СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АРЕНИЦИНА

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного ареницина - антимикробного пептида кольчатого червя Arenicola marina, который может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве антибиотика широкого спектра действия.

Ареницин является эндогенным антибиотиком беспозвоночного Arenicola marina (пескожил морской), относящегося к классу Polychaeta (многощетинковые) типа Annelida (кольчатые черви) [пат. РФ №2261866, С07К 14/435, А61Р 31/04, 2005]. Молекула ареницина представляет собой немодифицированную пептидную цепь, содержащую 21 аминокислотный остаток и стабилизированную одной дисульфидной связью, замыкающей цикл из 18 аминокислотных остатков. Ареницин вырабатывается целомоцитами (фагоцитирующими клетками целома червя) и обладает антибактериальной и противогрибковой активностью. Механизм действия ареницина предположительно состоит в избирательном нарушении барьерной функции клеточных мембран патогенных микроорганизмов, не затрагивающем мембраны клеток организма-хозяина. Ареницин является представителем принципиально нового семейства антимикробных пептидов и может найти применение в качестве антибиотика широкого спектра действия.

В настоящее время клиническая медицина столкнулась с проблемой устойчивости патогенов к антибиотикам из имеющегося арсенала лекарственных средств, которые в ряде случаев уже не обеспечивают эффективного контроля над возбудителем при развитии хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваний. Антимикробные пептиды являются ведущими молекулярными факторами системы врожденного иммунитета эукариотических организмов, без которого невозможно их выживание в среде, изобилующей потенциальными патогенами. С антимикробными пептидами, обладающими широким спектром биологического действия, связан один из эволюционно древнейших механизмов экстренной защиты животных и человека от инфекции. В настоящее время показана иммуномодулирующая активность антимикробных пептидов [Kamysz W., Okroj M., Lukasiak J. // