ЭКОБИОПРЕПАРАТ "ЦЕНТРУМ-MMS" ДЛЯ ОЧИСТКИ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к биотехнологии защиты окружающей среды и предназначено для проведения биоремедиационных мероприятий по очистке от загрязнителей углеводородной природы, в первую очередь от нефти и горючесмазочных веществ. Изобретение может быть использовано в процессе биологической очистки окружающей среды, локальных проливов сырой нефти, различных горючесмазочных веществ, промывки деталей, топливных резервуаров, обработки технических территорий, бензоколонок, мест мойки машин и т.д.

Известен штамм Rhodococcus erythropolis для разложения нефти и нефтепродуктов (патент РФ 2257409, МКИ C12N 1/20, B09C 1/10, 2004 г.). Штамм депонирован как Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1668 и обладает сравнительно высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов.

Однако недостатками препарата, созданного на основе известного штамма, являются, во-первых, его монокомпонентность, то есть в препарате представлен один вид микроорганизмов, что не может обеспечить высокий потенциал деградационной активности, а следовательно, скорость утилизации нефтепродуктов при ремедиации почв; во-вторых, необходимость проводить дополнительную активацию препарата; в-третьих, отсутствует возможность утилизировать "тяжелые" и ароматические углеводороды, а также использовать штамм для биологического разложения других видов окотоксикантов (спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.).

Известен бактериальный препарат "Родер" для очистки почв, нефтешламов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов (патент РФ 2295403, МКИ B09C 1/10, C02F 3/04, C12N 1/20, 2007 г.). Препарат основан на культивировании R-форм штаммов Rhodococcus erythropolis ВКМ АС-1514 и Rhodococcus rubber ВКМ АС-1513 D. Препарат может быть получен в виде сухой формы и в виде концентрированной суспензии, поэтому характеризуется длительными сроками хранения и удобством транспортировки.

Однако недостатком известного препарата является его состав, включающий штаммы из одной таксономической группы, что определяет его недостаточную деградационную активность и ограничивает применение в ремедиации почв, особенно при техногенных загрязнениях нефтепродуктами, содержащими "тяжелые", а также ароматические углеводороды. Препарат малоэффективен для биологического разложения других органических экотоксикантов (спирты, альдегиды, технические масла, жиры), кроме того, данный препарат имеет невысокую активность при низких температурах и требует более чем однократную обработку загрязненного объекта.

Таким образом, перед авторами стояла задача разработать биологический препарат, характеризующийся высокой деградационной активностью в отношении сырой нефти и различных видов углеводородных топлив, которая сохраняется при сравнительно низких температурах окружающей среды, что дает возможность его применения для ремедиации почв, например, в северных нефтедобывающих районах.

Поставленная задача решена путем применения нового биологического препарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов на основе биомассы консорциума аэробных бактериальных культур, содержащего микроорганизмы Rhodococcus erythropolis, отличающегося тем, что он содержит штамм Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и штамм Rhodococcus erythropolis В KM Ac-1769 при их объемном соотношении, равном 1:1, и дополнительно глицерин при следующем соотношении (мас.%):

В настоящее время из патентной и научно-технической литературы не известен биопрепарат-деструктор нефти и нефтепродуктов, состав которого представляет собой биомассу консорциума аэробных бактериальных культур штамма Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1769, взятых в определенном массовом соотношении, и который дополнительно содержит глицерин.

Предлагаемый биопрепарат представляет собой смесь двух природных штаммов бактерий, активно окисляющую углеводороды. Исследования, проведенные авторами, позволили выявить синергетический эффект в деградации углеводородов нефти и нефтепродуктов. Штамм Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 активен при утилизации "тяжелых" углеводородов, а штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1769 прежде всего активен при утилизации ароматических углеводородов. Но не было очевидно, что консорциум этих штаммов проявит высокую биодеградационную активность в отношении сырой нефти и различных видов углеводородных топлив. Препарат может быть также использован для биологического разложения других видов экотоксикантов (спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.). Преимуществом предлагаемого препарата является возможность его применения для ремедиации почв при сравнительно низких температурах окружающей среды (8-12°C), что особенно актуально для северных нефтедобывающих районов.

Жидкий бактериальный препарат "ЦЕНТРУM-MMS" представляет собой суспензию светло-кремового цвета, содержащую живые микробные клетки двух штаммов, обладающих углеводородокисляющими свойствами, и стабилизатор. В качестве стабилизатора используют глицерин. Глицерин (Glycerin) - органическое соединение, относящееся к полиолам - спиртам, содержащим в молекуле несколько гидроксильных групп.

