Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ НЕРАЗРУШАЮЩЕЙ ДИАГНОСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ РАСТЕНИЙ EX VITRO И IN VITRO

Изобретение относится к экспериментальной биологии, растениеводству, биотехнологии, сельскому и лесному хозяйству и может быть использовано для оценки функционального состояния растений ex vitro и in vitro, в том числе при оптимизации условий выращивания, хранения, а также для выявления степени устойчивости растений к различным неблагоприятным факторам среды обитания.

Известны оптические способы оценки функционального состояния растений, основанные на регистрации спектров поглощения или коэффициентов отражения/пропускания на определенных длинах волн или параметров флуоресценции хлорофилл-содержащих тканей [1-4]. О функциональном состоянии судят по различиям оптических параметров, полученных при измерениях опытных и контрольных растений. Наиболее точное определение функционального состояния растений основано на комплексной информации о фотосинтетической активности и ее устойчивостью к фотоингибированию, но ни один из известных устройств не позволяет проводить такие оценки за один измерительный цикл. Для этого приходится проводить трудоемкую процедуру измерения оптических параметров после темновой адаптации растений, затем освещать их в течение нескольких часов интенсивным светом, выше порога насыщения фотосинтеза, затем также в течение нескольких часов проводит процедуру темновой адаптации растений, и затем вновь измерять оптические параметры. Известен способ оценки функционального состояния растений по критериям фотосинтетической активности и устойчивости к фотодеструкции, основанный на измерении динамики светорассеяния под воздействием синего и красного излучения [5]. Реализация данного способа требует точного совмещения излучателей, что трудно обеспечить конструктивно, зоны засветки синим и красным излучателем не совпадают, что приводит к неправильной оценке функционального состояния растений. Для получения достоверной информации об устойчивости к фотодеструкции здоровых растений, приходится прибегать к довольно длительным засветкам объектов красным излучением (свыше 40 минут), что делает неприемлемым использование метода для массовой оценки растений, например, при оптимизации агротехнических условий выращивания. Помимо этого, реализация способа-аналога предполагает непосредственный контакт листа исследуемого растения с излучателями и неприемлем для оценки функционального состояния растений в культуре in vitro без нарушения стерильности.

Цель изобретения - снижение трудоемкости определения функционального состояния растений ex vitro и in vitro и повышение ее эффективности посредством количественной оценки фотосинтетической активности хлорофилл-содержащих тканей растений и их устойчивости к фотоингибированию за один измерительный цикл.

Способ осуществляется следующим образом. Регистрируют спад интенсивности флуоресценции хлорофилла (ФХ) листьев в процессе первой засветки монохроматическим оптическим излучением синей области спектра (в зоне первого максимума поглощения хлорофилла 460…480 нм) плотностью мощности свыше насыщения фотосинтеза (600…900 Вт/м²) в течение 30…180 секунд, затем отключают засветку на 30…60 секунд и после этой темновой восстановительной паузы, в той же зоне измерений объекта вновь регистрируют спад интенсивности ФХ в процессе второй засветки монохроматическим оптическим излучением синей области спектра той же плотности мощности в течение 30…180 секунд. Длительность засветок определяется временем, необходимым для перехода сигнала к стационарному уровню.

О фотосинтетической активности судят по относительной амплитуде спада интенсивности ФХ в течение первой засветки оптическим излучением синей области спектра, а об ее устойчивости к фотоингибированию - по отношению амплитуд спада интенсивностей ФХ в процессе второй и первой засветок. Количественно фотосинтетическая активность и ее устойчивость к фотоингибированию определяются показателями К_ФСА и К_УФИ, которые рассчитываются по следующим формулам:

где - максимальная интенсивность ФХ на 1…2 секунде первой засветки; - стационарный уровень интенсивности ФХ на 30…180 секунде первой засветки; - максимальная интенсивность ФХ на 1…2 секунде второй засветки; - стационарный уровень ФХ на 30…180 секунде второй засветки.

При этом о фотосинтетической активности и ее устойчивости к фотоингибированию судят по величине показателей К_ФСА и К_УФИ соответственно. Чем выше значение данных показателей - тем выше фотосинтетическая активность и ее устойчивость к фотоингибированию.

