышек, собак и человека. В некоторых вариантах T-клетки являются аллогенными (из того же самого вида, но другого донора) по отношению к субъекту-реципиенту; в некоторых вариантах T-клетки являются аутологичными (один и тот же субъект является и донором, и реципиентом); в некоторых вариантах T-клетки являются сингенными (донор и реципиенты являются разными, но идентичными близнецами).

Термин «цитотоксический T-лимфоцит» (CTL) в используемом в настоящем описании смысле относится к T-лимфоциту, который экспрессирует CD8 на своей поверхности (т.е. T-клетка CD8+). В некоторых вариантах такие клетки предпочтительно являются T-клетками «памяти» (клетки T_M), которые подвергались контакту с антигеном.

Центральная T-клетка памяти (или T_CM) в используемом в настоящем описании смысле относится к клетке CTL, которая подвергалась контакту с антигеном, которая экспрессирует CD62L и CD45RO на своей поверхности и не экспрессирует или имеет пониженную экспрессию CD45RA по сравнению с наивными клетками. В некоторых вариантах центральные клетки памяти являются позитивными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO и CD95 и имеют пониженную экспрессию CD54RA по сравнению с наивными клетками.

Эффекторная T-клетка памяти (или T_EM) в используемом в настоящем описании смысле относится к клетке CTL, которая подвергалась контакту с антигеном, которая не экспрессирует или имеет пониженную экспрессию CD62L на своей поверхности по сравнению с центральными клетками памяти и не экспрессирует или имеет пониженную экспрессию CD45RA по сравнению с наивной клеткой. В некоторых вариантах эффекторные клетки памяти являются негативными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28, CD45RA и являются позитивными в отношении CD127 по сравнению с наивными клетками или центральными клетками памяти.

Термин «наивные» T-клетки в используемом в настоящем описании смысле относится к не подвергавшемуся контакту с антигеном T-лимфоциту, который экспрессирует CD62L и CD45RA и не экспрессирует или имеет пониженную экспрессию CD45RO- по сравнению с центральными клетками памяти. В некоторых вариантах наивные T-лимфоциты CD8+ характеризуются экспрессией фенотипических маркеров наивных T-клеток, включая CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 и CD45RA.

Термин «эффекторные» T-клетки, «T_E», в используемом в настоящем описании смысле относится к подвергавшимся контакту с антигеном цитотоксическим T-лимфоцитам, которые не экспрессируют или имеют пониженную экспрессию CD62L, CCR7, CD28 и являются позитивными в отношении гранзима B и перфорина по сравнению с центральными клетками памяти.

«Обогащенный» и «истощенный» в используемом в настоящем описании смысле при описании количеств типов клеток в смеси относится к случаю, когда смесь клеток подвергается процессу, или проходит стадию, которая приводит к увеличению количества «обогащенного» типа и уменьшению количества «подвергнутых истощению» клеток. Таким образом, в зависимости от источника исходной популяции клеток, подвергаемых процессу обогащения, смесь или композиция может содержать 60, 70, 80, 90, 95 или 99% или более (при оценке количества или импульсов) «обогащенных» клеток и 40, 30, 20, 10, 5 или 1% или менее (при оценке количества или импульсов) «истощенных» клеток.

Интерлейкин-15 известен и описан, например, в патенте США № 6344192.

«CAR» в используемом в настоящем описании смысле относится к химерному рецептору антигена, содержащему внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного или других рецепторов, такой как костимулирующий домен.

Способы осуществления изобретения

T-лимфоциты CD4+ во время культивирования in vitro значимо увеличивали пролиферацию, продолжительность жизни и противоопухолевую реактивность специфичных для опухоли T-клеток CD8+ in vitro и in vivo. В некоторых вариантах наивные T-клетки CD4+ имеют присущую им программу, которая приводит к более высокой хелперной активности по сравнению с T-клетками CD4+, полученными из центральных и эффекторных T-клеток памяти или суммарных T-клеток CD4+.

В некоторых вариантах реактивные по отношению к опухоли T-клетки CD4+ модифицированы полученным из одноцепочечного антитела химерным рецептором антигена (CAR), специфичным по отношению к орфановому тирозинкиназному рецептору ROR1 или к молекуле CD19. ROR1 одинаково экспрессируется на клетках хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) и лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL), и ROR1-специфичный CAR из моноклонального анти-ROR1-антитела (мАт) обеспечивает специфичное распознавание злокачественных, но не зрелых нормальных B-клеток, при экспрессии в цитотоксических T-клетках (CTL) CD8+. T-клетки ROR1-CAR из общей популяции и очищенных проточной сортировкой наивных центральных и эффекторных T-клеток памяти CD4+ получают из периферической крови здоровых доноров и пациентов с CLL. T-клетки CD4+ CAR обладают специфичной, но слабой цитолитической активностью, направленной против опухолей ROR1+, включая первичный CLL, MCL-линию Jeko-1 и клетки K562, трансфицированные ROR1. Мультиплексный анализ цитокинов выявляет высокий уровень продукции Th1-цитокинов со значимо более высокими уровнями IFNγ, TNFα и особенно IL-2 по сравнению с CTL CD8+ CAR. Окрашивание CFSE показывает существенно более высокую пролиферацию после стимуляции ROR1-позитивными опухолевыми клетками, при этом процент клеток, которые были индуцированы к пролиферации, и количество клеточных делений, которым подвергается пролиферирующая подгруппа, значимо выше, чем в случае CTL CD8+ CAR. T-клетки CD4+, полученные от здоровых доноров и пациентов с CLL, приобретают противоопухолевую реактивность после генетической модификации ROR1-специфичным CAR. Кроме того, способность пролиферировать в отсутствие экзогенных цитокинов и продуцировать высокие уровни Th1-цитокинов показывает, что T-клетки CD4+ CAR проявляют типичные хелперные функции после стимуляции посредством CAR, и свидетельствует, что в дополнение к приданию способности к прямым противоопухолевым эффектам они могут быть использованы для усиления специфичных для опухоли CTL CD8+.

Получают профиль цитокинов и определяют пролиферативную способность T-клеток ROR1-CAR, полученных из очищенных проточной сортировкой подгрупп наивных центральных и эффекторных клеток CD4+. T-клетки CD4+ CAR, полученные из подгруппы наивных клеток CD45RA+ CD45RO- CD62L+, продуцируют самые высокие уровни Th1-цитокинов, особенно IL-2 и пролиферируют в ответ на опухолевые клетки ROR1+. Действительно, в экспериментах по совместному культивированию добавление CAR-трансдуцированных, но не добавление нетрансдуцированных T-клеток CD4+ приводит к значимому увеличению специфичной для опухоли пролиферации CTL CD8+ CAR. В некоторых вариантах CAR-модифицированные T-клетки CD4+, полученные из наивной подгруппы, но не из подгрупп центральных и эффекторных клеток памяти, или общей массы T-клеток CD4+, приводят к усиленной пролиферации CTL CD8+ CAR.

Центральные T-клетки памяти CD8+ имеют присущую им программу, которая позволяет им выживать в течение продолжительных периодов времени после введения, что делает их предпочтительной подгруппой T-клеток CD8+ для иммунотерапии. В некоторых вариантах ROR1-CAR- или CD19-CAR-модифицированные CTL из очищенных сортировкой центральных T-клеток памяти CD8+ и наивных CAR-модифицированных T-клеток CD4+ обеспечивают усиленную пролиферацию подгруппы T-клеток CD8+. В некоторых вариантах специфичные для опухоли T-клетки CD4+ проявляют противоопухолевую реактивность и помогают специфичным для опухоли T-клеткам CD8+ in vitro и in vivo. В конкретном варианте используют специфичные для опухоли T-клетки CD4+ из наивной подгруппы.

В другом варианте T-клетки CD8+ и CD4+ могут быть модифицированы T-клеточным рецептором (TCR). TCR может быть специфичным по отношению к любому антигену, патогену или опухоли (существуют TCR ко многим опухолевым антигенам меланомы (например, MART1, gp100), лейкоза (например, WT1, минорные антигены гистосовместимости например), рака молочной железы (например, her2, NY-BR1).

Подробное описание

Композиции

Изобретение относится к композиции для адаптивной клеточной иммунотерапии, содержащей препарат генетически модифицированных хелперных T-лимфоцитов, которые усиливают способность препаратов генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов опосредовать клеточный иммунный ответ, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора или других рецепторов.

В некоторых вариантах композиция для адаптивной клеточной иммунотерапии дополнительно содержит препарат модифицированных химерным рецептором антигена специфичных для опухоли цитотоксических T-лимфоцитов CD8+, который вызывает клеточный иммунный ответ, при этом препарат цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточное одноцепочечное антитело, специфичное по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В некоторых вариантах композиция для адаптивной клеточной иммунотерапии содержит препарат модифицированных химерным рецептором антигена специфичных для опухоли цитотоксических T-клеток CD8+, который вызывает клеточный иммунный ответ, при этом препарат цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточное одноцепочечное антитело, специфичное по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора, в сочетании с антиген-реактивными модифицированными химерным рецептором антигена наивными хелперными T-клетками CD4+, полученными из CD45RO-негативных, CD62L-позитивных, CD4-позитивных T-клеток, и фармацевтически приемлемый носитель.

В других вариантах композиция для адаптивной клеточной иммунотерапии содержит препарат антиген-специфичных цитотоксических T-лимфоцитов CD8+, которые вызывают клеточный иммунный ответ, полученные от пациента, в сочетании с антиген-реактивными модифицированными химерным рецептором антигена наивными хелперными T-клетками CD4+, которые усиливают иммунный ответ CD8+, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В следующем варианте композиция для адаптивной клеточной иммунотерапии содержит антиген-реактивные модифицированные химерным рецептором антигена наивные хелперные T-клетки CD4+, которые усиливают иммунный ответ CD8+, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В некоторых вариантах хелперный T-лимфоцит CD4+ выбран из группы, состоящей из наивных T-клеток CD4+, центральных T-клеток памяти CD4+, эффекторных T-клеток памяти CD4+ или общей популяции T-клеток CD4+. В некоторых вариантах клетка хелперного лимфоцита CD4+ представляет собой наивную T-клетку CD4+, при этом наивная T-клетка CD4+ включает T-клетку CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. В некоторых вариантах цитотоксический T-лимфоцит CD8+ выбран из группы, состоящей из наивных T-клеток CD8+, центральных T-клеток памяти CD8+, эффекторных T-клеток памяти CD8+ или общей популяции T-клеток CD8+. В некоторых вариантах клетка цитотоксического T-лимфоцита CD8+ представляет собой центральную T-клетку памяти, при этом центральная T-клетка памяти включает T-клетку CD45RO+, CD62L+, CD8+. В следующих вариантах цитотоксический T-лимфоцит CD8+ представляет собой центральную T-клетку памяти и хелперный T-лимфоцит CD4+ представляет собой наивную T-клетку CD4+.

В альтернативных вариантах T-клетки могут быть модифицированы рекомбинантным T-клеточным рецептором. TCR может быть специфичным по отношению к любому антигену, патогену или опухоли. Существуют TCR для многих опухолевых антигенов меланомы (например, MART1, gp100), лейкоза (например, WT1, минорные антигены гистосовместимости), рака молочной железы (например, her2, NY-BR1).

