Рекомбинантный интерналин В 321, полученный с помощью штамма Escherichia coli

Изобретение относится к биотехнологии и касается рекомбинантного интерналина В 321 и его использования. Целью изобретения является ускорение процесса заживления ран с максимальным восстановлением поврежденных тканевых структур за счет нанесения на раневую поверхность препарата, содержащего рекомбинантный белок интерналин В 321.

Уровень техники

В хирургической практике ведение раневого процесса является неотъемлемой и трудной задачей, так как реорганизация мягких тканей представляет собой многофакторный процесс и зависит от множества параметров. Большинство ран, если только они не являются запланированными - асептическими, являются свежеинфицированными ранами, для разрешения которых отводится от 3 до 7 дней. Если процесс регенерации тканей недостаточен, то свежеинфицированная рана может перейти в разряд гнойных ран, что является обременительным с точки зрения экономики, сопровождается дополнительными страданиями для пациента и представляет угрозу жизни.

Существующие методы ведения ран сводятся к хирургической обработке, физиотерапевтическим процедурам и медикаментозному лечению. При этом способ хирургической обработки или физиотерапевтические процедуры раны имеют недостатки, так как могут быть выполнен только в условиях специализированного учреждения и не могут быть использованы в условиях догоспитального этапа.

В качестве терапевтических препаратов применяют наложение повязок с гипертоническими и антисептическими растворами (фурацилин, хлоргексидин, йодопирон), мазями на жировой или гидрофильной основах (тетрациклиновая мазь, солкосерил, левомеколь, акридерм и др.), однако существенным недостатком данного способа является хронизация процесса за счет удлинение сроков разрешения раны вследствие снижения оксигенации раневой поверхности, а также данный метод затруднителен в случаях ведения ожоговых ран, особенно с большой площадью раневой поверхности или локализации раны в труднодоступных местах. Особым образом стоит отметить мокнущие раны, наблюдаемые у пациентов со снижением метаболической активности или сопровождающиеся сопутствующей этиологией (варикозная болезнь, тромбофлебит или сахарный диабет).

В последние годы для разрешения раневого процесса все чаще применяются бактериальные продукты, а в ряде случаев и целые непатогенные бактерии. Данные методы основаны на стимуляции процессов врожденного иммунитета или синтеза целевого продукта для увеличения темпов регенерации. Так в патенте RU 2447082 применяется гель, содержащий в качестве действующего вещества бактериальные липополисахариды, выделенные из Е. coli или S. typhi, в концентрации до 5 г на 100 г субстанции. Механизм действия бактериальных липополисахаридов проявляется в активации системы врожденного иммунного ответа, что определяет его местное антимикробное воздействие и снижает риск развития гнойных осложнений. Однако к недостаткам данного метода можно отнести потенциальный пирогенный эффект, интенсивность которого сложно прогнозировать ввиду гетерогенности человеческой популяции. Известен способ (патент RU 2539378) использования бактериальных клеток непатогенного штамма Е. coli, продуцирующих рекомбинантный пероксиредоксин 6 человека, аналогичный по последовательности аминокислот естественному белку. Мазь помимо бактериальных клеток (более 330 млн на 1 г препарата) включает в себя ванилин, физиологический раствор, ланолин и фенол как консервирующий агент. К недостатку данного способа следует отнести продукцию клетками сторонних продуктов, способных влиять на процесс заживления.

Одним из способов заживления ран посредствам усиления регенерации является применение цитокинов, а именно факторов роста, в частности фактора роста гепатоцитов (HGF) (патент RU 2520817). Фактор роста гепатоцитов - это гликопротеин, который способствует заживлению ран. Его связывание с собственным рецептором, c-Met, приводит к активации сигнальных путей, способствующих регенерации тканей. HGF может применяться в виде гелей, содержащие 1-10 нг действующего вещества на см² раневой поверхности. Недостатком данного метода является трудность получения целой молекулы HGF, который содержит несколько циклов очистки и включает множество этапов посттрансляционных модификаций, а также необходимость в присутствии ингибиторасериновых протеаз антитромбина III.

Особый интерес с точки зрения использования в качестве средства терапии представляют бактериальные белки - специфические агонисты поверхностных эукариотических рецепторов. Такие белки могут мимикрировать действие естественных лигандов, запуская схожие физиологические процессы, при этом, чаще всего подобные бактериальные белки не обладают структурным сходством с самим цитокином, что в свою очередь расширяет теоретический и практический поиск новых агонистов эукариотических рецепторов с терапевтическим потенциалом и уменьшением развития побочных реакций. Одним из таких белков является интерналин В, который специфически взаимодействует с тирозинкиназным рецептором фактора роста гепатоцитов с-Met (фиг. 1).

