Способ оценки про- и антимикробных свойств проб

Изобретение относится к области биоизмерительных технологий, а именно к способам оценки с помощью тестовых микроорганизмов про- и антимикробных свойств различных проб (включая пробы, содержащие активно светопоглощаюшие либо светорассеиваюшие вещества и материалы, мешающие оптическому анализу общего состава таких проб).

Известен «Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам» (патент RU №2505813, МПК G01N 33/48, дата приоритета 06.11.2012, опубликовано 27.01.2014), в котором антимикробную активность тестируемых веществ по отношению к тому или иному биоматериалу предлагается определять, исходя из количества колоний микроорганизмов, исходно содержащихся в означенном биоматериале и выросших на плотной накопительной питательной среде в присутствии тестируемого препарата, а также времени проявления видимого роста этих колоний. Недостатками этого способа являются его длительность (до 3-х суток), большая трудоемкость, большая материалоемкость по компонентам питательных сред, а также то, что антимикробная активность тестируемых веществ определяется визуально, а следовательно, достаточно субъективно.

Известен «Способ оценки эффективности антимикробного воздействия антисептиков на бактерии, существующие в форме биопленки» (патент RU №2603100, МПК C12Q, дата приоритета 29.10.2015, опубликовано 20.11.2016), в котором эффективность действия антисептиков на бактерии, выделенные из клинического материала пациента и существующие в жидкой питательной среде (ЖПС) в форме биопленки, предлагается определять как отношение рабочей концентрации антисептика к его минимальной подавляющей концентрации. При этом регистрацию эффективности действия той или иной концентрации тестируемого антисептика на биопленку предлагается проводить с помощью фотометра - по изменению цвета и помутнению ЖПС с тестовыми микроорганизмами, инкубируемой при заданной температуре в течение заданного времени (от 5-и суток и более) в присутствии тестируемого антисептика, взятого в упомянутой концентрации. Основными недостатками этого способа, как и в предыдущих случаях, являются его большая длительность и трудоемкость, а также невысокая объективность, поскольку рассматриваемый способ позволяет оценивать влияние тестируемых веществ лишь на скорость роста тестовых микроорганизмов, но не на интенсивность их метаболизма.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ определения бактерицидных свойств сыворотки крови» (патент RU №2489489, МПК C12Q 1/18, дата приоритета 26.12.2011, опубликовано 10.08.2013), в котором бактерицидные свойства проб сыворотки крови определяют по уменьшению интенсивности люминесценции инкубируемого в LB-бульоне в присутствии тестируемых проб тестового трансгенного штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, эффективно экспрессирующего luxAB-гены грамотрицательного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi (в результате чего синтезируется фермент люцифераза, обеспечивающий активное свечение, интенсивность которого зависит от общего количества жизнеспособных тестовых микроорганизмов и активности их метаболизма). При этом анализ осуществляют следующим образом:

на первом (подготовительном) этапе выращивают штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 на LB-агаре в присутствии канамицина в конечной концентрации 40 мкг/мл (что позволяет исключить рост не люминесцирующих штаммов) при 37°С в течение 24 часов. Полученную биомассу смывают стерильным LB-бульоном, после чего полученную суспензию стандартизуют до оптической плотности 1,2 отн. ед. при 540 нм (измеряемой в кюветах с длиной оптического пути 1 см);

на втором (основном) этапе смешивают суспензию бактериальных клеток и исследуемого образца сыворотки крови в соотношении 1:1 и инкубируют полученную смесь при 37°С в течение 30 минут. При этом до и после инкубации из тестовой смеси производят отбор аликвот по 250 мкл в кюветы для биолюминометра. И дополнительно вносят в них по 2 мкл деканаля в конечной концентрации 7×10^-6 М (окисляемого в присутствии молекулярного кислорода ферментом люциферазой - что и обеспечивает активное свечение тестового штамма).

На завершающем этапе осуществляют регистрацию уровня свечения в пробах в видимой сине-зеленой области спектра (420-600 им). При этом в качестве измерительного прибора могут использоваться биохемилюминометр «Биоток-10М», а также прочие отечественные и зарубежные люминометры, работающие в обозначенной области спектра и обеспечивающие соответствующую чувствительность измерений.