Селекция и сортировка популяций T-лимфоцитов

Композиции, описанные в настоящей публикации, обеспечивают антиген-реактивные T-лимфоциты CD4+ и CD8+.

T-лимфоциты могут быть собраны согласно известным методикам и обогащены или истощены известными способами, такими как аффинное связывание с антителами, такими как проточная цитометрия и/или иммуномагнитная селекция. После стадий обогащения и/или истощения размножение in vitro требуемых T-лимфоцитов может быть осуществлено в соответствии с известными методиками (включая без ограничения методики, описанные в патенте США № 6040177, Riddell et al.) или их вариантами, которые будут очевидны для специалистов в данной области.

Например, требуемая популяция или субпопуляция T-клеток может быть размножена добавлением исходной популяции T-лимфоцитов в культуральную среду in vitro и затем добавлением к культуральной среде питающих клеток, таких как неделящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), (например, так, чтобы полученная в результате популяция клеток содержала по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20 или 40 или более питающих PBMC-клеток на каждый T-лимфоцит в исходной популяции, которую необходимо размножить); и инкубацией культуры (например, в течение периода времени, достаточного для увеличения количества T-клеток). Неделящиеся питающие клетки могут содержать облученные гамма-излучением питающие PBMC-клетки. В некоторых вариантах PBMC облучают гамма-лучами в диапазоне приблизительно от 3000 до 3600 рад. При желании порядок добавления T-клеток и питающих клеток в культуральные среды может быть обратным. Культуру, как правило, можно инкубировать в определенных условиях температуры и тому подобного, которые подходят для роста T-лимфоцитов. Например, для роста T-лимфоцитов человека температура обычно будет составлять по меньшей мере приблизительно 25ºС, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 30°С, более предпочтительно приблизительно 37°С.

T-лимфоциты, подвергаемые размножению, включают цитотоксические T-лимфоциты (CTL) и хелперные T-лимфоциты, которые специфичны по отношению к антигену, присутствующему на опухоли человека, или патогену.

Необязательно, способ размножения может дополнительно включать стадию добавления неделящихся EBV-трансформированных лимфобластоидных клеток (LCL) в качестве питающих клеток. LCL могут быть облучены гамма-лучами в диапазоне от приблизительно 6000 до 10000 рад. Питающие LCL-клетки могут быть в любом подходящем количестве, так, чтобы соотношение между питающими LCL-клетками и исходными T-лимфоцитами составляло по меньшей мере приблизительно 10:1.

Необязательно, способ размножения может дополнительно включать стадию добавления моноклонального анти-CD3-антитела в культуральную среду (например, в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 нг/мл). Необязательно, способ размножения может дополнительно включать стадию добавления IL-2 и/или IL-15 в культуральную среду (при этом концентрация IL-2 составляет, например, по меньшей мере приблизительно 10 единиц/мл).

После выделения T-лимфоцитов как цитотоксические, так и хелперные T-лимфоциты могут быть подвергнуты сортировке на субпопуляции наивных T-клеток, T-клеток памяти и эффекторных T-клеток либо до, либо после размножения.

Клетки CD8+ могут быть получены с применением стандартных способов. В некоторых вариантах клетки CD8+ дополнительно сортируют на наивные клетки, центральные клетки памяти и эффекторные клетки посредством идентификации антигенов клеточной поверхности, которые ассоциированы с каждым из указанных типов клеток CD8+. В некоторых вариантах T-клетки памяти представлены в обеих подгруппах CD62L+ и CD62L- лимфоцитов CD8+ периферической крови. PBMC сортируют на фракции CD62L-CD8+ и CD62L+CD8+ после окрашивания анти-CD8- и анти-CD62L-антителами. В некоторых вариантах экспрессия фенотипических маркеров центральных TCM памяти включает экспрессию CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и CD127, и они являются негативными в отношении гранзима B. В некоторых вариантах центральные T-клетки памяти являются T-клетками CD45RO+, CD62L+, CD8+. В некоторых вариантах эффекторные T_E являются негативными в отношении CD62L, CCR7, CD28 и CD127 и позитивными в отношении гранзима B и перфорина. В некоторых вариантах наивные T-лимфоциты CD8+ характеризуются экспрессией фенотипических маркеров наивных T-клеток, включая CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 и CD45RA.

Являются ли клетки или популяция клеток позитивными в отношении конкретного маркера клеточной поверхности, можно определить проточной цитометрией, используя окрашивание антителом, специфичным по отношению к маркеру поверхности, и совпадающее по изотипу контрольное антитело. Указание того, что популяция клеток является негативной в отношении маркера, означает отсутствие значимого окрашивания популяции клеток специфичным антителом больше, чем в случае контроля изотипа, является позитивной означает равномерное окрашивание популяции клеток больше, чем в случае контроля изотипа. В некоторых вариантах снижение экспрессии одного или нескольких маркеров относится к уменьшению на 1 log10 средней интенсивности флуоресценции и/или уменьшению процентного содержания клеток, на которых обнаруживают маркер по меньшей мере на 20% клеток, 25% клеток, 30% клеток, 35% клеток, 40% клеток, 45% клеток, 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток и 100% клеток и любой % от 20 до 100%, по сравнению с эталонной популяцией клеток. В некоторых вариантах популяция клеток, позитивных по одному или нескольким маркерам, относится к популяции, в которой процентное содержание клеток, на которых обнаруживают маркер, составляет по меньшей мере 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток и 100% клеток и любой % от 50 до 100% по сравнению с эталонной популяцией клеток.

Хелперные T-клетки CD4+ сортируют на наивные, центральные и эффекторные клетки памяти, идентифицируя популяции клеток, которые имеют антигены на клеточной поверхности. Лимфоциты CD4+ могут быть получены стандартными способами. В некоторых вариантах наивные T-лимфоциты CD4+ представляют собой T-клетки CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+. В некоторых вариантах центральные клетки памяти CD4+ являются CD62L-позитивными и CD45RO-позитивными. В некоторых вариантах эффекторные клетки CD4+ являются CD62L- и CD45RO-негативными.

Популяции CD4+ и CD8+, которые являются антиген-специфичными, могут быть получены в результате стимуляции наивных или антиген-специфичных T-лимфоцитов антигеном. Например, могут быть созданы антиген-специфичные клоны T-клеток, специфичные по отношению к антигенам цитомегаловируса, посредством выделения T-клеток из организма инфицированных субъектов и стимуляции клеток in vitro таким же антигеном. Также можно использовать наивные T-клетки. Можно использовать любое количество антигенов из опухолевых клеток, злокачественных клеток или инфекционных агентов. Примеры таких антигенов включают антигены ВИЧ, антигены HCV, антигены HBV, антигены CMV, антигены паразитов и опухолевые антигены, такие как орфановый тирозинкиназный рецептор ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин и CEA. В некоторых вариантах композиции для адаптивной клеточной иммунотерапии применимы при лечении заболевания или нарушения, включая солидную опухоль, гематологическое злокачественное заболевание, меланому или вирусную инфекцию.

Модификация популяций T-лимфоцитов

В некоторых вариантах может быть требоваться введение функциональных генов в T-клетки, используемые для иммунотерапии согласно настоящему изобретению. Например, введенный ген или гены могут повышать эффективность терапии за счет повышения жизнеспособности и/или стимуляции функции переносимых T-клеток; или они могут обеспечивать генетический маркер для осуществления селекции и/или оценки жизнеспособности или миграции in vivo; или они могут включать функции, которые повышают безопасность иммунотерапии, например, делая клетки чувствительными к негативной селекции in vivo, как описано Lupton S.D. et al., Mol. and Cell Biol., 11: 6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992); также см. публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601, Lupton et al., в которых описано применение бифункциональных селектируемых слитых генов, полученных в результате слияния доминантного позитивного селектируемого маркера с негативным селектируемым маркером. Такое введение можно осуществить согласно известным методикам (см., например, патент США № 6040177, Riddell et al., колонки 14-17) или их вариантам, которые будут очевидны для специалистов в данной области на основании настоящего описания.

В некоторых вариантах T-клетки модифицируют химерными рецепторами антигенов (CAR). В некоторых вариантах CAR содержат фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), который получен из вариабельного домена тяжелой (VH) и вариабельного домена легкой (VL) цепи моноклонального антитела (мАт), связанный с цепью TCR CD3+, которая опосредует активацию и цитотоксичность T-клеток. Костимулирующие сигналы также могут быть обеспечены посредством CAR за счет слияния костимулирующего домена CD28 или 4-1BB с цепью CD3+. CAR специфичны по отношению к молекулам клеточной поверхности, независимым от HLA, таким образом преодолеваются ограничения TCR-распознавания, включая ограничения по HLA и низкие уровни экспрессии HLA на опухолевых клетках.

CAR могут быть сконструированы со специфичностью по отношению к любому маркеру клеточной поверхности с использованием антиген-связывающих фрагментов или вариабельных доменов антител, например, молекул антител. Антиген-связывающие молекулы могут быть связаны с одним или несколькими модулями передачи клеточных сигналов. В вариантах осуществления изобретения модули передачи клеточных сигналов включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные домены передачи сигналов CD3 и трансмембранные домены CD28. В вариантах осуществления изобретения внутриклеточный домен передачи сигнала содержит трансмембранный и передающий сигнал домен CD28, связанный с внутриклеточным доменом CD3. В некоторых вариантах CAR также может содержать маркер трансдукции, такой как tEGFR.

В вариантах осуществления изобретения внутриклеточный домен передачи сигнала цитотоксических T-клеток CD8+ является таким же, как и внутриклеточный домен передачи сигнала хелперных T-клеток CD4+. В других вариантах внутриклеточный домен передачи сигнала цитотоксических T-клеток CD8+ отличается от внутриклеточного домена передачи сигнала хелперных T-клеток CD4+.

В некоторых вариантах обе клетки, T-клетка CD8+ и T-клетка CD4+, генетически модифицированы доменом тяжелой цепи антитела, который специфично связывает антиген клеточной поверхности, специфичный для патогена. В вариантах осуществления изобретения CAR являются специфичными по отношению к экспрессируемым на клеточной поверхности антигенам, ассоциированным с патогенами, опухолями или злокачественными клетками. В некоторых вариантах CAR специфичен по отношению к антигенам ВИЧ, антигенам HCV, антигенам HBV, антигенам CMV, антигенам паразитов и опухолевым антигенам, таким как орфановый тирозинкиназный рецептор ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин и CEA. Способы получения CAR описаны в настоящей публикации, и их также можно найти в публикациях 6410319, Forman, и WO 2002/077029, 7446191, 2010/065818, 2010/025177, 2007/059298 и 7514537, Jensen et al., и они описаны Berger C. et al., J. Clinical Investigation, 118: 1 294-308 (2008), при этом все публикации включены в настоящее описание посредством ссылки.