Из уровня техники известна публикация WO 2009156171, в которой указывается на потенциальную возможность рекомбинантной формы интерналина В связываться с c-Met и активировать данный рецептор. В публикации описывается изобретение, относящееся к белку интерналину B в форме димера. Образование димера инициировали добавлением Н₂О₂. Проведен анализ уровня активации рецептора c-Met различными лигандами, в том числе естественным HGF и отличающиеся по конформации InlB₂₄₁ и InlB_{B 321}: структуры «голова к голове», «хвост-хвост» и антипараллельная «спина к спине». Однако в данной публикации не идет речь об использовании in vitro интерналина В 321 для лечения ран, а также предусматривает дополнительные схемы модификации получения конечного целевого действующего вещества, что усложняет этапы приготовления лекарственного препарата.

Из публикации REIN Т, Quantitative phosphokinome analysis of the Met pathway activated by the invasion internalin В from Listeria monocytogenes, Mol Cell Proteomics, 2009 Dec, 8(12): 2778-95 известна митогенная активность.

Однако в указанных публикациях не раскрыто и не предполагается использование интерналина В 321 для заживления ран.

Осуществление изобретения

Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии для лечения ран кожного покрова и мягких тканей, так как рекомбинантный интерналин В 321 стимулирует регенерацию (способен ускорять и/или индуцировать процессы регенерации) кожи и нижележащих мягких тканей. Рекомбинантный интерналин В321 также может быть использован для получения лекарственных средств, обладающих регенеративным потенциалом, которые могут быть использованы в дерматологии и хирургии, в том числе в косметологии, косметической хирургии, дерматологии для лечения абразивных, полнослойных, скальпированных ран.

Целью изобретения является активизация процессов регенерации тканей на месте повреждения. Поставленная цель достигается тем, что после первичного туалета раны на поврежденную поверхность кожи или мягких тканей наносят однократно лекарственную форму для наружного применения, содержащую агонист эукариотического тирозинкиназного рецептора фактора роста гепатоцитов (c-Met) - интерналин В 321 в диапазоне концентрации от 75 мкг/мл до 300 мкг/мл.

В результате обработки поверхности интерналином В 321 происходит активация рецептора с последующей димеризацией последнего, что приводит к аутофосфорилированию тирозиновых остатков в положениях 1234 и 1235 (RODRIGUES G., PARK М. Autophosphorylation modulates the kinase activity and oncogenic potential of the Met receptor tyrosine kinase, Oncogene, 1994. Vol. 9, №7, p. 2019-2027). Это способствует последующему фосфорилированию тирозиновых остатков в положениях 1349 и 1356 и, как следствие, к активации различных сигнальных эффекторов, опосредуя запуск внутриклеточных сигнальных каскадов, среди которых можно выделить: MAPK-каскад, PI3K/Akt-путь и STAT-путь. Активация данных путей приводит к клеточной пролиферации, выживаемости и миграции клеток. Способствуя процессам ангиогенеза и эпителизации раневой поверхности. Кроме того, из FREIBERGA, Folding and stability of the leucine-rich repeat domain of internalin В from Listerimonocytogenes, J Mol Biol. 2004 Mar 19; 337(2), реферат, известно, что интерналин В 321 участвует в фагоцитозе бактерий.

Предлагаемый способ лечения ран включает в себя применения интерналина В 321, который является укороченным фрагментом интерналина В, но при этом содержит все необходимые участки для связывания и активации рецептора, не требует дополнительных процессов модификации или приготовления, а процесс получения очищенного препарата относится к микробиологическому синтезу с использованием уникальных штаммов продуцентов, защищенных патентом RU 2634416. Получение интерналина В 321 в качестве действующего вещества экономически целесообразно, легко осуществимо, так как не требует дополнительных этапов превращения интерналина В 321 в активную форму, а способ применения для лечения ран прост в обращении.

Задачи настоящего изобретения: повышение качества лечения путем стимуляции физиологических процессов пролиферации, выживаемости и усиление миграции клеток в область поврежденных тканей, нормализация раневого процесса, сокращение сроков лечения, улучшение функциональных результатов, а также создание высокоэффективного с точки зрения биологической доступности лекарственного средства, обладающего многофакторным терапевтическим действием на регенеративные процессы раневых дефектов.

Указанные задачи достигаются тем, что в способе лечения ран, включающем местную обработку раневой поверхности однократным применением лекарственного препарата, содержащего агонист рецептора фактора роста гепатоцитов - бактериальный белок интерналин В 321, а также отсутствует необходимость дополнительных многократных обработок раневой поверхности и/или наложения повязок. А также продукция очищенного белкового препарата осуществляется уникальными штаммами продуцентами Е. Coli BL21: штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele14, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele9, защищенными патентом RU 2634416.