К основным недостаткам данного технического решения можно отнести:

- узкую область применения (анализ бактерицидных свойств только лишь сыворотки крови человека и животных);

- необходимость использования специально выведенного, трансгенного, узкоспециализированного штамма тестовых микроорганизмов - что дополнительно ограничивает область применения данного технического решения, поскольку для тестирования про- и антибиотических свойств разных химических и физических факторов могут требоваться разные тестовые организмы (либо лучше даже совокупность из нескольких разных видов и штаммов тестовых организмов);

- кроме того, штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, применяемый при реализации данного технического решения, не является широко доступным, и потому достаточно трудно сначала получить данный штамм, а затем длительное время поддерживать его чистоту, жизнеспособность и специфические свойства (выражающиеся, в частности, в активном синтезе фермента люциферазы);

- а также то, что рассматриваемый метод обладает не очень высокой объективностью, поскольку влияние тестируемых объектов (в качестве которых в данном случае выступают образцы сыворотки крови животных и человека) на тестовые организмы определяется всего лишь по одному косвенному параметру (интенсивности хемилюминесценции этих объектов) и с использованием тест-культуры с метаболизмом, не типичным по ряду параметров для большинства живых организмов.

В связи с неуклонным ростом производства и потребления человеческим обществом различной продукции все более актуальной в настоящее время становится проблема разработки достаточно экспрессных, объективных, простых, дешевых и доступных для широкого использования методов оценки про- и антибиотических свойств различных веществ, материалов, препаратов, пищевой и иной продукции, отходов различных производств и т.п.

В связи с вышесказанным, целью заявляемого изобретения стало создание способа, позволяющего, по сравнению с прототипом, более широкому кругу пользователей с большей объективностью оценивать про- и антимикробные свойства существенно более широкого круга тестируемых проб (включая пробы, содержащие активно светопоглощаюшие либо светорассеиваюшие вещества и материалы, мешающие оптическому анализу общего состава таких проб).

Цель эта достигается за счет того, что в предлагаемом способе (который включает такие операции как: подготовка тестовых образцов, инкубирование этих образцов как в присутствии тестируемых проб, так и в их отсутствие, сопровождающееся измерением свойств этих образцов в начале и в конце их инкубации, и последующее определение про- и антимикробных свойств тестируемых проб на основании упомянутых измерений) тестовые образцы перед началом их инкубирования представляют собой Lactobacillus sp.в количестве от 5×10⁵ до 5×10⁶ жизнеспособных клеток на мл, суспендированную в водном растворе, изначально содержащем 35-45 г/л сухого молока, и имеющем рН 6,6-7,4; инкубирование этих образцов в присутствии тестируемых проб проводят в течение 4-8 часов при температуре, оптимальной для развития штамма Lactobacillus, выбранного в качестве тестового (в диапазоне от 20 до 45°С); свойства образцов определяют путем измерения значений рН, редокс потенциала (Е) и электропроводности (X); после чего общую степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми пробами определяют по формуле:

ε_S=(ε_pH+0,4ε_E+0,6ε_X)/2,

где ε_рН, ε_E и ε_X определяют по формулам ε_Y=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc,

где ΔY=Ye-Yb - разности значений рН, Е или X, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации тестовых образцов в присутствии тестируемых проб (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).

При этом, выбор Lactobacillus в качестве тестовых микроорганизмов связан с тем, что кисломолочные бактерии широко распространены в природе, обладая развитой ферментной системой, активно участвуют в естественном разложении многих природных и антропогенных материалов, легко культивируются и, вследствие всего вышеупомянутого, достаточно широко используются в различных методах биотестирования, научных исследованиях, а также биотехнологических процессах.

Выбор количества жизнеспособных тестовых микроорганизмов, которое должно присутствовать в тестовых образцах перед началом их инкубации в присутствии и в отсутствие тестируемых проб (от 5×10⁵ до 5×10⁶ кл/мл), определяется тем, что при меньшем количестве таковых микроорганизмов увеличивается длительность инкубации, необходимая для достижения максимальной чувствительности заявляемого способа анализа; а при большем количестве тестовых микроорганизмов снижается интенсивность их роста и метаболизма, что приводит к уменьшению чувствительности анализа.

Выбор исходного состава жидкой питательной среды, входящей в состав тестовых образцов (водный раствор с рН 6,6-7,4, содержащий 35-45 г/л сухого молока), связан с необходимостью обеспечения оптимальных условий для развития в этой среде тестовых микроорганизмов - что, как и в предыдущем случае, нужно для увеличения чувствительности и снижения продолжительности анализа.

Выбор режима инкубирования тестовых образцов (4-8 часов при 20-45°С) связан с тем, что при более длительном инкубировании снижается интенсивность роста и метаболизма тестовых микроорганизмов (что приводит к соответствующему снижению чувствительности анализа); при других температурах инкубирования интенсивность роста и метаболизма тестовых микроорганизмов также снижается (что приводит к уменьшению чувствительности анализа и необходимости увеличения его длительности); а при меньшем времени инкубирования тестовые микроорганизмы не успевают в достаточной степени среагировать на изменения в окружающей их среде, вызванные присутствием там тестируемых проб (что приводит к снижению как чувствительности, так и объективности анализа).

Увеличение (по сравнению с прототипом) объективности и спектра применимости заявляемого способа анализа обеспечивается тем, что в ходе него осуществляется точная, инструментальная, количественная оценка изменения 3-х различных параметров (рН, Е и X), характеризующих метаболическую активность общепринятых тестовых микроорганизмов (Lactobacillus sp.) вследствие воздействия на них широкого круга тестируемых проб (включая пробы, содержащие активно светопоглощаюшие либо светорассеиваюшие вещества и материалы, мешающие оптическому анализу общего состава таких проб). В то время как в прототипе влияние тестируемых проб на тестовые микрорганизмы определялось всего лишь по одному параметру тестового образца (а именно, интенсивности его хемилюминесценции), достаточно косвенно характеризующему метаболическую активность тестовых микроорганизмов. Причем данным способом предлагалось оценивать бактерицидные свойства весьма узкого круга тестируемых проб (а именно, сыворотки крови человека и животных), и к тому же, с помощью трансгенного, узкоспециализированного штамма тестовых микроорганизмов (Bacillus subtilis ВКПМ В-10548) с достаточно нетипичным метаболизмом.

А доступность заявляемого способа анализа более широкому кругу пользователей обеспечивается, во-первых, возможностью применения для регистрации параметров тестовых образцов таких простых в эксплуатации, доступных и дешевых, переносных приборов, как например иономер «Эксперт-001» и кондуктометр «Эксперт-002». Во-вторых, применением при анализе минимального числа дополнительных реагентов и ручных операций по засеву и оценке роста и метаболической активности тестовых микроорганизмов в присутствии тестируемых проб (в то время как в прототипе предлагалось использовать такие специфические химические реагенты, как канамицин, деканаль и т.п., а также осуществлять множество дополнительных ручных операций по выращиванию тестовых микроорганизмов на LB-агаре и последующему приготовлению суспензии бактериальных клеток в LB-бульоне). И в-третьих, возможностью применения для анализа таких хорошо доступных и легко культивируемых тестовых микроорганизмов, как Lactobacillus sp.(в то время как в прототипе в качестве тестовых микроорганизмов предлагалось использовать штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, мало доступный и трудно культивируемый в условиях необходимости поддержания требуемой степени чистоты и жизнеспособности данной микробиологической культуры, нужных для осуществления Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 таких специфических свойств, как, в частности, активный синтез фермента люциферазы).

Реализация предлагаемого способа оценки про- и антимикробных свойств проб осуществляется следующим образом:

Этап 1. Готовится питательная среда (ПС), представляющая собой стерильный водный раствор с рН 6,6-7,4, содержащий 35-45 г/л сухого молока. После чего все емкости с ПС хранятся в герметично закрытом виде, в отсутствие света, при 2-4°С.

Этап 2. Отбираются тестируемые пробы (ТП); после чего доставляются в лабораторию и хранятся там до начала анализа в темном месте, в герметически закрытом виде, при 2-4°С.

Этап 3. Подготавливается исходный тестовый образец (ТО). Для чего в одну большую емкость с ПС стерильно вносится 1-10 об. % закваски, содержащей суспендированные в ПС жизнеспособные клетки Lactobacillus sp. После чего упомянутая емкость герметично закрывается и инкубируется в течение 12 ч при температуре, оптимальной для развития штамма Lactobacillus, выбранного в качестве тестового (из диапазона от 20 до 45°С).

Затем в упомянутой емкости измеряется рН. И по предварительно построенному калибровочному графику (представляющему собой зависимость рН ТО от концентрации содержащихся в нем клеток Lactobacillus sp.) удостоверяется, что полученное значение рН соответствует концентрации Lactobacillus sp. в ТО от 5×10⁵ до 5×10⁶ клеток на мл (кл/мл).

После этого, если измеренное значение рН соответствует концентрации Lactobacillus sp.в ТО меньше 5×10⁵ кл/мл; то емкость с ТО инкубируется в тех же условиях, что и ранее в течение еще 6 ч; после чего для нее проводится повторное определение рН. А если измеренное значение рН соответствует концентрации Lactobacillus sp.в ТО больше 5×10⁶ кл/мл; то ТО в той же емкости разбавляется необходимым количеством ПС.

Этап 4. Если нас интересует концентрационная зависимость про- либо антимикробного действия тестируемых проб, либо эти пробы имеют слишком высокую исходную токсичность (так что ожидается, что в неразведенном виде они будут слишком сильно ингибировать развитие тестовых микроорганизмов), то делается необходимое количество разведений исходных проб. После чего каждая проба или каждое ее разведение делится на 3-5 равных частей, каждая из которых помещается в отдельную емкость, куда также добавляется заданное количество ТО, подготовленного на 3-м этапе анализа.