В вариантах осуществления изобретения одинаковые или разные CAR могут быть введены в каждый из T-лимфоцитов CD4+ и CD8+. В вариантах осуществления изобретения CAR в каждой из таких популяций имеет антиген-связывающую молекулу, которая специфично связывается с одним и тем же антигеном. Молекулы клеточной передачи сигнала могут отличаться. В вариантах осуществления изобретения каждая из популяций T-лимфоцитов CD4 или CD8 перед трансдукцией может быть подвергнута сортировке на наивные, центральные клетки памяти, эффекторные клетки памяти или эффекторные клетки. В альтернативных вариантах каждая из популяций T-лимфоцитов CD4 или CD8 перед трансдукцией может быть подвергнута сортировке на наивные, центральные клетки памяти, эффекторные клетки памяти или эффекторные клетки.

В альтернативных вариантах T-клетки могут быть модифицированы рекомбинантным T-клеточным рецептором. TCR может быть специфичным по отношению к любому антигену, патогену или опухоли. Существуют TCR для многих опухолевых антигенов меланомы (например, MART1, gp100), лейкоза (например, WT1, минорные антигены гистосовместимости), рака молочной железы (например, her2, NY-BR1).

Были разработаны различные способы инфекции, в которых используют рекомбинантные инфекционные вирусные частицы для доставки генов. Такой способ представляет предпочтительный в настоящее время подход к трансдукции T-лимфоцитов согласно настоящему изобретению. Вирусные векторы, которые были использованы таким образом, включают вирусные векторы, полученные из вируса обезьян 40, аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV), лентивирусных векторов и ретровирусов. Таким образом, способы переноса и экспрессии генов многочисленны, но основной их функцией является введение и экспрессия генетического материала в клетках млекопитающих. Несколько из указанных выше способов применяли для трансдукции гематопоэтических или лимфоидных клеток, включая трансфекцию с использованием фосфата кальция, слияние протопластов, электропорацию и инфекцию векторами на основе рекомбинантных аденовирусов, аденоассоциированных вирусов и ретровирусов. Первичные T-лимфоциты были успешно трансдуцированы электропорацией и инфекцией ретровирусами.

Ретровирусные векторы обеспечивают высокоэффективный способ переноса генов в эукариотические клетки. Кроме того, интеграция ретровирусов происходит контролируемым образом и приводит к стабильной интеграции одной или нескольких копий новой генетической информации в клетку.

Предполагается, что сверхэкспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для индивидуума, подвергаемого лечению. Поэтому в объем изобретения включены генные участки, которые вынуждают T-клетки согласно изобретению быть чувствительными к негативной селекции in vivo. Под негативной селекцией подразумевают, что инфузированная клетка может быть элиминирована в результате изменения состояния индивидуума in vivo. Негативный селектируемый фенотип может быть результатом инсерции гена, который придает чувствительность к вводимому агенту, например, соединению. Негативные селектируемые гены известны в данной области и включают наряду с прочими следующие гены: ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа I (TK HSV-I) (Wigler et al., Cell 11: 223, 1977), который придает чувствительность к ганцикловиру; клеточный ген гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), клеточный ген аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), ген бактериальной цитозиндезаминазы (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 33 (1992)).

В некоторых вариантах может быть полезным включение в T-клетки позитивного маркера, который делает возможным отбор клеток с негативным селектируемым фенотипом in vitro. Позитивный селектируемый маркер может представлять собой ген, который при введении в клетку-хозяина экспрессирует доминантный фенотип, обеспечивающий возможность позитивной селекции клеток, несущих ген. Гены такого типа известны в данной области и включают наряду с прочими ген гигромицин-B-фосфотрансферазы (hph), который придает резистентность к гигромицину B, ген аминогликозидфосфотрансферазы (neo или aph) из Tn5, который кодирует резистентность к антибиотику G418, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), ген аденозиндезаминазы (ADA) и ген множественной лекарственной резистентности (MDR).

Предпочтительно позитивный селектируемый маркер и негативный селектируемый элемент связаны так, чтобы утрата негативного селектируемого элемента также обязательно сопровождалась утратой позитивного селектируемого маркера. Еще более предпочтительно позитивные и негативные селектируемые маркеры сливают так, чтобы утрата одного обязательно приводила к утрате другого. Примером слитого полинуклеотида, который дает в качестве продукта экспрессии полипептид, который придает требуемые признаки как для позитивной, так и для негативной селекции, описанные выше, является слитый ген гигромицинфосфотрансферазы-тимидинкиназы (HyTK). Экспрессия такого гена дает полипептид, который придает резистентность к гигромицину B для позитивной селекции in vitro и чувствительность к ганцикловиру для негативной селекции in vivo. См. публикацию Lupton S.D. et al., Mol. and Cell. Biology 11: 3374-3378, 1991. Кроме того, в предпочтительных вариантах полинуклеотиды согласно изобретению, кодирующие химерные рецепторы, находятся в ретровирусных векторах, содержащих слитый ген, особенно таких, которые придают резистентность к гигромицину B для позитивной селекции in vitro и чувствительности к ганцикловиру для негативной селекции in vivo, например, ретровирусном векторе HyTK, описанном в публикации Lupton, S.D. et al. (1991), указанной выше. Также см. публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601, S.D. Lupton, описывающие применение бифункциональных селектируемых слитых генов, полученных в результате слияния доминантных позитивных селектируемых маркеров с негативными селектируемыми маркерами.

Предпочтительные позитивные селектируемые маркеры получают из генов, выбранных из группы, состоящей из hph, nco и gpt, и предпочтительные негативные селектируемые маркеры получают из генов, выбранных из группы, состоящей из цитозиндезаминазы, TK HSV-I, TK VZV, HPRT, APRT и gpt. Особенно предпочтительными маркерами являются бифункциональные селектируемые слитые гены, при этом позитивный селектируемый маркер получен из hph или neo, а негативный селектируемый маркер получен из цитозиндезаминазы или гена TK или селектируемого маркера.

Можно применять множество способов для трансдукции T-лимфоцитов, которые хорошо известны в данной области. Например, ретровирусные трансдукции могут быть осуществлены следующим образом: в 1-й день после стимуляции с использованием REM, как описано в настоящей публикации, клетки обеспечивают 20-30 единицами/мл IL-2; на 3-й день заменяют половину среды супернатантом ретровирусов, полученным согласно стандартным способам, и затем добавляют в культуры 5 мкг/мл полибрена и 20-30 единиц/мл IL-2; на 4-й день промывают клетки и помещают их в свежую культуральную среду с добавлением 20-30 единиц/мл IL-2; на 5-й день повторяют экспозицию с ретровирусом; на 6-й день помещают клетки в селективную среду (содержащую, например, антибиотик, соответствующий гену резистентности к антибиотикам, имеющемуся в ретровирусном векторе) с добавлением 30 единиц/мл IL-2; на 13-й день отделяют видимые живые клетки от мертвых клеток, используя разделение в градиенте плотности фиколл-гипак, и затем субклонируют живые клетки.

Клетки CD4+ и CD8+ могут быть модифицированы экспрессирующим вектором, кодирующим CAR. В вариантах осуществления изобретения такие клетки затем дополнительно сортируют на субпопуляции наивных, центральных клеток памяти и эффекторных клеток, как описано выше, за счет сортировки антигенов клеточной поверхности, уникальных для каждой из таких популяций клеток. Кроме того, популяции клеток CD4+ или CD8+ могут быть подвергнуты селекции на основе профиля их цитокинов или пролиферативных активностей. Например, могут быть отобраны T-лимфоциты CD4+, которые имеют повышенную продукцию таких цитокинов, как IL-2, IL-4, IL-10, TNFα и IFNγ по сравнению с ложно трансдуцированными клетками или трансдуцированными клетками CD8+. В других вариантах отбирают наивные T-клетки CD4+, которые имеют повышенную продукцию IL-2 и/или TNFα. Подобным образом отбирают клетки CD8+, которые имеют повышенную продукцию IFNγ по сравнению с ложно трансдуцированными клетками CD8+.

В вариантах осуществления изобретения отбирают клетки CD4+ и CD8+, которые пролиферируют в ответ на антиген. Например, отбирают клетки CD4+, которые энергично пролиферируют при стимуляции антигеном по сравнению с ложно трансдуцированными клетками или трансдуцированными клетками CD8+.

В некоторых вариантах отбирают клетки CD4+ и CD8+, которые являются цитотоксическими для клеток, несущих антиген. В вариантах осуществления изобретения предполагают, что CD4+ являются слабо цитотоксическими по сравнению с клетками CD8+.

В изобретении предполагается, что в композициях будут использованы сочетания T-клеток CD4+ и CD8+. В одном варианте сочетания CAR-трансдуцированные клетки CD4+ можно объединять с антиген-реактивными клетками CD8+ с такой же антигенной специфичностью, что и CAR. В других вариантах CAR-трансдуцированные клетки CD8+ клетки объединяют с антиген-реактивными клетками CD4+. В еще одном варианте объединяют CAR-модифицированные клетки CD4+ и CD8+.

Как описано в настоящей публикации, в изобретении предполагается, что клетки CD4+ и CD8+ могут быть дополнительно разделены на субпопуляции, такие как популяции наивных клеток, центральных клеток памяти и эффекторных клеток. Как описано в настоящей публикации, в некоторых вариантах наивные клетки CD4+ являются T-клетками CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+. В некоторых вариантах центральные клетки памяти CD4+ являются CD62L-позитивными и CD45RO-позитивными. В некоторых вариантах эффекторные клетки CD4+ являются CD62L негативными и CD45RO-позитивными. Каждая из таких популяций независимо может быть модифицирована с использованием CAR.

Как описано в настоящей публикации, в вариантах осуществления изобретения T-клетки памяти присутствуют как в подгруппе CD62L+, так и в подгруппе CD62L- лимфоцитов CD8+ периферической крови. PBMC сортируют на фракции CD62L-CD8+ и CD62L+CD8+ после окрашивания анти-CD8- и анти-CD62L-антителами. В некоторых вариантах экспрессия фенотипических маркеров центральных клеток памяти TCM включает CD62L, CCR7, CD28, CD3 и CD127, и они являются негативными в отношении гранзима B. В некоторых вариантах центральные T-клетки памяти представляют собой T-клетки CD45RO+, CD62L+, CD8+. В некоторых вариантах эффекторные T_E являются негативными в отношении CD62L, CCR7, CD28 и CD127 и позитивными в отношении гранзима B и перфорина. В некоторых вариантах наивные T-лимфоциты CD8+ характеризуются CD8+, CD62L+, CD45RO+, CCR7+, CD28+, CD127+ и CD45RO+. Каждая из таких популяций независимо может быть модифицирована CAR.

Каждая из субпопуляций клеток CD4+ и CD8+ может быть объединена с другой. В конкретном варианте модифицированные наивные клетки CD4+ объединяют с модифицированными центральными T-клетками памяти CD8+, чтобы получить синергетическое цитотоксическое действие на клетки, несущие антиген, такие как опухолевые клетки.

Способы

Изобретение относится к способам получения композиций для адаптивной иммунотерапии и применениям или способам применения таких композиций для осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или нарушение.

В вариантах осуществления изобретения способ производства композиций включает получение модифицированной хелперной T-клетки CD4+, при этом препарат модифицированных хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала.

В другом варианте способ дополнительно включает получение модифицированной цитотоксической T-клетки CD8+, при этом препарат модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов содержит клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В другом варианте способ включает получение модифицированной цитотоксической T-клетки CD8+, при этом препарат модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора, и, кроме того, способ дополнительно включает объединение модифицированных цитотоксических T-клеток CD8+ с препаратом антиген-специфичных хелперных лимфоцитов CD4+.

Препарат клеток CD4+ и CD8+, которые модифицированы с использованием CAR, описаны выше, а также описаны в примерах. Антиген-специфичные T-лимфоциты могут быть получены от пациента, имеющего заболевание или нарушение, или могут быть получены стимуляцией T-лимфоцитов in vitro в присутствии антигена. Субпопуляции T-лимфоцитов CD4+ и CD8+ также могут быть выделены, как описано в настоящей публикации, и объединены при осуществлении способов производства.

Изобретение также относится к способам осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или нарушение, включающим введение композиции по любому из пп. 1-19. В других вариантах способ включает введение субъекту препарата генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, при этом препарат цитотоксических T-лимфоцитов содержит T-клетки CD8+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного или других рецепторов, и препарат генетически модифицированных хелперных T-лимфоцитов, который вызывает прямое распознавание опухоли и усиливает способность препаратов генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов опосредовать клеточный иммунный ответ, при этом препарат хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный домен передачи сигнала T-клеточного рецептора.

В другом варианте способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или нарушение, включает введение субъекту препарата генетически модифицированных хелперных T-лимфоцитов, при этом препарат модифицированных хелперных T-лимфоцитов содержит T-клетки CD4+, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный модуль передачи сигнала T-клеточного рецептора. В вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает введение субъекту препарата генетически модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов, при этом препарат модифицированных цитотоксических T-лимфоцитов содержит CD8-позитивные клетки, которые имеют химерный рецептор антигена, содержащий внеклеточный вариабельный домен антитела, специфичный по отношению к антигену, ассоциированному с заболеванием или нарушением, и внутриклеточный модуль передачи сигнала T-клеточного рецептора.

Другой вариант описывает способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или нарушение, включающий анализ биологического образца субъекта в отношении присутствия антигена, ассоциированного с заболеванием или нарушением, и введение композиций для адаптивной иммунотерапии, описанных в настоящей публикации, при этом химерный рецептор антигена специфично связывается с антигеном.

Получают CAR, который имеет компонент, который обеспечивает специфичное связывание с антигеном, ассоциированным с заболеванием или состоянием, таким как солидная опухоль, злокачественная опухоль, вирусная инфекция и инфекция паразитом. В вариантах осуществления изобретения внутриклеточный модуль передачи сигнала T-клеточного рецептора химерного рецептора антигена содержит трансмембранный домен, домен передачи сигнала CD28 и внутриклеточный домен передачи сигнала CD3 или другие домены костимулирующих молекул T-клеток. В некоторых вариантах молекула внутриклеточной передачи сигнала содержит внутриклеточный домен CD3, домен CD28, трансмембранный и передающий сигнал домен CD28, связанный с внутриклеточным доменом CD3, или другие домены костимулирующих молекул T-клеток.

В альтернативных вариантах T-клетки могут быть модифицированы рекомбинантным T-клеточным рецептором. TCR может быть специфичным по отношению к любому антигену, патогену или опухоли. Существуют TCR для многих опухолевых антигенов меланомы (например, MART1, gp100), лейкоза (например, WT1, минорные антигены гистосовместимости), рака молочной железы (например, her2, NY-BR1).

В некоторых вариантах хелперный T-лимфоцит CD4+ выбран из группы, состоящей из наивных T-клеток CD4+, центральных T-клеток памяти CD4+, эффекторных T-клеток памяти CD4+ или суммарной популяции T-клеток CD4+. В конкретном варианте хелперный лимфоцит CD4+ представляет собой наивную T-клетку CD4+, при этом наивная T-клетка CD4+ включает T-клетку CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+. В следующих вариантах цитотоксический T-лимфоцит CD8+ выбран из группы, состоящей из наивных T-клеток CD8+, центральных T-клеток памяти CD8+, эффекторных T-клеток памяти CD8+ или суммарной популяции T-клеток CD8+. В конкретном варианте цитотоксический T-лимфоцит CD8+ представляет собой центральную T-клетку памяти, при этом центральная T-клетка памяти включает T-клетку CD45RO+, CD62L+, CD8+. В конкретном варианте цитотоксический T-лимфоцит CD8+ представляет собой центральную T-клетку памяти и хелперный T-лимфоцит CD4+ представляет собой наивную T-клетку CD4+.

В вариантах осуществления изобретения обе клетки, T-клетка CD8+ и T-клетка CD4+, генетически модифицированы CAR-содержащим доменом тяжелой цепи антитела, который специфично связывает патоген или специфичный для опухоли антиген клеточной поверхности. В других вариантах внутриклеточный домен передачи сигнала цитотоксических T-клеток CD8 является таким же, как внутриклеточный домен передачи сигнала хелперных T-клеток CD4. В следующих вариантах внутриклеточный домен передачи сигнала цитотоксических T-клеток CD8 отличается от внутриклеточного домена передачи сигнала хелперных T-клеток CD4.

Субъектами, которых можно лечить согласно настоящему изобретению, в общем, являются человек и, в ветеринарных целях, другие приматы, такие как мартышки и человекообразные обезьяны, Субъекты могут быть мужского или женского пола и любого подходящего возраста, включая новорожденных, детей, подростков, взрослых и пожилых субъектов.

Способы применимы для лечения, например, солидной опухоли, гематологического злокачественного заболевания, меланомы или инфекции, вызванной вирусом или другим патогеном. Инфекции, вызванные патогенами, включают инфекции ВИЧ, HCV, HBV, CMV и паразитарные заболевания. В некоторых вариантах антиген, ассоциированный с заболеванием или нарушением, выбран из группы, состоящей из орфанового тирозинкиназного рецептора ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA и поверхностного антигена гепатита B.

Субъекты, которых можно лечить, включают субъектов, пораженных злокачественной опухолью, включая, без ограничения, рак ободочной кишки, легкого, печени, молочной железы, простаты, яичника, кожи (включая меланому), кости и головного мозга и т.д. В некоторых вариантах ассоциированные с опухолью антигены известны, например, в случае меланомы, рака молочной железы, плоскоклеточной карциномы, рака ободочной кишки, лейкоза, миеломы, рака простаты и т.д. (в таких вариантах T-клетки памяти могут быть выделены или сконструированы путем введения генов T-клеточного рецептора). В других вариантах ассоциированные с опухолью белки могут быть мишенью генетически модифицированных T-клеток, экспрессирующих сконструированный иммунорецептор. Примеры включают, без ограничения, B-клеточную лимфому, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз.

Субъекты, которых можно лечить, также включают субъектов, пораженных инфекционным заболеванием, или субъектов, для которых существует риск развития инфекционного заболевания, включая, без ограничения, вирусные, ретровирусные, бактериальные и протозойные инфекции и т.д. Субъекты, которых можно лечить, включают пациентов с иммунным дефицитом, пораженных вирусной инфекцией, включая, без ограничения, цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), аденовирус, полиомавирус BK у пациентов с трансплантатами и т.д.

Клетки, полученные, как описано выше, можно использовать в способах и композициях для адаптивной иммунотерапии согласно известным методикам или их вариантам, которые будут очевидны для специалистов в данной области на основании настоящего описания. См., например, публикацию заявки на выдачу патента США № 2003/0170238, Gruenberg et al.; также см. патент США № 4690915, Rosenberg.

В некоторых вариантах клетки готовят, сначала собирая их из их культуральной среды и затем промывая и концентрируя клетки в среде и системе для упаковки, подходящих для введения (фармацевтически приемлемый носитель) в эффективном для лечения количестве. Подходящей средой для инфузии может быть любой препарат изотонической среды, обычно можно использовать физиологический раствор соли, Normosol R (Abbott) или Plasma-Lyte A (Baxter), а также 5% декстрозу в воде или лактат Рингера. Среда для инфузии может быть дополнена человеческим сывороточным альбумином.

Эффективное для лечения количество клеток в композиции составляет по меньшей мере 2 клетки (например, 1 центральная T-клетка памяти CD8+ и 1 T-клетка подгруппы хелперов CD4+) или чаще более чем 10² клеток и до 10⁶, вплоть до и включая 10⁸ или 10⁹ клеток, и может составлять более чем 10¹⁰ клеток. Количество клеток будет зависеть от конечного применения, для которого композиция предназначена, а также типа включенных в нее клеток. Например, если требуются клетки, которые специфичны для конкретного антигена, то популяция будет содержать более 70%, обычно более 80%, 85% и 90-95% таких клеток. Для применений, предлагаемых в настоящем изобретении, клетки обычно содержатся в объеме 1 л или менее, может быть 500 мл или менее, даже 250 мл или 100 мл или менее. Поэтому плотность требуемых клеток обычно более 10⁶ клеток/мл и обычно более 10⁷ клеток/мл, обычно 10⁸ клеток/мл или более. Клинически подходящее количество иммунных клеток может быть распределено на несколько инфузий, и их количество в совокупности равно или превышает 10⁹, 10¹⁰ или 10¹¹ клеток.

В некоторых вариантах лимфоциты согласно изобретению могут быть использованы для придания иммунитета индивидуумам. Под «иммунитетом» подразумевают уменьшение одного или нескольких физических симптомов, ассоциированных с ответом на инфекцию, вызванную патогеном, или на опухоль, к которым направлен ответ лимфоцитов. Количество вводимых клеток обычно находится в диапазоне, имеющем место у нормальных индивидуумов, которые обладают иммунитетом к патогену. Таким образом, клетки обычно вводят посредством инфузии, при этом каждую инфузию осуществляют в диапазоне от 2 клеток до по меньшей мере 10⁶-10¹⁰ клеток/м², предпочтительно в диапазоне по меньшей мере от 10⁷ до 10⁹ клеток/м². Клоны можно вводить в виде однократной инфузии или множества инфузий в течение определенного периода времени. Однако поскольку разные индивидуумы, как предполагают, отличаются по чувствительности, тип и количество инфузируемых клеток, а также количество инфузий и период времени, на протяжении которого проводят множественные инфузии, определяет лечащий врач, и определение может быть осуществлено при обычном экспериментировании. Создание достаточных уровней T-лимфоцитов (включая цитотоксические T-лимфоциты и/или хелперные T-лимфоциты) легко достижимо с использованием способа быстрого размножения согласно настоящему изобретению, который проиллюстрирован в настоящем описании. См., например, патент США № 6040177, Riddell et al., колонка 17.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в примерах, приведенных ниже.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ

Пример 1: Трансдукция T-клеток и анализ экспрессии CAR

ROR1-специфичный CAR может быть экспрессирован в T-клетках CD8+ человека, и он обеспечивает специфичное распознавание B-клеточных опухолей ROR1+, но не зрелых нормальных B-клеток. Авторы сконструировали ROR1-специфичный химерный рецептор антигена, который при экспрессии в T-клетках от здоровых доноров или CLL-пациентов придавал способность к специфичному распознаванию первичного B-CLL и лимфомы из клеток мантийной зоны.

Материалы и способы

Линии клеток

Трансформированные вирусом Эпштейна-Барр B-клетки (EBV-LCL) получали, как описано (25). Линии опухолевых клеток Jeko-1 и BALL-1 предоставлены докторами Oliver Press и Jerald Radich (Онкологического исследовательского центра имени Фреда Хатчинсона). Все линии клеток поддерживали в RPMI, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 0,8 мМ L-глутамин и 1% пенициллин-стерптомицин (среда LCL). Клетки K562 получали из Американской коллекции типов культур.

Трансфекция клеток K562 с использованием ROR1

Для основанной на полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации ROR1-гена получали суммарную РНК из клеток B-CLL (набор RNeasyPlus; QIAGEN) и обратно транскрибировали в кДНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen). ПЦР осуществляли со специфичными праймерами

(ROR1-F: 5-XhoIAGAGGAGGAATGCACCGGCC-3 и

ROR1-R: 5-XhoI-CACAGAAGGTACTTGTTGCGATGT-3),

используя ДНК-полимеразу Herculase-II (Stratagene). ПЦР-продукт клонировали в ретровирусном векторе MIGR-1 (23) и последовательность подтверждали. Реагент для трансформации Effectene (QIAGEN) использовали для того, чтобы трансфицировать клетки Platinum-A (Cell Biolabs) MIGR-1/ROR1 и получить ROR1-кодирующий ретровирус. Клетки K562 трансдуцировали ретровирусом, используя центрифугирование при 2500 об/мин в течение 60 минут при 32°C, размножали и очищали ROR1-позитивную подгруппу, используя сортировку.

Количественная ПЦР в реальном времени

Первую нить кДНК B-CLL, нормальных неактивированных и активированных B-клеток и EBV-LCL получали, как описано в предыдущем абзаце. Первую нить кДНК из нормальных тканей (панели тканей человека I/II, фракции крови) получали из Clontech. Экспрессию мРНК ROR1 анализировали в двух повторах и нормализовали по отношению к GAPDH. Амплификации осуществляли на устройстве ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) в 50 мкл реакционной смеси, состоящей из 25 мкл основной смеси для ПЦР Power SYBR Green (Applied Biosystems), 2,5 нг кДНК и 300 нМ специфичных для гена прямых и обратных праймеров:

ROR1-F 5-AGCGTGCGATTCAAAGGATT-3,

ROR1-R 5-GACTGGTGCCGACGATGACT-3,

GAPDH-F 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3,

и GAPDH-R 5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3.

Пороговый цикл (Ct) определяли, используя компьютерную программу SDS v2.2.2 (Applied Biosystems), и уровень экспрессии генов вычисляли, используя способ сравнения Ct (2-(ΔΔCt)).

Конструирование векторов и создание лентивируса

Лентивирусные векторы, кодирующие CD20-CAR (CD20R-epHIV7) и зеленый флуоресцирующий белок (GFP), (GFP-epHIV7), описаны ранее (24). ROR1-CAR кодировали в таком же векторе. Мышиное мАт (клон 2A2), которое, как было показано, специфично связывается с ROR1 человека, экспрессируемым на первичных опухолевых линиях B-CLL и MCL, создавали, клонировании и характеризовали в предыдущем исследовании. Оптимизированную по кодонам нуклеотидную последовательность, кодирующую scFv, содержащий VL- и VH-цепи мАт 2A2, синтезировали (GENEART) и клонировали в CD20R-epHIV7, используя сайты рестрикции NheI и RsrII, чтобы заменить CD20-специфичный scFv. Лентивирус продуцировали в клетках 293T, котрансфицированных лентивирусным вектором и пакующими векторами pCHGP-2, pCMVRev2 и pCMV-G, используя Effectene (Qiagen). Среду меняли через 16 часов после трансфекции и лентивирусы собирали через 48 часов.

Лентивирусная трансдукция и выделение CAR-трансдуцированных T-клеточных клонов

PBMC от здоровых доноров и пациентов с B-CLL и очищенные сортировкой центральные T-клетки памяти (TCM) CD8+CD45RO+CD62L+ активировали, используя анти-CD3-мАт (30 нг/мл) (25), и трансдуцировали в супернатанте с лентивирусами с добавлением 1 мкг/мл полибрена (Sigma-Aldrich) и 50 ME(IU)/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2) человека на 2-й и 3-й день после активации, центрифугируя при 2500 об./мин в течение 60 минут при 32°C. T-клетки размножали в RPMI, содержащей 10% сыворотки человека, 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (среда CTL) (25). После размножения аликвоту каждой линии трансдуцированных T-клеток красили конъюгированным с биотином анти-EGFR-мАт (против рецептора эпителиального фактора роста), стрептавидином-PE и анти-CD8-мАт. T-клетки EGFR+CD8+ очищали сортировкой и клонировали лимитирующим разведением (0,5 клеток/лунка) (25). ROR1-CAR-трансдуцированные T-клетки идентифицировали по окрашиванию биотинилированным рекомбинантным слитым белком Fc-внеклеточный домен ROR1 и стрептавидином-PE. Рекомбинантный ROR1-белок получали во временно трансфицированных клетках 293F (Invitrogen), очищали, как описано (26), и биотинилировали, используя набор BiotinTag (Sigma). GFP-трансдуцированные T-клетки CD8+ идентифицировали с использованием проточной цитометрии, очищали сортировкой и клонировали сходным образом.

Анализы высвобождения хрома и секреции цитокинов

Клетки-мишени метили ⁵¹Cr (PerkinElmer) в течение ночи, промывали и инкубировали в трех повторах по 1-2×10³ клеток/лунка с эффекторными T-клетками в разных соотношениях между эффекторными клетками и клетками-мишенями (E:T). Супернатанты собирали для подсчета гамма-излучения после 4-часовой инкубации и специфичный лизис вычисляли, используя стандартную формулу (25).

Результаты

Трансдуцированные T-клетки CD8+ очищали сортировкой, используя биотинилированное анти-EGFR-мАт и конъюгированные со стрептавидином красители. Экспрессию ROR1-CAR на поверхности очищенных сортировкой T-клеток оценивали окрашиванием клеток биотинилированным рекомбинантным слитым белком Fc-внеклеточный домен ROR1, который непосредственно связывается с scFv ROR1-CAR, и совместным окрашиванием конъюгатами стрептавидина. Белок Fc-ROR1 специфично окрашивал T-клетки CD8+, трансдуцированные лентивирусным вектором ROR1-CAR, но не окрашивал T-клетки CD8+, трансдуцированные контрольным лентивирусным вектором, кодирующим GFP (фиг. 1).

Авторы создали ROR1-CAR трансдуцированные (n=10) и контрольные GFP-трансдуцированные клоны T-клеток CD8+ (n=4), используя лимитирующее разведение, и подтвердили стабильную поверхностную экспрессию CAR после множества раундов размножения in vitro. Не было явного различия в росте ROR1-CAR-трансдуцированных по сравнению с нетрансдуцированными или GFP-трансдуцированными клонами T-клеток (данные не показаны).

ROR1-CAR трансдуцированные клоны T-клеток эффективно лизировали первичные B-CLL- и K562-клетки, которые были стабильно трансфицированы геном ROR1, но не лизировали наивные, ROR1-негативные клетки K562, что свидетельствует о специфичном распознавании ROR1 (фиг. 2).

Обсуждение

Адоптивная иммунотерапия, в которой используют CAR-модифицированные T-клетки, подвергается исследованию в клинических испытаниях в случае B-клеточных злокачественных заболеваний. Поверхностные молекулы, которые представляют собой мишени, являются специфичными для B-клеточной линии и включают CD19, который экспрессируется на нормальных клетках B-линии от стадии про-B-клеток до плазматических клеток, и CD20, который экспрессируется на нормальных B-клетках от стадии пре-B-клетки до B-клетки памяти. Таким образом, предполагаемым результатом эффективной терапии, нацеленной на такие молекулы, является истощение популяций нормальных B-клеток и B-клеточных предшественников. В исследованиях профиля экспрессии генов идентифицировали гены, которые преимущественно или исключительно экспрессировались злокачественными, но не экспрессировались нормальными B-клетками, и ROR1 выявлен в качестве характерного для CLL гена в 2 независимых анализах (27,28). Специфичные антитела к ROR1, вырабатываемые у пациентов с CLL после вакцинации аутологичными опухолевыми клетками, которые были модифицированы так, чтобы они экспрессировали CD154, и лечение леналидомидом без видимой токсичности для нормальных тканей, свидетельствуют о том, что такой опухолевый антиген может быть подходящей мишенью для иммунотерапии (29,30).

Исследования авторов показывают возможность целенаправленного воздействия на ROR1-позитивные злокачественные клетки сконструированными T-клетками, экспрессирующими ROR1-CAR. T-клетки CD8+ ROR1-CAR могут быть получены как от здоровых доноров, так и от пациентов с CLL после лентивирусной трансдукции либо общей популяции PBMC, либо очищенных сортировкой TCM, которые в животных моделях существуют в течение длительных периодов времени после адоптивного переноса (31). ROR1-CAR трансдуцированные T-клетки эффективно лизировали первичные B-CLL, но не лизировали нормальные неактивированные или активированные B-клетки. Такие T-клетки продуцировали эффекторные цитокины, включая TNF-α, IFNγ и IL-2, и были способны пролиферировать в ответ на ROR1-экспрессирующие опухолевые клетки.

Пример 2: Создание линий T-клеток CD4+ CAR и анализ эффекторной функции

T-клетки CD4+ ROR1-CAR могут быть получены из PBMC здоровых доноров/CLL-пациентов. ROR1-специфичный CAR может быть экспрессирован в T-клетках CD4+ человека и придает способность к специфичному распознаванию B-клеточных опухолей ROR1+, но не зрелых нормальных B-клеток.

Материалы и способы

Клеточные линии

Трансформированные вирусом Эпштейна-Барр B-клетки (EBV-LCL) создавали, как описано (25). Линии опухолевых клеток Jeko-1 и BALL-1 предоставлены докторами Oliver Press и Jerald Radich (Онкологического исследовательского центра имени Фреда Хатчинсона). Все линии клеток поддерживали в RPMI, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 0,8 мМ L-глутамин и 1% пенициллин-стрептомицин (среда LCL). Клетки K562 и 293T получали из Американской коллекции типов культур и культивировали, как указано.

Трансфекция клеток K562 с использованием ROR1

Для основанной на полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации ROR1-гена получали суммарную РНК из клеток B-CLL (набор RNeasyPlus; QIAGEN) и обратно транскрибировали в кДНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen). ПЦР осуществляли со специфичными праймерами

(ROR1-F: 5-XhoIAGAGGAGGAATGCACCGGCC-3 и

ROR1-R: 5-XhoI-CACAGAAGGTACTTGTTGCGATGT-3),

используя ДНК-полимеразу Herculase-II (Stratagene). ПЦР-продукт клонировали в ретровирусном векторе MIGR-1 (23) и последовательность подтверждали. Реагент для трансформации Effectene (QIAGEN) использовали для того, чтобы трансфицировать клетки Platinum-A (Cell Biolabs) MIGR-1/ROR1 и получить ROR1-кодирующий ретровирус. Клетки K562 трансдуцировали ретровирусом, используя центрифугирование при 2500 об/мин в течение 60 минут при 32°C, размножали и очищали ROR1-позитивную подгруппу, используя сортировку.

Конструирование вектора и создание лентивируса

Лентивирусные векторы, кодирующие CD20-CAR (CD20R-epHIV7) и зеленый флуоресцирующий белок (GFP), (GFP-epHIV7), описаны ранее (24). ROR1-CAR кодировали в таком же векторе. Мышиное мАт (клон 2A2), которое, как было показано, специфично связывается с ROR1 человека, экспрессируемым на первичных опухолевых линиях B-CLL и MCL, создавали, клонировали и характеризовали в предыдущем исследовании. Оптимизированную по кодонам нуклеотидную последовательность, кодирующую scFv, содержащий VL- и VH-цепи мАт 2A2, синтезировали (GENEART) и клонировали в CD20R-epHIV7, используя сайты рестрикции NheI и RsrII, чтобы заменить CD20-специфичный scFv. Лентивирус продуцировали в клетках 293T, котрансфицированных лентивирусным вектором и пакующими векторами pCHGP-2, pCMVRev2 и pCMV-G, используя Effectene (Qiagen). Среду меняли через 16 часов после трансфекции и лентивирусы собирали через 48 часов.

Лентивирусная трансдукция и выделение линий T-клеток CD4+ RoR1-CAR

T-клетки CD4+ выделяли из PBMC здоровых доноров и активировали моноклональными антителами против CD3 (30 нг/мл) (25) и трансдуцировали в супернатанте с лентивирусами с добавлением 1 мкг/мл полибрена (Sigma-Aldrich) и 50 IU/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2) человека на 2-й и 3-й день после активации, центрифугируя при 2500 об./мин в течение 60 минут при 32°C. T-клетки размножали в RPMI, содержащей 10% сыворотки человека, 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (среда CTL) (25). После размножения аликвоту каждой линии трансдуцированных T-клеток красили конъюгированным с биотином анти-EGFR-мАт (против рецептора эпителиального фактора роста), стрептавидином-PE и анти-CD4-мАт. T-клетки EGFR+CD4+ очищали сортировкой и размножали. ROR1-CAR-трансдуцированные T-клетки идентифицировали по окрашиванию биотинилированным рекомбинантным слитым белком Fc-внеклеточный домен ROR1 и стерптавидином-PE. Рекомбинантный ROR1-белок получали во временно трансфицированных клетках 293 (Invitrogen), очищали, как описано (26), и биотинилировали, используя набор BiotinTag (Sigma). GFP-трансдуцированные T-клетки CD4+ идентифицировали с использованием проточной цитометрии, очищали сортировкой и клонировали сходным образом.

Анализы высвобождения хрома и секреции цитокинов

Клетки-мишени метили ⁵¹Cr (PerkinElmer) в течение ночи, промывали и инкубировали в трех повторах по 1-2×10³ клеток/лунка с эффекторными T-клетками в разных соотношениях между эффекторными клетками и клетками-мишенями (E:T). Супернатанты собирали для γ-подсчета после 4-часовой инкубации и специфичный лизис вычисляли, используя стандартную формулу (25). Для анализа секреции цитокинов клетки-мишени и эффекторные клетки трижды высевали в лунки в соотношении E/T 2:1, и интерферон INFγ, фактор некроза опухолей (TNF-α) и IL-2 измеряли в мультиплексном имуноанализе цитокинов (Luminex) в супернатанте, извлеченном после 24-часовой инкубации.

Анализ пролиферации с использованием CFSE

T-клетки метили с использованием 0,2 мкМ сложного карбоксифлуоресцеинсукцинимидилового эфира (CFSE; Invitrogen), промывали и высевали со стимулирующими клетками в соотношении 2:1 в среде CTL, содержащей 10 единиц/мл рекомбинантного IL-2 человека. После 72-часовой инкубации клетки метили, используя анти-CD4-мАт и йодид пропидия (PI), чтобы исключить мертвые клетки из анализа. Образцы анализировали проточной цитометрией и клеточное деление живых T-клеток CD4+ оценивали, используя разведение CFSE.

Анализ совместного культивирования

ROR1-CAR-трансдуцированные T-клетки CD4+ и ROR1-CAR-трансдуцированные цитотоксические T-лимфоциты CD8+ метили CFSE и культивировали совместно в соотношении 2:1, 1:1 и 1:2. Затем совместные культуры стимулировали клетками K562/ROR1 и контрольными клетками K562 и пролиферацию клеток измеряли в анализе с разведением красителя CFSE после 5 дней инкубации. Для проточного анализа образцы красили конъюгированным анти-CD8-мАт и анти-CD4-мАт, чтобы отличить подгруппы CD8+ и CD4+.

Результаты

Создание T-клеток CD4+ ROR1-CAR из PBMC здоровых доноров и CLL-пациентов

Авторы показали, что ROR1, онкофетальный тирозинкиназный рецептор, одинаково экспрессируется на CLL и MCL, и разработали ROR1-CAR из анти-ROR1-мАт, который придает способность к специфичному распознаванию злокачественных, но не зрелых нормальных B-клеток при экспрессии в T-клетках CD8+ (32). В настоящем изобретении авторы создали T-клетки CD4+ ROR1-CAR для анализа прямого распознавания опухоли и их способности усиливать CTL CD8+ ROR1-CAR. CAR-модифицированные T-клетки CD4+ могут быть легко созданы из общей популяции периферических T-клеток CD4+ от здоровых доноров (n=4) и CLL-пациентов (n=4) с использованием лентивирусного вектора, кодирующего ROR1-CAR. В таком векторе авторы кодировали укороченный домен EGFR (рецептора эпителиального фактора роста, tEGFR) ниже ROR1-CAR и самоотщепляемый элемент 2A, служащие как в качестве маркера трансдукции, так и для обогащения экспрессирующих трансген T-клеток с использованием анти-EGFR-мАт (фиг.3). Авторы определили частоту CAR-модифицированных T-клеток на 12-й день после однократной трансдукции лентивирусом, кодирующим ROR1-CAR (MOI=3), используя маркер tEGFR, и обнаружили стабильно более высокие эффективности трансдукции в линиях T-клеток CD4+ CAR по сравнению с линиями T-клеток CD8+ CAR, полученными от тех же индивидуумов. Чтобы подтвердить экспрессию ROR1-CAR на поверхности T-клеток CD4+, авторы использовали биотинилированный рекомбинантный слитый белок Fc-внеклеточный домен ROR1, который непосредственно связывается с scFv ROR1-CAR и специфично окрашивает T-клетки CD4+, трансдуцированные лентивирусом ROR1-CAR, но не нетрансдуцированные контрольные T-клетки CD4+ (фиг. 3). Авторы обогащали T-клетки CD4+, экспрессирующие трансген, используя маркер tEGFR, и размножали подгруппу CAR-позитивных T-клеток, стимулируя моноклональным анти-CD3-антителом. Может быть достигнуто более чем 3-log-увеличение численности T-клеток CD4+ CAR в конце 14-дневного цикла стимуляции, которое эквивалентно амплификации, наблюдаемой в CTL CD8+ CAR. После размножения клеток авторы подтверждали стабильную экспрессию ROR1-CAR на клеточной поверхности T-клеток CD4+ CAR (данные не показаны) и анализировали распознавание ROR1-позитивных опухолевых клеток.

T-клетки CD4+ ROR1-CAR специфично узнают ROR1-позитивные опухоли

Авторы анализировали эффекторную функцию T-клеток CD4+ ROR1-CAR против ROR1-позитивных первичных опухолевых клеток и линий опухолевых клеток. Авторы анализировали способность T-клеток CD4+ CAR обеспечивать прямую цитотоксичность, исследуемую в анализе высвобождения хрома (CRA), и выявили слабый, но специфичный лизис ROR1-позитивных клеток-мишеней в конце стандартной 4-часовой инкубации (фиг. 4). Авторы продлили CRA до 10 часов и наблюдали дополнительное увеличение специфичного лизиса, однако общая цитолитическая активность T-клеток CD4+ CAR все еще была ниже, чем у CTL CD8+ ROR1-CAR (фиг. 2, 4). T-клетки CD4+ ROR1-CAR как от здоровых доноров, так и от пациентов с CLL специфично узнавали первичные CLL-клетки, линии ROR1-позитивных опухолевых клеток Jeko-1 (MCL) и BALL-1 (B-ALL) и клетки K562, которые были стабильно трансфицированы ROR1-геном (K562/ROR1), но не нативные ROR1-негативные клетки K562, согласно ELISA IFN-γ, что свидетельствует о специфичном узнавании ROR1 на клеточной поверхности клеток-мишеней (фиг. 5A). Мультиплексный анализ цитокинов выявил продукцию других Th1-цитокинов, таких как TNF-α и IL-2 на значимо более высоких уровнях по сравнению с CTL CD8+ CAR, и продукцию IL-4, IL-10 и IL-17 (фиг. 5B).

Затем авторы оценивали пролиферацию T-клеток CD4+ CAR после стимуляции ROR1-позитивными опухолевыми клетками при окрашивании CFSE и использовали жесткие условия культивирования без добавления экзогенных цитокинов, чтобы исключить любой возможный неспецифичный стимул. В T-клетках CD4+ CAR наблюдали сильную и специфичную пролиферацию в ответ на ROR1-позитивные опухолевые клетки. Процентное содержание T-клеток, которые были индуцированы к пролиферации, и количество клеточных делений, которым подвергалась такая пролиферирующая подгруппа, были значимо выше в T-клетках CD4+ CAR по сравнению с T-клетками CD8+ CAR (фиг. 6). Полученные авторами данные в сочетании показывают, что T-клетки CD4+, полученные от здоровых доноров и пациентов с CLL, приобретают противоопухолевую реактивность после генетической модификации ROR1-специфичным CAR. Кроме того, способность пролиферировать в отсутствие экзогенных цитокинов и продуцировать высокие уровни Th1-цитокинов, свидетельствуют о том, что T-клетки CD4+ CAR проявляют типичные хелперные функции после стимуляции посредством CAR, и в дополнение к приданию способности к прямым противоопухолевым эффектам также могут быть использованы для усиления CTL CD8+ CAR.

CAR-модифицированные, но не нетрансдуцированные T-клетки CD4+ предоставляют помощь CTL CD8+ CAR

Чтобы проанализировать, способны ли T-клетки CD4+ CAR предоставлять помощь клеткам CD8+ CAR, авторы осуществляли эксперименты по совместному культивированию CAR-трансдуцированных и контрольных нетрансдуцированных поликлональных линий T-клеток CD4+ и CD8+, которые авторы получили из клеток здоровых доноров и пациентов с CLL. В качестве индикатора оказания помощи авторы определяли повышение специфичной для опухоли эффекторной функции CD8+ в присутствии T-клеток CD4+ по сравнению с T-клетками CD8+, культивируемыми отдельно. Авторы объединяли либо CAR-трансдуцированные, либо нетрансдуцированные контрольные T-клетки CD4+ с CTL CD8+ CAR в разных соотношениях CD4:CD8 (2:1, 1:1, 1:2), стимулировали их ROR1-позитивными опухолевыми клетками и измеряли пролиферацию, используя разведение красителя CFSE. Авторы обнаружили, что добавление CAR-трансдуцированных, но не добавление нетрансдуцированных T-клеток CD4+ к CTL CD8+ CAR значимо усиливало специфичную пролиферацию подгруппы CD8+ по сравнению с CTL CD8+ CAR отдельно (фиг.7). Усиление пролиферации было наиболее выраженным, когда в совместную культуру добавляли по меньшей мере эквивалентное количество T-клеток CD4+ CAR (соотношение CD4:CD8 2:1 или 1:1). Сочетание нетрансдуцированных T-клеток CD4+ с нетрансдуцированными T-клетками CD8+ служило в качестве дополнительного контроля и не индуцировало неспецифичной пролиферации в подгруппе CD8+ (данные не показаны).

Обсуждение

В исследованиях профиля экспрессии генов идентифицировали гены, которые предпочтительно или исключительно экспрессировались злокачественными, но не нормальными B-клетками, и ROR1 выступал в качестве гена, являющегося показателем CLL, в 2 независимых анализах (27,28). Исследования авторов показывают возможность целенаправленного воздействия на ROR1-позитивные злокачественные клетки сконструированными T-клетками, экспрессирующими ROR1-CAR. T-клетки CD8+ и CD4+ ROR1-CAR могут быть получены от здоровых доноров после лентивирусной трансдукции либо общей популяции PBMC, либо очищенных сортировкой T-клеток. ROR1-CAR-трансдуцированные T-клетки CD8+ эффективно лизировали первичные B-CLL, но не лизировали нормальные неактивированные или активированные B-клетки. ROR1-CAR-трансдуцированные T-клетки CD4+ слабо лизировали первичные B-CLL, но не лизировали нормальные неактивированные или активированные B-клетки. Такие T-клетки продуцировали эффекторные цитокины, включая TNF-α, IFNγ, IL-2, IL-4 и IL-10. CAR-трансдуцированные T-клетки CD4+ продуцировали значимо более высокие количества цитокинов, чем трансдуцированные клетки CD8+. Оба типа клеток были способны пролиферировать в ответ на ROR1-экспрессирующие опухолевые клетки. И в этом случае T-клетки CD4+ ROR1-CAR также пролиферировали в 2-3-раза сильнее, чем CTL CD8+ ROR1-CAR. Полученные результаты показывают, что трансдуцированные хелперные T-клетки CD4+ проявляют типичные хелперные функции, что свидетельствует о том, что их можно применять для усиления CTL CD8+ CAR.

Пример 3: Эффекторная функция T-клеток CD4+ ROR1-CAR, полученных из подгрупп наивных клеток, центральных и эффекторных клеток памяти

Сравнивали эффекторную функцию T-клеток CD4, полученных из подгрупп наивных клеток, центральных и эффекторных клеток памяти и затем модифицированных ROR1 CAR.

Материалы и способы

Очистка наивных клеток, центральных и эффекторных клеток памяти CD4 с использованием сортировки

T-клетки CD4+ выделяли из PBMC здорового донора, используя негативную селекцию на магнитных шариках (набор для выделения Miltenyi CD4), которая дает неактивные T-клетки CD4+. Фракцию CD4+ метили конъюгированными анти-CD45RA-, анти-CD45RO- и анти-CD62L-мАт и очищали посредством проточной сортировки, используя проточный сортировщик FACS Aria (BD Biosciences), и наивные T-клетки (CD45RA+ CD45RO- CD62L+), центральные T-клетки памяти (CD45RA- CD45RO+ CD62L+) и эффекторные T-клетки памяти (CD45RA- CD45RO+ CD62L-) CD4+ очищали на основании их экспрессии определенных маркеров.

Анализ пролиферации с использованием CFSE

T-клетки метили, используя 0,2 мкМ сложного карбоксифлуоресцеинсукцинимидилового эфира (CFSE; Invitrogen), промывали и высевали со стимулирующими клетками в соотношении 2:1 в среде CTL, содержащей 10 единиц/мл рекомбинантного IL-2 человека. После 72-часовой инкубации клетки метили, используя анти-CD8-мАт или анти-CD4-мАт и йодид пропидия (PI), чтобы исключить мертвые клетки из анализа. Образцы анализировали проточной цитометрией и клеточное деление живых T-клеток CD8+ и CD4+ оценивали, используя разведение CFSE.

Анализы цитокинов

Для анализов секреции цитокинов клетки-мишени и эффекторные клетки высевали в лунки в трех повторах в соотношении E/T 2:1, и интерферон INFγ, фактор некроза опухолей (TNF-α) и IL-2 измеряли в мультиплексном имуноанализе цитокинов (Luminex) в супернатанте, извлеченном после 24-часовой инкубации.

Результаты

Используя проточную сортировку авторы очищали T-клетки CD4+ N, центральные (CM) и эффекторные T-клетки памяти (EM) CD4+ из периферической крови 3 здоровых доноров на основании экспрессии CD45RA, CD45RO и CD62L (фиг. 8A) и сравнивали их эффекторную функцию после модификации ROR1-CAR. Авторы достигали сходных высоких эффективностей трансдукции в линиях T-клеток CAR, полученных из каждой из трех подгрупп. Многопараметровая проточная цитометрия после обогащения экспрессирующих трансген T-клеток показала наличие экспрессии CD45RO и утрату CD45RA в T-клеточной линии N CAR CD4+, что согласуется с активированным фенотипом после лентивирусной трансдукции. T-клеточные линии N, CM и EM CAR CD4+ сохраняли дифференциальную экспрессию CD62L, подтверждая, что начальная очистка проточной сортировкой была осуществлена с высокой чистотой.

Затем авторы анализировали распознавание опухоли, секрецию цитокинов и пролиферацию T-клеток CD4+ CAR, полученных из подгрупп N, CM и EM, и сравнивали их с линиями T-клеток CAR, созданными из общей популяции T-клеток CD4+. Авторы наблюдали специфичное распознавание ROR1-позитивных опухолевых клеток, используя ELISA IFN-γ, в каждой из клеточных линий. Мультиплексный анализ цитокинов показал, что T-клетки CD4+, полученные из N-подгруппы, явно продуцировали самые высокие уровни Th1-цитокинов, особенно IL-2 (фиг. 8C), и разведение красителя CFSE показало, что они пролиферировали наиболее энергично в ответ на стимуляцию ROR1-позитивными опухолевыми клетками (фиг. 8B).

Обсуждение

Исследования, проведенные авторами, иллюстрируют возможность целенаправленно воздействовать на ROR1-позитивные злокачественные клетки сконструированными T-клетками, экспрессирующими ROR1-CAR. T-клетки ROR1-CAR CD8+ и CD4+ могут быть получены от здоровых доноров после лентивирусной трансдукции либо общей популяции PBMC, либо очищенных сортировкой T-клеток из определенных подгрупп наивных T-клеток или T-клеток памяти. Наивные, центральные клетки памяти и эффекторные T-клетки CD4+ продуцировали эффекторные цитокины, включая TNFα, IFNγ, IL-2, IL-4 и IL-10. CAR-трансдуцированные клетки CD4+, полученные из подгруппы наивных клеток, продуцировали значимо более высокие количества TNFα и IL-2, чем полученные из центральных и эффекторных клеток памяти T-клетки CD4+ CAR, после передачи сигнала через CAR. Все типы CD4-клеток были способны пролиферировать в ответ на ROR1/K562, однако в CAR-трансдуцированных клетках CD4+, полученных из подгруппы наивных клеток, процентное содержание T-клеток, которые были индуцированы к пролиферации, и количество клеточных делений, которым подвергалась пролиферирующая подгруппа, были значимо выше. Оба показателя, профиль цитокинов и пролиферативная способность, свидетельствуют, что наивные T-клетки CD4+ ROR1-CAR лучше всего подходят для усиления CTL CD8+ ROR1-CAR.

Пример 4: Наивные T-клетки CD4+ являются более хорошими хелперами, чем T-клетки памяти CD4+

Трансдуцированные наивные, центральные памяти и эффекторные T-клетки CD4+ культивировали совместно с трансдуцированными цитотоксическими T-лимфоцитами CD8+ и измеряли пролиферативный ответ клеток в ответ на стимуляцию клетками K562/ROR1.

Материалы и способы

Совместное культивирование

Полученные из наивных клеток, центральных и эффекторных клеток памяти ROR1-CAR-трансдуцированные T-клетки CD4+ и ROR1-CAR-трансдуцированные цитотоксические T-лимфоциты CD8+, полученные из наивных и центральных T-клеток памяти CD8+, метили CFSE, и линии T-клеток CAR CD4+ и CD8+ культивировали совместно в соотношении 1:1. Затем совместные культуры стимулировали клетками K562/ROR1 и контрольными клетками K562 и измеряли пролиферацию клеток в анализе с разбавлением красителя CFSE после 5 дней инкубации. Для проточного анализа образцы красили конъюгированными анти-CD8-мАт и анти-CD4-мАт, чтобы отличить подгруппы CD8+ и CD4+.

Результаты

Наивные T-клетки CD4+ CAR обладают превосходной способностью усиливать эффекторную функцию CTL CD8+ CAR

Авторы сравнивали хелперную функцию линий T-клеток CD4+ CAR N, CM и EM, чтобы определить, можно ли благоприятный профиль цитокинов и пролиферативный потенциал T-клеток N CAR CD4+ также транслировать на наиболее сильный хелперный эффект по отношению к CTL CD8+ CAR. В предыдущей работе было показано, что имеют место существенные различия между T-клетками CD8+ N, CM и EM, которые влияют на их потенциальную применимость для адаптивной иммунотерапии. Авторы недавно показали, что полученные из CM, но не из EM, T-клетки CD8+ способны существовать в течение длительных периодов времени после адоптивного переноса, что делает их предпочтительной для иммунотерапии подгруппой T-клеток CD8+ (33, 34). Другие группы исследователей считают, что N-T-клетки CD8+ также обладают благоприятными признаками для применения в T-клеточной терапии (35, 36). Таким образом, авторы создали CTL CD8+ CAR из очищенных сортировкой N- и CM-T-клеток для определения оптимального сочетания подгрупп CAR-T-клеток CD8+ и CD4+. После лентивирусной трансдукции и обогащения CAR-трансдуцированных T-клеток CD8+ с использованием маркера tEGFR авторы подтвердили реактивность по отношению к опухоли N- и CM-CTL CD8+ CAR (данные не показаны) и осуществили эксперименты по совместному культивированию с T-клетками CD4+ CAR, как описано выше. Как и ожидалось, совместная культура N- и CM-CTL CD8+ CAR c N-T-клетками CD4+ CAR приводила к значимо более высокой специфичной для опухоли пролиферации подгруппы CD8+ по сравнению с совместной культурой с CM- и EM-T-клетками CD4+ CAR или с CTL CD8+ CAR отдельно (фиг. 9). Из всех сочетаний максимальную пролиферацию CTL CD8+ CAR в ответ на стимуляцию ROR1-позитивными опухолевыми клетками наблюдали после совместного культивирования N-T-клеток CD4+ CAR с CM-CTL CD8+ CAR (фиг. 9). Полученные авторами данные, вместе взятые, демонстрируют, что имеют место присущие клеткам различия между T-клетками CD4+ N, CM и EM в профиле их цитокинов и пролиферативном потенциале, при этом более высокую продукцию IL-2 и наиболее высокую пролиферацию наблюдали в N-T-клетках CD4+. Полученные авторами данные свидетельствуют, что очищенные сортировкой T-клетки CD4+ N, а не CM, EM или общая популяция T-клеток CD4+, лучше всего подходят для усиления эффекторной функции CTL CD8+, и дополняют предыдущую работу по T-клеткам CD8+ в том, что полученные из CM T-клетки CD8+, обладают благоприятными характеристиками для применения в адаптивной иммунотерапии.

Обсуждение

Полученные данные, взятые вместе, демонстрируют, что адоптивный перенос ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD4+ и CD8+ придает способность к мощным противоопухолевым ответам в модели in vivo агрессивной системной лимфомы, и представляют доказательство полезного и синергетического влияния T-клеток CD4+ CAR на противоопухолевую эффективность CTL CD8+ CAR. Полученные авторами данные иллюстрируют, каким образом анализ присущих клеткам качеств может давать информацию, необходимую для рациональной разработки клеточных продуктов, содержащих специфичные для опухоли T-клетки CD8+ и CD4+, чтобы улучшить результаты иммунотерапии злокачественной опухоли.

Пример 5: Мышиная опухолевая модель системной лимфомы из клеток мантийной зоны (NSG/Jeko-1-ffLuc)

Авторы исследовали влияние предоставления CD4-помощи в отношении противоопухолевой эффективности ROR1-CAR-модифицированных CTL CD8+ в модели in vivo агрессивной системной лимфомы из клеток мантийной зоны.

Материалы и способы

Сублетально облученным мышам NOD/SCID/гамма^-/- (NSG) прививали посредством инъекции в хвостовую вену 5×10⁵ клеток Jeko-1, которые были стабильно трансфицированы люциферазой светляка (Jeko-1/ffLuc), чтобы обеспечить возможность оценки опухолевой нагрузки и распределения с использованием визуализации биолюминесценции. Авторы подтвердили соответствующее приживление (частота приживления = 100%) и развитие быстро прогрессирующей диссеминированной лимфомы у мышей NSG в таких условиях. После прививки опухолей группы по 3 мыши в каждой получали либо CTL CD8+ CAR (группа 1), T-клетки CD4+ CAR (группа 2), сочетание ROR1-CAR-трансдуцированных T-клеток CD8+ и CD4+ (группа 3), нетрансдуцированные контрольные T-клетки (группа 4, 5, 6) посредством инъекции в хвостовую вену или не получали обработки (группа 7). Общее количество переносимых T-клеток составляло 10×10⁶ во всех случаях. Авторы получали кровь из глаза мышей через 2 дня после адоптивного переноса и подтверждали присутствие ROR1-CAR-трансдуцированных или нетрансдуцированных T-клеток в периферической крови.

Результаты

На 6-й день после переноса T-клеток авторы осуществляли визуализацию биолюминесценции, чтобы оценить опухолевую нагрузку. Наибольший противоопухолевый эффект наблюдали у мышей, которые получали сочетание T-клеток ROR1-CAR CD8+ и CD4+, у которых происходило снижение сигнала биолюминесценции на >2 log по сравнению с контрольной группой (фиг. 10). Авторы также наблюдали мощный противоопухолевый эффект у мышей, которые получали либо CD8+, либо CD4+ ROR1-CAR-модифицированные T-клетки, при этом имело место снижение сигнала биолюминесценции на >1 log по сравнению с контролями (фиг.10). Важно, что уменьшение опухолевой нагрузки после введения сочетания CAR-T-клеток CD8+/CD4+ было больше, чем в случае объединяемых групп CTL CD8+ CAR и T-клеток CD4+ CAR, что свидетельствует о том, что T-клетки CD4+ CAR и CTL CD8+ CAR работают синергетически.

Обсуждение

Полученные данные, взятые вместе, демонстрируют, что адоптивный перенос ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD4+ и CD8+ придает способность к сильным противоопухолевым ответам в модели in vivo агрессивной системной лимфомы и представляют доказательство полезного и синергетического влияния T-клеток CD4+ CAR на противоопухолевую эффективность CTL CD8+ CAR. Полученные авторами данные иллюстрируют, каким образом анализ присущих клеткам качеств может давать информацию, необходимую для рациональной разработки клеточных продуктов, содержащих специфичные для опухоли T-клетки CD8+ и CD4+, чтобы улучшить результаты иммунотерапии злокачественной опухоли.

Пример 6: T-клетки CD19 CAR проявляют такую же синергию

Авторы исследовали влияние предоставления CD4-помощи в отношении противоопухолевой эффективности CD19-модифицированных CTL CD8+ в совместной культуре in vitro и в модели in vivo агрессивной системной лимфомы из клеток мантийной зоны.

Материалы и способы

T-клетки CD19 CAR можно получить, как описано в патенте US 2008/0131415, который включен в настоящее описание в виде ссылки.

Анализ совместной культуры

CD19-CAR-трансдуцированные T-клетки CD4+ и CD19-CAR-трансдуцированные цитотоксические T-лимфоциты CD8+ метили CFSE и совместно культивировали в соотношении 2:1, 1:1 и 1:2. Затем совместные культуры стимулировали клетками K562/ROR1 и контрольными клетками K562, и пролиферацию клеток измеряли в анализе с разведением красителя CFSE после 5 дней инкубации. Для проточного анализа образцы красили конъюгированным анти-CD8-мАт и анти-CD4-мАт, чтобы отличить подгруппы CD8+ и CD4+.

Модель in vivo

Сублетально облученным мышам NOD/SCID/гамма^-/- (NSG) прививали посредством инъекции в хвостовую вену 5×10⁵ клеток Jeko-1, которые были стабильно трансфицированы люциферазой светляка (Jeko-1/ffLuc), чтобы обеспечить возможность оценки опухолевой нагрузки и распределения с использованием визуализации биолюминесценции. Авторы подтвердили соответствующее приживление (частота приживления = 100%) и развитие быстро прогрессирующей диссеминированной лимфомы у мышей NSG в таких условиях. После прививки опухолей группы по 3 мыши в каждой получали либо CTL CD8+ CD19 CAR (группа 1), T-клетки CD4+ CD19 CAR (группа 2), сочетание CD19-CAR-трансдуцированных T-клеток CD8+ и CD4+ (группа 3), нетрансдуцированные контрольные T-клетки (группы 4, 5, 6) посредством инъекции в хвостовую вену или не получали обработки (группа 7). Общее количество переносимых T-клеток составляло 10×10⁶ во всех случаях. Авторы получали кровь из глаза мышей через 2 дня после адоптивного переноса.

Результаты

На фиг. 10 показана превосходная способность линий T-клеток CD4+ CAR, полученных из подгруппы наивных клеток, усиливать специфичную для опухоли пролиферацию CTL CD8+ CAR, полученных из центральных клеток памяти, в экспериментах по совместному культивированию CTL CD8+ CD19-CAR и линий T-клеток CD4+ CD19-CAR, стимулированных линией CD19+ опухолевых клеток Jeko-1 лимфомы из клеток мантийной зоны. Хотя линии T-клеток CD4+ CAR, полученные из подгрупп центральных или эффекторных клеток памяти, усиливают специфичную для опухоли пролиферацию полученных из центральных клеток памяти CTL CD8+ CAR в намного меньшей степени.

Фиг. 11 показывает, что T-клетки CD8+ CAR и T-клетки CD4+ CAR независимо обеспечивают прямую противоопухолевую эффективность в модели лимфомы у иммунодефицитных мышей (NOD/SCID-Raji). Мыши получали либо CD19-CAR-трансдуцированные или контрольные ложно трансдуцированные T-клетки CD8+, полученные из центральных клеток памяти (A), либо CD19-CAR-трансдуцированные или контрольные ложно трансдуцированные T-клетки CD4+, полученные из наивных клеток (B).

Фиг. 12 показывает стимуляцию и синергетическое действие ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD4+ на противоопухолевую эффективность CTL CD8+ROR1-CAR в мышиной опухолевой модели системной лимфомы из клеток мантийной зоны (NSG/Jeko-1-ffLuc). Противоопухолевая эффективность ROR1-CAR-модифицированных T-клеток CD8+ и CD4+ в мышиной опухолевой модели системной агрессивной лимфомы из клеток мантийной зоны (NSG/Jeko-1) была усилена по сравнению либо с отдельной клеточной популяцией, либо по сравнению с нетрансдуцированными клетками.

Фиг. 13 показывает синергию T-клеток CD19-CAR CD8+ и CD4+ в мышиной модели системной лимфомы (NSG/Raji). Приживление опухоли Raji подтверждали, используя визуализацию биолюминесценции на 6-й день после инокуляции опухоли (перед обработкой) (схема обработки показана на A, приживление опухоли на основании биолюминесценции показано на B). Анализ опухолевой нагрузки с использованием визуализации биолюминесценции показал полное устранение опухолей Raji в когортах мышей, обработанных T-клетками CD8+ CD19-CAR, и у мышей, обработанных объединенным продуктом T-клеток CD19-CAR CD8+ и CD4+ (после обработки средние черный и серый столбики) B). Затем мышам вводили второй инокулят опухолевых клеток Raji и анализировали частоту встречаемости T-клеток CAR CD4+ и CD8+ в периферической крови и приживление опухоли. У мышей, обработанных объединенным продуктом T-клеток CAR CD8+ и CD4+ наблюдали значимо более высокие уровни T-клеток CAR CD8+ после инокуляции опухоли (нижние панели C) и полное отторжение инокулята Raji (после инокуляции опухоли правый серый столбик, B). Напротив, у мышей, которые получили только CTL CD8+ CD19-CAR, авторы не выявили увеличения количества T-клеток CAR после инокуляции опухоли (C), и опухолевые клетки Raji были способны приживаться (после инокуляции опухоли правый черный столбик, панель B).

Обсуждение

Полученные данные, вместе взятые, демонстрируют, что в случае трансдукции клеток другой конструкцией CAR, CD19, CD19-CAR-модифицированные T-клетки CD4+ и CD8+ обеспечивают сильные противоопухолевые ответы в модели in vivo агрессивной системной лимфомы и представляют доказательство полезного и синергетического влияния T-клеток CD4+ CAR на противоопухолевую эффективность CTL CD8+ CAR.

Вышесказанное является иллюстрацией настоящего изобретения, и его не следует рассматривать как ограничение изобретения. Изобретение определено следующей далее формулой изобретения, при этом включены эквиваленты формулы изобретения. Все ссылки и документы, упоминаемые в настоящем описании, включены в виде ссылки.

ССЫЛКИ