Изобретение относится к рекомбинантному интерналину В 321, имеющему молекулярную массу от 36718.61 до 36762,67, pI от 7,25 до 8 и заряд белка при рН 7,2-7,4 от 0,746 до 0,748.

Изобретение также относится к способу лечения ран, включающему использование лекарственных средств для наружного применения, отличающемуся тем, что в качестве действующего вещества используется очищенный рекомбинантный белок интерналин В 321, в том числе рекомбинантный интерналин В 321 по п. 1, лекарственное средство с концентрацией действующего вещества в диапазоне от 75 мкг/мл до 300 мкг/мл однократно наносят тонким слоем на всю площадь поврежденной поверхности кожи или мягких тканей после первичного туалета раны.

Концентрация действующего вещества от 75 мкг/мл до 300 мкг/мл зависит от глубины раны.

Примеры

Пример 1. Получение очищенного белкового препарата

Культуры штаммов-продуцентов: Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele14, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele9, выращенные в течение ночи в питательной среде LB (Amresco, США) с добавлением антибиотика канамицина (50 мкг/мл) разводят аналогичной свежей питательно средой в соотношении 1:100, растят до оптической плотности 0,6 D, после чего добавляют 1 мМ IPTG для индукции экспрессии фаговой РНК-полимеразы, и продолжают растить культуру еще 3 часа. Далее культуру центрифугируют и обрабатывают ультразвуковой волной. Для очистки белка используют магнитные наночастицы Dynabeads (Invitrogen, США), конъюгированные с антителами к гистидиновым повторам, согласно инструкции производителя. После этапов очистки проводят оценку стерильности полученного препарата за счет высевов случайно выбранных белковых препаратов на твердых питательных средах и проводят оценку стабильности очищенных белковых препаратов. Очищенные белковые препараты сохраняют структурную целостность на протяжении месяца при температуре хранения +4°С.

Пример 2. Оценка активности предлагаемого способа in vitro, Митотический индекс

Оценку эффективности очищенного белкового препарата интерналин В 321 на пролиферацию клеток НЕр-2 и HUVEC проводили путем оценки митотического индекса через 6 часов после обработки клеточных линий интерналином В 321. Для оценки числа делящихся клеток в полях зрения, клетки линии НЕр-2 и HUVEC наносили на покровные стекла в количестве 20000 клеток/стекло и инкубировали 18 ч в среде DMEM с 2% фетальной бычьей сывороткой (Gibco, USA) без антибиотиков в лунках 12-луночного планшета. Далее культуральную жидкость отбирали и в каждую лунку вносили по 500 мкл среды с очищенным белковым препаратом интерналином В 321 в концентрациях от 250 нг/мл до 1 мкг/мл, в качестве положительного контроля использовался HGF в концентрации 100 нг/мл, в отрицательном контроле проводили замену среды. Клетки инкубировали 6 часов, после чего проводили окраску ядер витальным красителем Hoechst (1 мкг/мл) путем смены среды на среду, содержащую краситель, с последующей инкубацией в течение 30 мин в СО₂ инкубаторе. Митотический индекс клеток, обработанных очищенным белковым препаратом интерналином В 321 в концентрации 1 мкг/мл, был достоверно (р<0,05) выше, чем в отрицательном и положительном контроле и составил для интерналина В 321 - 20,8%, для фактора роста HGF - 14,10%, для отрицательно контроля - 1,2% (фиг. 2).

Пример 3. Оценка активности предлагаемого способа in vitro. Клеточная миграция

Клеточные культуры выращивали до достижения 70-80% монослоя в 24-луночном планшете. Затем, в центральной части лунки проводили царапину с использование одноразового наконечника для автоматического дозатора объемом 200 мкл. После этого клетки дважды промывали средой для удаления планктонных клеток. Затем в лунки вносили очищенный белковый препарат интерналина В 321 в концентрациях от 250 нг/мл до 1 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали HGF в концентрации 100 нг/мл. Отрицательный контроль - клетки в культуральной среде без добавления ростовых факторов. Далее отмечали зону, за которой осуществлялось последующее наблюдение с временными интервалами через 3, 12 и 24 часа. В образцах, обработанных очищенным белковым препаратом интерналином В 321 наблюдалось заметное краевое наползание клеток. В отрицательном и положительном контролях ширина зоны «царапины» была заметно шире (фиг. 3).

Пример 4. Оценка биологической безопасности предлагаемого способа

Постановка кератоконъюктивальной пробы

Конъюктивальная проба является очень чувствительным тестом и в ряде случае позволят выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах.