Этап 5. Все емкости, приготовленные на 4-м этапе анализа, плюс некоторое количество контрольных емкостей, содержащих ТО без добавок тестируемых проб (а также, в случае необходимости, ТО с заданным количеством вещества или смеси веществ, про- или антимикробная активность которых известны заранее) закрываются, перемешиваются и помещаются в термостат, где инкубируются в течение 4-8 часов при температуре, оптимальной для развития штамма Lactobacillus, выбранного в качестве тестового (из диапазона от 20 до 45°С). При этом непосредственно перед началом и после окончания этой инкубации во всех упомянутых емкостях регистрируются значения таких параметров ТО (изменяющихся вследствие роста и размножения там тестовых микроорганизмов, а также преобразования ими в ходе метаболической активности одних веществ, входящих в состав ТО, в другие) как рН, редокс потенциал (Е) и электропроводность (X).

Этап 6. После этого общая степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми пробами рассчитывается по формуле ε_S=(ε_pH+0,4ε_E+0,6ε_X)/2,

где ε_pH, ε_E и ε_X определяют по формулам ε_Y=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc,

где ΔY=Ye-Yb - разности значений рН, Е или X, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации ТО в присутствии тестируемых проб (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).

Упомянутый способ может быть реализован с применением таких основных измерительных приборов, как иономер «Эксперт-001» (или иной, позволяющий с достаточной степенью чувствительности измерять рН и редокс потенциал жидких, водных образцов) и кондуктометр «Эксперт-002» (или иной, позволяющий с достаточной степенью чувствительности измерять изменение электропроводности жидких, водных образцов).

Более детально настоящее изобретение описывается следующим конкретным примером. Исследовались пробиотические свойства мелкодисперсных, нерастворимых в воде порошков, содержащих лигнин, гречневый продел и β-глюкан, выделенный из вешенки обыкновенной (Pleurotis ostreatus). Каждый из этих порошков в количестве 0,2 гр добавлялся (по 3-и пробирки впараллель) к 6 мл тестовой среды (ТС), в качестве которой использовались суспензии, содержащие около 10⁶ жизнеспособных клеток Lactobacillus acidophilus АТСС 4356, Lactobacillus helveticus АТСС 8018 либо Lactobacillus kefiri АТСС 35411 в 1 мл водного раствора, исходно стерильного, имевшего рН 7,0±0,2 и содержавшего 40 г/л обезжиренного сухого молока. Затем все эти пробирки (включая 9 контрольных, содержавших те же ТС, но без добавления какого-либо из тестируемых материалов) перемешивались, закрывались ватно-марлевыми пробками и инкубировались при 30°С в течение 7-и часов. При этом непосредственно перед началом инкубации и сразу после ее окончания последовательно у ТС в каждой из пробирок регистрировались рН, редокс потенциал (Е) и электропроводность (X). Причем значения рН и Е регистрировались с помощью иономера «Эксперт-001» с комбинированными электродами «ЭСК-10601/7» и «ЭРП-105». А значения X регистрировались с помощью кондуктометра «Эксперт-002» с датчиком «УЭП-П-С», работающим на частоте 1,6 кГц.

Далее, изменения каждого из измеренных параметров ТС рассчитывались по формуле: ΔY=Ye-Yb (где Yb и Ye - значения рН, Е или X, зарегистрированные в каждой из контрольных и тестовых пробирок в начале и в конце их инкубирования). Затем все полученные значения ΔY_i усреднялись (по пробиркам, содержащим одни и те же материалы в одних и тех же ТС), и для каждого из усредненных значений рассчитывался 95% доверительный интервал. После чего общая степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми материалами рассчитывалась по формуле: ε_S=(ε_pH+0,4ε_E+0,6ε_X)/2,

где ε_Y=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc, a ΔYt и ΔYc - изменения значений рН, Е или X, произошедшие за время инкубирования ТС в присутствии тестируемых материалов (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc). Результаты этих расчетов представлены в таблице 1.

Из представленного видно, что у разных видов и штаммов Lactobacillus реакция на присутствие тестируемых проб, в целом, была в значительной мере сходной. При этом лигнин в наименьшей степени активировал жизнедеятельность тестовых микроорганизмов (очевидно, только за счет обеспечения возможности сорбции тестовых микрорганизмов на его поверхности). В то время как для β-глюкана и гречневого продела этот эффект проявлялся в большей степени (поскольку помимо сорбции тестовых микрорганизмов на их поверхности, последние, очевидно, имели возможность также использовать часть веществ, входящих в состав тестируемых материалов в процессах своего метаболизма).

Таким образом, заявляемый способ может обеспечить расширение области применения оценки про- и антимикробных свойств различных проб (включая пробы, содержащие активно светопоглощаюшие либо светорассеиваюшие вещества и материалы, мешающие оптическому анализу общего состава таких проб), а также повышение объективности такой оценки и доступности ее для использования более широким кругом пользователей.