Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА НА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и может быть использовано специалистами, работающими в области производства медицинских и ветеринарных биопрепаратов. Изобретение раскрывает способ определения специфической активности антирабического иммуноглобулина.

Антирабический иммуноглобулин предназначен для экстренной постэкспозиционной профилактики бешенства. Бешенство является опасным заболеванием, характеризуется абсолютной летальностью. Болезнь вызывает вирус Rabies lyssavirus, заражение, как правило, происходит посредством укусов или ослюнения больным животным.

В настоящее время специфическую активность антирабического иммуноглобулина определяют в реакции нейтрализации на белых мышах [1]. Указанный метод основан на нейтрализации вируса бешенства разведениями тестируемого антирабического иммуноглобулина и подразумевает интрацеребральное введение смеси вируссодержащей жидкости и антирабического иммуноглобулина белым мышам. Гибель мышей регистрируют после 5 дня от начала эксперимента. Результат теста учитывают в течение 15-21 дней, расчет титра специфических антител проводят по методу Рида и Менча.

Указанный метод проверен временем и практикой, однако отличается трудоемкостью, требует большого количества животных, длительного времени наблюдения. Помимо этого, Комитет экспертов ВОЗ по бешенству подчеркивает необходимость разработки альтернативных методов определения активности вируса бешенства и антирабических антител без использования животных [2]. В связи с этим разработка альтернативных способов определения антирабических антител представляется актуальной.

В настоящее время разработаны различные способы in vitro для определения уровня антирабических антител.

Известны способы определения уровня специфических антител в сыворотке крови животных, основанные на иммуноферментном анализе. Результаты иммуноферментного анализа могут быть получены в течение нескольких часов. Указанный метод не требует использования живого вируса. На сегодняшний день существуют различные модификации метода иммуноферментного анализа, отличающиеся специфичностью и происхождением антител, особенностями используемых конъюгатов и хромогенных субстратов [3, 4, 5]. Известны диагностикумы для определения уровня антирабических антител, в которых вместо ферментных конъюгатов используются золи коллоидных металлов, в частности золота или серебра. Подобные диагностикумы нашли применение в дот-иммуноанализе [6] или иммунохроматографических тестах [7].

Указанные методы, помимо вируснейтрализующих антител, определяют антитела других типов, поэтому они не могут достоверно свидетельствовать о протективных свойствах профилактического препарата, которые могла бы дать живая система.

В качестве адекватной замены тестам in vivo представляется использование клеточных культур.

Для определения вируснейтрализующих антирабических антител на клеточных культурах известны такие методы, как тест ингибиции фокусов флуоресценции и тест нейтрализации вируса с применением флуоресцирующих антител [8, 9]. Они рекомендованы ВОЗ и Всемирной организацией здоровья животных для детекции уровня вируснейтрализующих антирабических антител [2]. Известны различные модификации указанных методов, основные отличия которых заключаются в использовании различных видов клеточных культур и штаммов вируса бешенства [8-13]. Принцип обоих методов заключается в нейтрализации известного количества вируса бешенства специфическими антителами, содержащимися в исследуемых образцах, с последующей инокуляцией культуры вирусвосприимчивых клеток. Инфицированные клетки обнаруживают с помощью микроскопа после их окрашивания конъюгатом антирабического иммуноглобулина с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-конъюгат). В отличие от теста ингибиции фокусов флуоресценции, в тесте нейтрализации вируса с применением флуоресцирующих антител вместо специальных слайд-камер типа Lab-Tek используют 96-луночные планшеты, что обеспечивает более надежный учет результата [8, 9].

Известен способ определения уровня вируснейтрализующих антирабических антител в сыворотках животных по ингибиции цитопатического действия вируса бешенства на клеточную культуру [14]. Цитопатическое действие предполагает деструктивные изменения отдельных клеток и клеточного монослоя, обнаруживаемые методом световой микроскопии. Сущность способа состоит в том, что проводят взаимодействие вакцинного вируса бешенства штамма 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ с исследуемыми сыворотками, реакционную смесь вирус-сыворотка инкубируют 60 мин при 37°С, вносят суточную интактную культуру клеток почки сайги и помещают в СО₂ - инкубатор с последующим определением на 5-7 сутки титра вирус-нейтрализующих антител по предельному разведению сыворотки, при котором наблюдалось 50% подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток. Учет результатов осуществляют с использованием световой микроскопии.