Аллергопробы проводили с использованием мышей линии C57BI/6 с массой тела 18-20 г. До начала исследований здоровые половозрелые животные, проходили карантин не менее 14 дней. В целях стандартизации животных не кормили в течение суток перед началом эксперимента.

Для постановки пробы 1 капля раствора препарата вводилась глазной пипеткой с вытянутым тонким концом под верхнее веко подопытным и контрольным мышам, во второй глаз вводят по 1 капле раствора, в котором разведен аллерген. Результат оценивали через 15 минут и 24-48 ч. Из 9 подопытных мышей у одной наблюдалось легкое покраснение слезного протока. Концентрация аллергена в пробе была 10 мкг/мл.

Эпикутанная сенсибилизация

Для определения развития неаллергического контактного дерматита на выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища мышей линии BALB-c, ближе к середине туловища, наносили по 3 капли испытуемого раствора, приготовленного на глицерине. Концентрация вещества составляла 300 мкг/мл. Вещество наносили на протяжении 2 недель по 5 раз в неделю. Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб.

Исследование сенсибилизирующего действия вещества проводили путем 20 накожных аппликация на площади 2×2 см боковой поверхности тела по 5 раз в неделю. Первое тестирование по развитию аллергии проводили через 10 аппликаций. Повторное тестирование осуществлялось после 20 аппликаций, для установления слабой аллергизирующей способности.

Если число сенсибилизированных животных в группе по одному из испытанных тестов составляет менее 50%, то наблюдаемые эффекты рассматриваются как проявления индивидуальной чувствительности, если же более 50%, то вещество является потенциальным аллергеном.

Пример 5. Оценка активности предлагаемого способа in vivo

В эксперименте использованы мыши инбредной линии C57BI/6 с массой тела 18-20 г. До начала исследований здоровые половозрелые животные, проходили карантин не менее 14 дней. На спинной стороне предварительно проводили процесс удаления шерсти с помощью механической депиляции триммером. Операционное поле было обработано 70% этанолом. Затем на спине животных вдоль линии хребта верхний слой кожи удаляли путем абразивной обработки с помощью наждачной бумаги. Даная операция проводилась под ингаляционным наркозом, выполненным изофлураном открытой каплей. Затем на раневую поверхность наносили по 50 мкл белкового очищенного препарата интерналина В 321 в концентрации 150 мкг/мл разведенный в глицерине и в отсутствии формообразующего вещества. В качестве отрицательного контроля использовали стерильный глицерин. Фотографии ран и измерения площади поверхности раны делались ежедневно в течение 3 недель до полного выздоровления мышей из всех групп (фиг. 4, фиг. 5).

При экспериментальной проверке эффективности препарата при лечении свежеинфицированных абразивных ран тела получены положительные результаты.

Заключение:

Описанный в патенте способ лечения ран, с применением однократной обработки раневой поверхности лекарственной формой, содержащей интерналин В 321, способствует более быстрому заживлению раневых поверхностей и может быть использован в медицине, ветеринарии и фармакологии в качестве терапевтического средства, использован для разработки новой тактики ведения раневого процесса, а также для разработки лекарственных средств, ускоряющих регенерацию мягких и эпителиальных тканей, отличающихся композитным формообразующим веществом. При этом обработка ран экспериментальных животных очищенными препаратами интерналина В сокращала процесс заживления на 4 дня.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - Структура InlB. Интерналиновый домен выделен цветом.

Фиг. 2 - Активация пролиферации клеток НЕр-2 в присутствии очищенного белкового препарата интерналин В 321 в концентрации 1 мкг мл. В качестве положительного контроля использовали HGF в концентрации 100 нг/мл. Делящиеся клетки наблюдали через 6 часов после добавления белков. Показан митотический индекс (отношение числа делящихся клеток к общему числу клеток в поле зрения). Данные получены усреднением по минимум 10 полям зрения в трех независимых экспериментах.

Фиг. 3 - Результаты скрейч-теста, проведенного с использованием клеточной линии HUVEC, с добавлением очищенного белкового препарата интерналин В 321 в концентрации 1 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали HGF в концентрации 100 нг/мл. Отрицательным контролем служили интактные клетки.

Фиг. 4 - Изменение площади ран у мышей с использованием глицерина, содержащего очищенный белковый препарат интерналин В 321 в концентрации 150 мкг/мл и контрольных мышей, обработанных только стерильным глицерином.

Фиг. 5 - Кривая, отражающая изменение площади ран у мышей с использованием глицерина, содержащего idInlB9 и контрольных мышей, обработанных только стерильным глицерином.