Глицерин находит широкое применение в медицине и производстве фармацевтических препаратов. Глицерин используют для растворения лекарств, придания влажности таблеткам и пилюлям, повышения вязкости жидких препаратов, предохранения от энзиматических изменений при ферментации жидкостей и от высыхания мазей, паст и кремов. Глицерин является отличным растворителем йода, брома, фенола, тимола, танина, алкалоидов и хлорида ртути. Используя глицерин вместо воды, можно приготовить высококонцентрированные медицинские растворы. Глицерин также обладает антисептическими свойствами, поэтому его применяют для предотвращения инфицирования ран. Антисептические и консервирующие свойства глицерина связаны с его гигроскопичностью, благодаря которой происходит дегидратация бактерий, что способствует их длительному сохранению. Экспериментальным путем определены оптимальные пределы содержания глицерина в предлагаемом препарате. Превышение количества глицерина более 6 мас.% приводит к излишку его по отношению к микроорганизмам, что может вызвать их чрезмерную дегидратацию. При содержании менее 5 мас.% наблюдается существенное снижение консервационных свойств препарата, а соответственно, и сокращение сроков его хранения. Для приготовления препарата используют жидкую культуру двух совместно (или раздельно) выращенных на синтетической минеральной среде бактериальных штаммов.

Производственные штаммы выделены из окружающей среды, относятся к группе сапрофитов, не патогенны для человека и животных согласно классификации микроорганизмов, приведенных в Санитарных правилах СП 1.2.731-99. Работа со штаммами не требует специальных мер предосторожности.

Штаммы в работе используются в виде агаровых и нативных жидких бактериальных культур.

Штамм Pseudomonas fluorescens (ВКМ В-6847)

Клетки - грамотрицательные палочки. Колонии на питательном агаре круглые блестящие, при пониженной температуре образуют диффундирующий нефлюоресцирующий зеленоватый пигмент, в жидкой питательной среде штамм образует равномерную муть. Строгий аэроб, оксидазо- и каталазоположительный, аргинингидролазной и денитрифицирующей активностью не обладает. Активно утилизирует при отсутствии других источников углерода различные органические вещества и углеводородсодержащие соединения. Хорошо растет на синтетических жидких питательных средах, используя в качестве единственного источника энергии и питания углеводородсодержащие вещества, при глубинном культивировании в течение 36-48 часов образует обильную биомассу.

Штамм Rhodococcus erythropolis (ВКМ Ас-1769)

Грамположительные неподвижные мелкие коккопалочки. На питательном агаре образует круглые блестящие колонии красноватого цвета. В жидкой питательной среде дает обильный рыхлый осадок. Дыхание окислительного типа, оксидазо- и каталазоположителен, желатин не разжижает, казеин и крахмал не гидролизует, цитрат утилизирует медленно, активно ассимилирует углеводородсодержащие вещества, слабо - глюкозу.

Хорошо растет на синтетических питательных средах, используя в качестве единственного источника питания и энергии органические вещества и углеводородсодержащие соединения, при глубинном культивировании в течение 48-52 часов образует обильную биомассу.

Наработку предлагаемого биопрепарата осуществляют методом глубинного культивирования на жидкой синтетической среде постоянного состава в биологическом реакторе.

Приготовление посевного материала в колбах и культивирование в аппаратах проводят на среде следующего состава:

В качестве источника углерода используют глюкозу в количестве не более 1% на весь цикл приготовления как посевного материала, так и культуральной жидкости.

В ферментер, заполненный на 2/3 объема питьевой водопроводной водой, последовательно вводят компоненты синтетической питательной среды. Среду перемешивают и устанавливают требуемое значение pH (6,9±0,1) Стерилизуют питательную среду при температуре (121±2)°C в течение (30±1) мин. Питательную среду, приготовленную в аппарате, следует считать серией. Срок хранения питательной среды не более 24 часов.

Стерильная питательная среда должна отвечать следующим требованиям:

Таким же требованиям должна отвечать среда для приготовления посевных материалов.

Посевным материалом для ферментера служат культуральные жидкости двух производственных штаммов Pseudomonas fluorescens (ВКМ В-6847) и Rhodococcus erythropolis (ВКМ Ас-1769), приготовленные в колбах, посевная доза каждого компонента должна составлять не менее 1·10⁶ кл.·см^-3.

Посевной материал для ферментера готовят в колбах, помещенных в термостатируемые аппараты для встряхивания колб.

Для культивирования в колбы вносят синтетическую питательную среду в количестве, составляющем 1/5 объема колбы. Инокулятом служит бактериальная суспензия штаммов, выращенных раздельно на скошенном питательном агаре. Посевная доза на колбу составляет не менее 1·10⁶ кл.·см^-3.

