Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА У НАСЕЛЕНИЯ БАШКОРТОСТАНА

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа (СД2) у населения Республики Башкортостан.

СД2 представляет собой острую медико-социальную и экономическую проблему, обусловленную широкой распространенностью, развитием инвалидизирующих осложнений, а также большими финансовыми затратами на лечение.

В Республике Башкортостан на 1 января 2014 г. количество пациентов, состоящих на диспансерном учете по поводу сахарного диабета 2 типа (СД2), составило 86 74 человека, что почти на 12000 больше, чем в 2011 г. При этом примерно треть из них (29734 человека) - инвалиды, а средняя продолжительность жизни от начала заболевания составляет 9,75 лет.

СД2 возникает как итог взаимодействия множества генетических факторов с особенностями питания и двигательной активности индивидуума.

Самым эффективным и экономичным направлением в диабетологии считают профилактику заболевания. Первичная профилактика предполагает формирование групп риска СД2 с использованием молекулярно-генетических маркеров заболевания и меры предупреждения развития болезни. Применение разработанного способа обеспечит выявление лиц с высоким риском развития СД2 для того, чтобы осуществить мероприятия по профилактике развития данной патологии.

Известен способ прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью, характеризующийся тем, что осуществляют выделение ДНК и проводят анализ полиморфного варианта гена лимфотоксина α (+250G/A Ltα). В случае выявления аллеля +250G Ltα прогнозируют повышенный риск формирования сахарного диабета на фоне гипертонической болезни, при обнаружении генотипа +250АА Ltα прогнозируют низкий риск развития сахарного диабета второго типа у уроженцев Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью [патент RU 2521202, 2014 г.].

Недостатком метода является то, что метод может быть реализован только у уроженцев Центрального Черноземья, поскольку молекулярно-генетические маркеры предрасположенности к СД2 различаются в зависимости от структуры популяции.

Известен способ прогнозирования развития сахарного диабета второго типа у больных метаболическим синдромом, характеризующийся тем, что проводят определение содержания аспартатаминотрансферазы (x₁), конечного систолического объема левого желудочка (x₂), конечного диастолического объема левого желудочка (х₃), содержания аланинаминотрансферазы (х₄), систолического артериального давления (х₅), размера левого предсердия (x₆), содержания триглицеридов (х₇), кортизола (х₈), сахара в сыворотке крови через два часа после приема пищи (x₉), возраста больного (х), индекса массы тела больного (х₁₁), наличия или отсутствия у больного отягощенной наследственности по сахарному диабету второго типа (x₁₂) с последующим расчетом стратификационного показателя риска G(x)=0,27⋅x₁+0,28⋅x₂+5,03⋅x₃+0,25⋅x₄+0,12⋅x₅+1,93⋅x₆-3,13⋅x₇+0,28⋅x₈+1,05⋅x₉+0,17⋅x₁₀+0,06⋅x₁₁+0,59⋅x₁₂. Если G(x) превышает 88,1, то риск развития сахарного диабета оценивают как высокий, в противном случае как незначительный [патент RU 2580632, 2016 г.].

Недостатками метода являются его трудоемкость, поскольку требуется проведение нескольких исследований (эхокардиографии, биохимического анализа крови, иммуноферментного анализа крови), а также необходимость знания обследуемого лица о его наследственности, что не всегда возможно. Кроме того, метод может быть использован только в группе лиц с метаболическим синдромом.

Известен способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа, заключающийся в том, что определяют клинико-анамнестические данные: ИМТ, ОТ, АГ, наличие сахарного диабета у близких родственников. Определяют лабораторные данные: ТГ, ХС ЛВП, показания САД и ДАД, уровень сахара в крови. Оценивают в баллах полученные данные и суммируют их. При сумме баллов ниже 8 судят о низкой степени риска развития СД 2 типа в ближайшие 10 лет. При сумме баллов более или равно 8 судят о высокой степени риска развития СД 2 типа [патент RU 2611900, 2017 г.].

Недостатками данного метода являются его трудоемкость, поскольку требуется определение нескольких лабораторных показателей (ТГ, ХС ЛВП, уровень сахара в крови), а также необходимость знания обследуемого лица о его наследственности, что не всегда возможно.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования риска развития СД2 у жителей Башкортостана, включающий определение аллельных вариант по полиморфному локусу rs7903146 гена транскрипционного фактора 7 TCF7L2 (англ. transcription factor 7-like 2). При наличии в генотипе аллеля Т прогнозируют повышенный риск развития СД2 [Авзалетдинова Д.Ш., Шарипова Л.Ф., Кочетова О.В. и др. «Анализ ассоциаций полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 с сахарным диабетом 2 типа в татарской этнической группе, проживающей в Башкортостане» // журнал «Сахарный диабет», 2016, Т. 19, №2, С. 119-124].

Недостатком метода является то, что описываемый маркер повышенного риска СД2 ассоциирован в количественном отношении лишь с небольшим риском развития заболевания (OR=1,61).

Большой интерес представляет изучение полиморфизмов специфических маркеров воспаления в жировой ткани - хемокинов, которые могут быть прогностически более значимыми в определении риска развития СД2.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования развития СД2, позволяющего в количественном отношении оценить риск возникновения данного заболевания у лиц, проживающих в Башкортостане.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у лиц, проживающих в Башкортостане, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, в отличие от прототипа проводят амплификацию участка rs2107538 гена хемокина CCL5 и участка rs6749704 гена хемокина CCL20 и при выявлении генотипов С/Т или Т/Т полиморфного локуса rs2107538 гена CCL5, С/С полиморфного локуса rs6749704 гена CCL20 прогнозируют риск развития сахарного диабета 2 типа у обследуемого.

Предлагаемый способ прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у лиц, проживающих в Башкортостане, осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 6 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V. 2. - P. 31-34):

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8,0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂O; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для ПЦР для амплификации нужных фрагментов гена СС-хемокина 5 CCL5 (англ. gene of chemokine С-С motif ligand 5) и гена СС-хемокина 20 CCL20 (англ. gene of chemokine С-С motif ligand 20). Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР-анализа полиморфных локусов подбирались с помощью приложений PrimerSelect5.05 и MapDraw из пакета программ DNAStarlnc (1993-2002) и электронных баз данных (http://www.dnastar.com/t-sub-products-lasergene-primerselect.aspx, www.snipper.chip.org. http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0,1-1 мкг геномной ДНК, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8,8, 6,7 mM MgCl2, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween-20. В полученную смесь добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы и 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С - 60 секунд, 55°С - 60 секунд, 72°С - 60 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 5 мин.

Нуклеотидные замены G>A в положении -471 гена CCL5 и Т>С в положении -786 гена CCL20 выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции RsaI, смесь выдерживают при 37°С в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% ПААГ. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl рН 7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с рН 8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания ПААГ бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на гельдокументирующей системе Mega-Bioprint 1100 Vilber Lourmat. Генотипы типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе.

При наличии фрагментов размером 180, 26 пар нуклеотидов (пн) идентифицируется гомозиготный генотип 7Т, при наличии фрагментов размером 206, 180 и 26 пн идентифицируется гетерозиготный генотип СТ rs2107538 CCL5.

При наличии фрагментов размером 129, 85 пар нуклеотидов (пн) идентифицируется гомозиготный генотип TТ, при наличии фрагментов размером 214, 129 и 85 пн идентифицируется гетерозиготный генотип СТ rs6749704 CCL20.

Нами были исследованы образцы ДНК у 440 больных СД2. Контрольная группа включала 500 здоровых добровольных доноров без клинических и лабораторных признаков сахарного диабета и имеющих неотягощенный семейный анамнез по сахарному диабету.

В группе больных СД2 по сравнению со здоровыми лицами установлена достоверно более высокая частота встречаемости 3 генотипов (таблица). Таким образом, повышенный генетический риск СД2 у населения Башкортостана ассоциирован с генотипами С/Т и Т/Т полиморфного локуса rs2107538 гена CCL5, генотипом С/С полиморфного локуса rs6749704 гена CCL20.

Для количественной оценки относительного риска развития заболевания для каждого из вышеуказанных генетических маркеров мы вычислили показатель соотношения шансов (odds ratio - OR). Для этого мы использовали формулу, предложенную Бландом (Bland, J.M. The odds ratio / J.M. Bland, D.G. Altaian // Br. Med. J. - 2000. - Vol. 320. - P. 1468):

OR=(a×d)/(b×c),

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера (аллеля или генотипа) среди больных; c и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. Повышенный риск развития СД2 констатируют при OR более 1,0.

Приводим пример конкретного расчета. В группе больных СД2 идентифицировано 74 человека, имеющих генотип С/С по полиморфному локусу CCL20 rs6749704, т.е. а=74. У 366 больных СД2 генотип С/С не идентифицирован, поэтому b=366. В выборке здоровых выявлено 34 человека с генотипом С/С, следовательно, с=34. В контрольной группе генотип С/С не обнаружен у 466 человек, это значит, что d=466. Подставив эти значения в вышеприведенную формулу, получим:

OR=(74×466)/(366×34)=34484/12 444=2,77.

Следовательно, у лиц, имеющих генотип С/С, риск развития СД2 повышен в 2,77 раз по сравнению с лицами, обладающими другим генотипом по полиморфному локусу CCL20 rs6749704. Вычисленные по результатам исследования показатели OR в дальнейшем используются в ходе разработки генетического паспорта пациента. Полученные в нашем исследовании показатели OR при наличии рисковых генотипов по локусам CCL5 rs2107538 и CCL20 rs 6749704 представлены в таблице.

Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациент К., 45 лет, болен СД2 в течение 3 лет, принимает пероральные сахароснижающие препараты. Обратился по вопросу определения генетического риска развития СД2 у своего сына 14 лет.

Результаты генотипирования: для выявления генотипов по полиморфным локусам CCL5 rs2107538 и CCL20 rs6749704 у сына пациента К. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов CCL5 и CCL20 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

При исследовании полиморфного локуса CCL20 rs6749704 был выявлен генотип С/С, при котором показатель соотношения шансов развития СД2 составляет 2,77 (таблица).

Вывод: учитывая высокий генетический риск СД2 у сына пациента, родителям были предложены превентивные мероприятия, включающие коррекцию массы тела ребенка, расширение его двигательной активности, ежегодный контроль гликемии. Данные рекомендации не были выполнены, сын пациента продолжал набирать массу тела. При обследовании через два года у него был диагностирован сахарный диабет 2 типа.

Пример 2. Пациентке М., 36 лет, имеющей факторы риска СД2 (в анамнезе рождение ребенка с массой тела 4,3 кг; ожирение 2 ст.), было предложено проведение молекулярно-генетического исследования для определения риска развития СД2.

Результаты генотипирования: для выявления генотипов по полиморфным локусам CCL5 rs2107538 и CCL20 rs6749704 у пациентки М. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов CCL5, CCL20 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

При исследовании полиморфного локуса CCL5 rs2107538 был выявлен генотип Т/Т, при котором показатель соотношения шансов развития СД2 составляет 2,05 (таблица).

Вывод: учитывая высокий генетический риск СД2 у пациентки М., ей были предложены превентивные мероприятия, включающие коррекцию массы тела, в том числе с использованием медикаментозных препаратов, расширение двигательной активности, ежегодный контроль гликемии. Превентивные мероприятия не проводились. В возрасте 39 лет, во время второй беременности, у пациентки развился манифестный сахарный диабет, после родов реклассифицированный в сахарный диабет 2 типа.

Пример 3. Пациент А., 38 лет, проходил медицинский осмотр на работе. При исследовании глюкозы капиллярной крови натощак была выявлена гипергликемия 5,8 ммоль/л. Пациент был направлен к врачу-эндокринологу для дальнейшего обследования. При проведении перорального глюкозотолерантного теста с 75 грамм глюкозы диагностирована нарушенная толерантность к углеводам. Пациенту было предложено проведение молекулярно-генетического исследования для определения риска развития СД2.

Результаты генотипирования: для выявления генотипов по полиморфным локусам CCL5 rs2107538 и CCL20 rs6749704 у пациента А. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов CCL5, CCL20 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

При исследовании полиморфного локуса CCL5 rs2107538 был выявлен генотип С/Т, при котором показатель соотношения шансов развития СД2 составляет 1,65 (таблица).

Вывод: учитывая повышенный генетический риск СД2 у пациента А., ему были предложены превентивные мероприятия, включающие использование медикаментозных препаратов, расширение двигательной активности, ежегодный контроль гликемии. Превентивные мероприятия не проводились. Во время следующего ежегодного медосмотра был диагностирован сахарный диабет 2 типа.

Пример 4. Пациент Р., 45 лет, находился в хирургическом отделении по поводу плановой холецистэктомии. В послеоперационном периоде выявлена гипергликемия в венозной крови натощак 7,2 ммоль/л, подтвержденная повторным исследованием (7,4 ммоль/л). Учитывая трудность дифференциальной диагностики между транзиторной гипергликемией в послеоперационном периоде и впервые выявленным сахарным диабетом, пациенту было предложено проведение молекулярно-генетического исследования для определения риска развития СД2.

Результаты генотипирования: для выявления генотипов по полиморфным локусам CCL5 rs2107538 и CCL20 rs6749704 у пациента Р. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов CCL5, CCL20 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

При исследовании полиморфного локуса CCL5 rs2107538 был выявлен генотип пониженного риска С/С (показатель соотношения шансов развития СД2 составляет 0,48), а при исследовании полиморфного локуса CCL20 rs6749704 был выявлен нейтральный генотип С/Т (таблица).

Прогноз в отношении развития СД2 благоприятный. Гипергликемия в послеоперационном периоде была расценена как транзиторная. В дальнейшем пациент к врачу-эндокринологу не обращался.

Примечание: * - различия между сравниваемыми группами статистически значимые при Р<0,05; Р - уровень статистической значимости; жирным шрифтом выделены маркеры повышенного риска сахарного диабета 2 типа.