Пример. Для измерений использовали листья лимона с высоким уровнем функционального состояния фотосинтетического аппарата. Для этого были проведены измерения потенциального квантового выхода Y фотосистемы 2, величина которого прямо пропорциональна активности фотосинтеза. Для исследования выбирали листья со значением Y свыше 0,74 отн. ед., которые были разделены на 3 группы. Первая группа - контрольная (вариант А), вторая группа (вариант В) - подвергалась в течение 5 минут тепловой обработке при температуре +52°С, что приводило к небольшому ингибированию фотосистемы-2 фотосинтезирующего аппарата и третья группа (вариант С) - подвергалась в течение 15 минут тепловой обработке при температуре +56°С, что приводило к значительному ингибированию функций фотосистемы-2. Далее листья всех вариантов проходили следующую процедуру измерений. После темновой 30 минутной адаптации небольшой участок листа площадью 2 мм² подвергали засветке оптическим излучением с длиной волны 475 нм и плотностью мощности 800 Вт/м², в процессе которой фиксировали изменение интенсивности ФХ в режиме отражения. Длительность засветки продолжалась 60 секунд, по окончании которой источник отключался на 60 секунд. После темновой паузы, в той же самой зоне листа, в течение 60 секунд фиксировали динамику изменения интенсивности ФХ в процессе второго цикла засветки синим излучением и затем определяли параметры К_ФСА и К_УФИ по формулам 1 и 2 (таблица 1). Типичные качественные кривые (фиг. 1) имеют следующие особенности реакции ФСА на засветку в зависимости от функционального состояния:

- в варианте «А» с высоким функциональным состоянием ФСА контрольных листьев (фиг. 1А) наблюдается бурный спад ФХ в первые секунды засветки синим светом, который после темновой паузы частично восстанавливается. При этом следует отметить, что относительная амплитуда перепада интенсивности ФХ (показатель К_ФСА) восстанавливается за 60 секунд темновой паузы на 92,72% (с 0,8106 до 0,7516 от.ед.), тогда как абсолютная амплитуда перепада (показатель К_УФИ) - только на 55,75% (с 43,49 до 24,25 усл.ед.);

- в варианте «В» (фиг. 1В), абсолютный перепад ФХ в процессе первой засветки несколько меньше, и после темновой паузы он и восстанавливается существенно хуже - только на 27,42%. В то же время показатель К_ФСА и в первом и во втором цикле засветки остается достаточно высоким (0,7993 и 0,6215 соответственно);

- в варианте «С» с низким функциональным состоянием ФСА (фиг. 1С) и абсолютная и относительная амплитуда перепада сигнала в первом цикле засветки существенно меньше, чем у вариантов «А» и «В» (табл. 1). После темновой адаптации, в результате второго цикла засветки, и без того достаточной низкий показатель К_ФСА уменьшается практически в 3 раза, тогда как показатель устойчивости к фотоингибированию (К_УФИ) меняется незначительно (с 27,42% до 22,98%).

Эти закономерности характерны для листьев различных видов растений ex vitro и in vitro, с вариациями по амплитуде перепада кривых светорассеяния в зависимости от генотипических и фенотипических особенностей.

По результатам измерений (таблица 1) следует важный вывод, что для корректной оценки функционального состояния растительных организмов необходимо оценивать и фотосинтетическую активность и устойчивость к фотоингибированию одновременно.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет в рамках единой оптической схемы, за один цикл измерений в течение нескольких минут количественно оценивать функциональное состояние растений по параметрам, отражающим уровень фотосинтетической активности и устойчивость к фотоингибированию. На аналогичные оценки с помощью типовых методик и оборудования затрачивается несколько часов. Способ позволяет оценивать функциональное состояние не только растений ex vitro, но и растений in vitro без нарушения стерильности.

Литература

1. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. - М.: Наука, 1990. - 200 с.

2. Лепедуш X., Вильевач М, Цезар В., Любешич Н. Оценка функционального состояния фотосинтетического аппарата у хвои ели с признаками хлороза на слабом и сильном свету по изменению флуоресценции хлорофилла in vivo // Физиология растений. - 2005. - Т. 52, №2. - С. 191-197.

3. Мерзляк, М.Н. Гительсон А.А., Чивкунова О.Б., Соловченко А.Е., Погосян С.И. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений // Физиология растений. - 2003. - Т. 50, №5. - С. 785-792.

4. Murata N., Takahashi S., Nishiyama Y., Allakhverdiev S.I. Photoinhibition of photosystem II under environmental stress // Biochem. Biophys. Acta. - 2007. - V. 1767. - P. 414-421.

5. Патент РФ №2592574 на изобретение «Оптический способ оценки функционального состояния растений» / авторы Будаговская О.Н., Будаговский А.В., Гончаров С.А. - Заявка №2014148848 от 03.12.2014. - Опубл. 27.07.2016 Бюл. №16.