Микробные культуры штаммов выращивают при температуре (32±1)°C в течение (36±4) ч с постоянным механическим перемешиванием. Питательную среду вносят в колбы различной емкости, затем колбы засевают. Концентрация клеток в начальной стадии культивирования должна составлять не менее 1·10⁶ кл.·см^-3. Культивирование ведется при (32±1)°C в режиме 150-160 об·мин^-1 в течение (48±4) ч.

Выращивание двухкомпонентного микробного деструктора осуществляют методом глубинного культивирования в ферментере

В ферментер со стерильной питательной средой в количестве 2/3 от объема аппарата вводится раствор глюкозы из расчета 0,4-0,6% от общего объема, температура доводится до (32±1)°C. Среду в аппарате перемешивают, раствором NH₄OH доводят значение pH до 7,2±0,1. После этого в аппарат вносят посевной материал штаммов. Посевная доза в аппарате должна составлять не менее 1·10⁶ кл.·см^-3.

Совместное выращивание микробных культур в ферментере проводят при температуре (32±1)°C с постоянной подачей воздуха для аэрации и вращением мешалки 340-360 об·мин^-1 в течение 35±2 ч. Контроль за температурой, расходом воздуха, разрежением в полости ферментера и значением pH осуществляют по ротаметру, моновакуумметру, уравновешенному мосту и pH-метру. Культивирование прекращают при достижении требуемого значения pH (7,5±0,5). Допускается раздельное приготовление культуральных жидкостей каждого штамма, при этом используют синтетическую питательную среду, одинаковую по своему компонентному составу, как для штамма В-6847, так и для штамма Ас-1769. В этом случае смешивают обе раздельно приготовленные культуральные жидкости в соотношении 1:1 по объему.

Для получения более высокой, чем на синтетической среде, концентрации углеводородокисляющих бактерий культивирование можно проводить в жидкой питательной среде на основе 3-5% гидролизата казеина при вышеописанных условиях.

Культуральная жидкость, состоящая из двух штаммов, после цикла культивирования в ферментере должна отвечать следующим требованиям:

Культуральную жидкость, полученную при культивировании двух штаммов углеводородокисляющих бактерий, охлаждают до комнатной температуры, определяют микроскопическим, колориметрическим или другим методом общую концентрацию бактериальных клеток.

В случае раздельного выращивания штаммов культуральные жидкости для получения готового препарата смешивают в объемном отношении 1:1. Затем добавляют стерильный технический глицерин в количестве 5-6 об.% и тщательно перемешивают.

Срок хранения готовой жидкой формы препарата при температуре (25±4)°C составляет не менее 30 суток, при (4±2)°C - не менее 3 месяцев.

Готовый препарат "ЦЕНТРУМ-МMS" по своим физико-химическим и биологическим показателям должен соответствовать следующим требованиям и нормам:

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Приготовление посевного материала в колбах и последующее культивирование проводят на среде следующего состава:

В качестве источника углерода используют глюкозу в количестве не более 1% на весь цикл приготовления как посевного материала, так и культуральной жидкости в ферментере.

Культуральную жидкость готовят ферментере БИОР-01, который представляет собой сварной цилиндр со стальной плоской крышкой. Обогрев и охлаждение препарата производится через рубашку. Аппарат снабжен трехъярусной мешалкой, магнитным приводом, барботером, устройством для отбора проб и ввода добавок. Частота вращения мешалки 0,4-10,0 об·сек^-1. В аппарат, заполненный на 2/3 объема питьевой водопроводной водой, последовательно вводят компоненты синтетической питательной среды. Среду перемешивают, устанавливают значение pH 6,9. Стерилизуют питательную среду при температуре (121±2)°C в течение 30±1 мин. Питательную среду, приготовленную в аппарате, следует считать серией. Срок хранения среды не более 24 часов.

Стерильная питательная среда должна отвечать следующим требованиям:

Таким же требованиям должна отвечать и питательная среда для приготовления посевных материалов.

Посевным материалом для ферментера служат культуральные жидкости двух производственных штаммов Pseudomonas fluorescens (ВКМ В-6847) и Rhodococcus erythropolis (ВКМ Ас-1769), приготовленные в колбах, посевная доза каждого компонента должна составлять 1·10⁶ кл.·см^-3.

Посевной материал для аппарата БИОР-01 готовят в колбах вместимостью 250 или 750 см³ в термостатируемых аппаратах для встряхивания колб.

Для культивирования в колбы вносят синтетическую питательную среду в количестве, составляющем 1/5 объема колбы. Инокулятом служит бактериальная суспензия указанных штаммов, выращенных раздельно в пробирках на скошенном питательном агаре. Посевная доза на колбу составляет 1·10⁶ кл.·см^-3.

Культивирование в колбах ведется при температуре (32±1)°C, в режиме 150 об·мин^-1, в течение 48 ч.

По окончании процесса культивирования оценивают прирост биомассы путем определения общего количества микробных клеток. Полученный посевной материал должен отвечать следующим требованиям:

Готовый посевной материал может храниться при температуре (4±2)°C до 10 суток. Микробные культуры, полученные за один цикл культивирования в 6-12 колбах, составляют партию.

В ферментер вместимостью 0,1 м³ со стерильной питательной средой в количестве 2/3 от объема аппарата вводят раствор глюкозы из расчета 0,4% от общего объема, температура доводится до 32°C. Питательную среду в аппарате перемешивают и раствором NH₄OH доводят значение pH до 7,2±0,1. После этого в аппарат вносят посевной материал штаммов. Посевная доза в аппарате составляет 1·10⁶ кл.·см^-3.

Совместное выращивание микробных культур в ферментере проводят при температуре (32±1)°C с постоянной подачей воздуха для аэрации и вращением мешалки 340-360 об·мин^-1 в течение 35 ч. Контроль за температурой, расходом воздуха, разрежением в полости ферментера и значением pH осуществляют по ротаметру, мановакуумметру, уравновешенному мосту и pH-метру. Культивирование прекращают при достижении значения pH 7,5±0,5.

Культуральная жидкость, состоящая из двух штаммов, после цикла культивирования в ферментере должна отвечать следующим требованиям:

Культуральную жидкость, полученную при культивировании двух штаммов углеводородокисляющих бактерий, охлаждают до комнатной температуры. Микроскопическим или колориметрическим методом определяют общую концентрацию бактериальных клеток. Затем в полученную культуральную жидкость добавляют стерильный технический глицерин в количестве 5 об.% и тщательно перемешивают.

Срок хранения готовой жидкой формы препарата при температуре (25±4,0)°C должен составлять не менее 30 суток, при (4±2)°С - не менее 3 месяцев.

Получают биопрепарат следующего состава, мас.%:

Пример 2

Приготовление посевного материала в колбах и последующее культивирование проводят на среде следующего состава:

В качестве источника углерода используют глюкозу в количестве не более 1% на весь цикл приготовления как посевного материала, так и культуральной жидкости.

Культуральную жидкость готовят в ферментере БИОР-01, который представляет собой сварной цилиндр со стальной плоской крышкой. Обогрев и охлаждение аппарата производится через рубашку. Аппарат снабжен трехъярусной мешалкой, магнитным приводом, барботером, устройством для отбора проб и ввода добавок. Частота вращения мешалки 0,4-10,0 об·сек^-1. В аппарат, заполненный на 2/3 объема питьевой водопроводной водой, последовательно вводят компоненты синтетической питательной среды. Среду перемешивают, устанавливают значение pH 7,0. Стерилизуют питательную среду при температуре (121±2)°C в течение 30±1 мин. Питательную среду, приготовленную в аппарате, следует считать серией. Срок хранения питательной среды не более 24 часов.

Стерильная питательная среда должна отвечать следующим требованиям:

Таким же требованиям должна отвечать и питательная среда для приготовления посевных материалов.

Посевным материалом для ферментера служат культуральные жидкости двух производственных штаммов Pseudomonas fluorescens (ВКМ В-6847) и Rhodococcus erythropolis (ВКМ Ас-1769), приготовленные в колбах, посевная доза каждого компонента составляет 1·10⁶ кл.·см^-3 _.

Посевной материал для аппарата БИОР-01 готовят в колбах вместимостью 250 или 750 см³, которые затем помещают в термостатируемые аппараты для встряхивания колб.

Для культивирования в колбы вносят синтетическую питательную среду в количестве, составляющем 1/5 объема колбы. Инокулятом служит бактериальная суспензия указанных штаммов, выращенных раздельно в пробирках на скошенном питательном агаре. Посевная доза на колбу составляет 1·10⁶ кл.·см^-3.

Микробные культуры штаммов выращивают при температуре (31±2)°C в течение 52 ч в режиме 160 об/мин.

По окончании процесса культивирования оценивают прирост биомассы путем определения общего количества микробных клеток. Полученная посевная культура должна отвечать следующим требованиям:

Готовый посевной материал может храниться при температуре (4±2)°C до 10 суток. Микробные культуры, полученные за один цикл культивирования в 6-12 колбах, составляют партию.

В ферментер вместимостью 0,1 м³ со стерильной питательной средой в количестве 2/3 от объема аппарата вводят раствор глюкозы из расчета 0,6% от общего объема, температура доводится до (32±1)°C. Среду в аппарате перемешивают, раствором NH₄OH доводят значение pH до 7,2±0,1. После этого в аппарат вносят посевной материал штаммов, посевная доза в аппарате составляет 1·10⁶ кл·см^-3.

Совместное выращивание микробных культур в ферментере проводят при температуре (32±1)°С с постоянной подачей воздуха для аэрации и вращением мешалки 340-360 об·мин^-1 в течение 35 ч. Контроль за температурой, расходом воздуха, разрежением в полости ферментера и значением pH осуществляют по ротаметру, мановакуумметру, уравновешенному мосту и pH-метру. Культивирование прекращают при достижении значения pH (7,5±0,5).

Культуральная жидкость, состоящая из двух штаммов, после цикла культивирования в ферментере должна отвечать следующим требованиям:

Культуральную жидкость, полученную при культивировании двух штаммов углеводородокисляющих бактерий, охлаждают до комнатной температуры. Проверяют микроскопическим или колориметрическим методом общую концентрацию бактериальных клеток. Затем в полученную культуральную жидкость добавляют стерильный технический глицерин в количестве 6 об.% и тщательно перемешивают.

Срок хранения готовой жидкой формы препарата при температуре (25±4)°C должен составлять не менее 30 суток, при (4±2)°C - не менее 3 месяцев.

Получают биопрепарат следующего состава, мас.%:

С целью оценки эффективности предлагаемого препарата определяли его углеводородокисляющую активность.

Специфическую активность препарата оценивали по степени утилизации углеводородов сырой нефти и нефтепродуктов методом ИК-спектроскопии в контрольных и опытных образцах.

Количество вносимых горючесмазочных материалов и нефти составляло 50-100 граммов на килограмм почвы. Образцы почвы были помещены в жестяные лотки размерами 30×12×8 см, в них вносили предлагаемый препарат и препарат сравнения "Центрин". Концентрация микроорганизмов во всех вариантах составила (5-10)·10⁹. Температура окружающей среды (20-24)°C. Наблюдения проводили на 10, 20 и 30 сутки. Углеводороды в опытных и контрольных образцах экстрагировали четыреххлористым углеродом, затем пробы для исследований готовили согласно методике пробоподготовки для ИК-спектроскопирования.

Расчет количества углеводородов, содержащихся в контрольных и опытных пробах, проводили используя программное обеспечение к FTIR-8201 при помощи предварительно построенной калибровочной зависимости содержания в пробе нефти или нефтепродуктов от площади спектра. В таблице приведены сравнительные испытания по оценке биодеградационной активности препарата "ЦЕНТРУМ-MMS" и широко используемого коммерческого препарата "Центрин".

Согласно представленным данным предлагаемый двухкомпонентный препарат "ЦЕНТРУМ-MMS" обладает более высокой биодеградационной активностью в отличие от коммерческого препарата сравнения "Центрин".

В случае использования "ЦЕНТРУМ-MMS" отмечены и более высокие темпы биодеградации нефтепродуктов. Так, дизельное топливо практически на 80% утилизировано к окончанию срока наблюдения, степень деградации нефти и мазута превосходила показатели, полученные при обработке проб "Центрином". При введении биопрепарата "ЦЕНТРУМ-MMS" в загрязненную почву происходит активный рост штаммов интродуцированных бактерий, особенно бактерий штамма АС-1769. Данный факт особенно ценен при обработке бедных песчаных почв, являющихся естественной средой обитания бактерий группы родококков.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что разработанный жидкий препарат на основе двух природных штаммов обладает высокой биодеградационной активностью и может быть использован для интенсификации процессов очистки почв, загрязненных нефтяными углеводородами. Активизация деструкции нефтепродуктов с помощью препарата "ЦЕНТРУМ-ММS"сопровождалась уменьшением ингибирующего воздействия углеводородов на группы чувствительных почвенных микроорганизмов и, следовательно, повышением биологической активности почв.

Таким образом, предлагается биологический препарат экологического назначения "ЦЕНТРУМ-MMS", который характеризуется:

компонентным составом, представленным двумя видами микроорганизмов с выраженной способностью утилизировать углеводороды при их совместном воздействии;

высокой биодеградационной активностью в отношении сырой нефти и различных видов углеводородных топлив;

активностью при утилизации "тяжелых", а также ароматических углеводородов;

возможностью применения для ремедиации почв при сравнительно низких температурах окружающей среды (8-12)°C, что особенно актуально для северных нефтедобывающих районов РФ.