К недостаткам метода следует отнести субъективную оценку цитопатического действия вируса бешенства на клетку и продолжительность исследования. Более того, при учете результатов в срок, рекомендованный авторами, сложно дифференцировать инфицированную клеточную культуру от интактной, клетки которой находятся на стадии отмирания.

Задача изобретения заключается в разработке способа, позволяющего в короткие сроки с высокой точностью определить специфическую активность антирабического иммуноглобулина на клеточной культуре без использования диагностических препаратов и имеющего корреляцию с результатами реакции нейтрализации на белых мышах.

Технический результат заключается в реализации указанного назначения.

В литературе описаны особенности влияния аттенуированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» на морфологические параметры клеток перевиваемой линии Vero. Методом атомно-силовой микроскопии устанавливают характер изменения геометрических размеров клеток (длины, ширины, высоты) и шероховатости клеточной мембраны в зависимости от времени культивирования вируса бешенства [15].

Технический результат достигается тем, что аттенуированный вирус бешенства штамма «Москва 3253» и исследуемые препараты антирабического иммуноглобулина смешивают, полученную смесь инкубируют в течение 1 ч при 37°С, добавляют к суточной интактной монослойной культуре клеток Vero или ВНК-21, инкубируют при 37°С и 5% CO₂ с последующим определением через 24 ч повреждающего действия вируса на клетку методом атомно-силовой микроскопии, проявляющегося в виде увеличения шероховатости поверхности клетки.

Антирабические антитела, добавляемые к вируссодержащей жидкости, способны нейтрализовать вирус, тем самым устраняя воздействие фактора увеличения шероховатости.

Применение методов атомно-силовой микроскопии в сравнении с методами световой микроскопии позволит уменьшить вероятность ошибок, возникающих при визуальной оценке повреждающего действия вируса бешенства на клеточные культуры. Уровень специфической активности антирабического иммуноглобулина соответствует разведению, которое способно уменьшить возрастание шероховатости поверхности клеток на 50% при их взаимодействии с рабочим раствором вируса бешенства.

Изобретение осуществляют следующим образом.

1. Подготовка монослойной клеточной культуры.

В стерильную чашку Петри или лунку 6-луночного планшета помещают стерильное покровное стекло, размер которого составляет 18×18 мм. Затем в указанную посуду вносят 2 мл суспензии клеток Vero или ВНК-21, концентрация которых составляет 10⁴ кл/мл. Клетки инкубируют в СС₂-инкубаторе при 37°С в течение 24 ч. Качество монослоя контролируют с помощью инвертированного микроскопа. Клетки должны сформировать однородный плотный монослой. Должны отсутствовать мертвые клетки, клеточные конгломераты, а также признаки контаминации.

2. Подготовка разведений антирабического иммуноглобулина.

Препарат антирабического иммуноглобулина разводят в стерильной питательной среде Игла MEM или 199 с содержанием сыворотки КРС от 1 до 5% в соотношении 1:50. В стерильные пробирки добавляют по 1 мл питательной среды. В указанных пробирках готовят трехкратные разведения рабочего раствора иммуноглобулина.

3. Проведение реакции нейтрализации вируса бешенства антирабическим иммуноглобулинам.

В пробирки, содержащие разведения антирабического иммуноглобулина, добавляют равный объем рабочего раствора вируса бешенства в аналогичной питательной среде, перемешивают и инкубируют в термостате при 37°С в течение 1 ч. Одновременно инкубируют пробирки, содержащие рабочий раствор вируса бешенства без добавления антирабического иммуноглобулина (положительный контроль) и рабочий раствор иммуноглобулина (1:50) без добавления вируссодержащей жидкости (второй отрицательный контроль). Рабочее разведение вируса выбирают таким образом, чтобы оно превышало титр вируса в 100 раз. За титр вируса принимают разведение с наименьшей концентрацией вируса, которое бы вызывало статистически достоверное увеличение шероховатости поверхности клеток.

4. Добавление испытуемых образцов к клеточной культуре.

Питательную среду удаляют из лунок планшетов или чашек Петри, содержащих покровные стекла с клеточными культурами. Клеточный монослой однократно промывают раствором Дульбекко без Са²⁺ и Mg²⁺. Затем к монослойной культуре добавляют испытуемые образцы. В качестве первого отрицательного контроля оставляют интактные клетки, к которым добавляют питательную среду, используемую в эксперименте. Оптимальный конечный объем добавляемых жидкостей составляет 2 мл. Клетки инкубируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 24 ч.

5. Фиксация клеточного монослоя.

После инкубации удаляют культуральную жидкость, клеточный монослой промывают раствором Дульбекко без Са²⁺и Mg²⁺. Затем для фиксации клеточной культуры и инактивации вируса бешенства к клеткам добавляют 1 мл 2,5% раствор глутарового альдегида или 4% раствор формальдегида. После чего посуду с клетками помещают в холодильник и инкубируют в течение 2 ч при температуре 4±2°С. После этого фиксирующий раствор удаляют, клетки промывают последовательно 0,1 М фосфатно-солевым буфером и очищенной водой, высушивают на воздухе при комнатной температуре. Затем покровные стекла с клетками извлекают и исследуют методами атомно-силовой микроскопии.

6. Исследование методом атомно-силовой микроскопии и учет результатов. Исследования проводят с помощью сканирующего зондового микроскопа Solver P47-PRO (NT-MDT, Россия) в режиме прерывистого контакта полуконтактным методом. При этом использовали кремниевые зонды серии NSG01 (NT-MDT, Россия) жесткостью 5,1 Н/м, с радиусом кривизны 10 нм и резонансной частотой 150 кГц. Исследования проводили при оптимальных значениях основных параметров сканирования: амплитуда колебаний кантилевера Resonance 22 единицы, начальная фаза его колебаний Phase 240°, скорость сканирования Frequency 0,75 Гц, коэффициент усиления цепи обратной связи FB Gain 0,3 единицы, Set Point 19 единиц. Величина Set Point и начальный уровень сигнала DFL определяли величину силы взаимодействия зонда с поверхностью образца. Среднюю арифметическую шероховатость поверхности клеточной стенки определяли методом Roughness analysis по 30 значениям, полученным в эксперименте, с указанием абсолютной погрешности. Значения шероховатости клеток первого и второго отрицательного контролей не должны статистически различаться при Р=0,05. За конечный результат принимали то разведение, которое ингибировало возрастание шероховатости на 50%. Значение указанного разведения определяли графически. Для построения графика по оси абсцисс откладывали значения реципрокных разведений исследуемого образца, а по оси ординат индекс ингибиции шероховатости, выраженный в процентах и определяемый по формуле:

где I - индекс ингибиции шероховатости; N - значения средней шероховатости поверхности клеток, обработанных смесью иммуноглобулина и вируса; Nn.к. - значения средней шероховатости клеток, обработанных рабочим раствором вируса (положительный контроль); No.к. - значения средней шероховатости неинфицированных интактных клеток (первый отрицательный контроль).

Пример расчета уровня активности антирабических антител приведен на фиг., исходные данные для которого приведены в табл. 1. Уровень активности соответствует разведению 1:400, или 2,6 lg.

В табл. 2 приведены результаты определения уровня активности образцов антирабического иммуноглобулина с помощью способа, описываемого в настоящем изобретении, в сравнении с результатами, полученными в реакции нейтрализации на белых мышах [1].

Список литературы

1. Meslin F. X., Kaplan M. M., Koprowski Н. Laboratory techniques in rabies. - 4th ed. - Geneva: WHO, 1996. - 469 p.

2. WHO Expert Consultation on Rabies: second report. WHO technical report series 982. Geneva, 2013. - 139 p.

3. Жилин E.C., Кошеметов Ж.К., Татыбаева A.T., Матвеева В.М., Алиева А.Б., Мыктыбаева Г.Б. Способ обнаружения антирабических антител с помощью прямого «сэндвич »-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) на основе антиидиотипических иммуноглобулинов. Патент KZ 27137. Опубл. 15.07.2013.

4. Сухарьков А.Ю., Чернышова Е.В., Назаров Н.А. Перспективы использования иммуноферментного анализа для оценки эффективности антирабической вакцинации животных //Актуальные вопросы ветеринарной биологии, №2, 2012, С.34-40.

5. Yanling L., Jingshuang W., Huixin W., Hui W., Yanxia L., Limin L., Yingxia D., Xiangyi L., Xiaozhi L., Jian G., Baoling D. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kit for detecting human anti-rabies virus antibody. Patent CN 104076146. Prior. 19.06.2014.

6. Подборонова H.A., Абрамова Е.Г., Никифоров A.K., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Киреев М.Н., Кутырев В.В. Диагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа. Патент 2360252. Опубл. 27.06.2009 Бюл. №18.

7. Hogli J., Xiaohong X., Zhenqiang X., Jing Sh., Huihui W., Xianping Ch., Bing L., Yu F., Jia Y. Rabies virus IgG antibody immune gold-labeled test paper and preparation method thereof. Patent CN 104360061. 18.02.2015.

8. Bedekovic Т., Lemoa N., Lojkic I., Mihaljevic Z., Jungic A., Cvetnic Z., Cac Z., Hostnic P. Modification of the fluorescent antibody virus neutralization test - Elimination of the cytotoxic effect for the detection of rabies virus neutralising antibodies / Journal of Virological Methods. 2013. №189. P. 204-208.

9. Cliquet F., Aubert M., Sagne L. Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVN test) for the quantitation of rabies - neutralising antibody / Journal of immunological methods. 1998. №212. P. 79 - 87.

10. Вишняков И.Ф., Недосеков B.B., Груздев K.H., Балышев В.М., Жестерев В.И., Горшкова Т.Ф. Способ определения антирабических вируснейтрализующих антител. Патент 2130187. Опубл. 10.05.1999.

11. Баркова И.П., Нагиева Ф.Г., Никулина В.Г., Лисаков А.Н. Быстрый культуральный метод для индикации антигенов вируса бешенства в инфицированных клеточных культурах / Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 3. №4. С. 323 - 326.

12. Хисматуллина Н. А., Гулюкин А. М, Шуралев Э. А., Хаертынов К. С, Чернов А. Н., Филимонова М. Н., Авзалова А. Ф., Паршикова А. В., Иванов А. В. Ускоренный метод диагностики бешенства в культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) / Гены и клетки. 2014. Т. IX, №3. С. 276 - 280.

13. Tingrong L., Haibo Т., Yizhi Zh., Xiankai W., Zhuanling L., Xiaoning L., Suhuan L., Jingjing L. Novel neutralizing antibody detection method based on rescued recombinant attenuated rabies virus. Patent CN 104198446. Prior. 21.07.2014.

14. Сливко И.А., Недосеков В.В., Жестерев В.И., Горшкова Т.Ф., Курильчук Ю.Н., Анисимова Л.И., Жданова Н.А., Баньковский Д.О., Лаптева О.Г., Хухоров И.Ю., Ногина И.В. Способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител. Патент 2254575. Опубл. 20.06.2005. Бюл. 17.

15. Генералов С.В., Ерохин П.С., Красовская Т.Ю., Осина Н.А., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Щербакова С.А. Изучение ультраструктуры поверхности клеток линии Vero, инфицированных вирусом бешенства (RABV, Lissavirus, Rhabdoviridae) // Вопросы вирусологии, Т. 62, №5, С. 227-232.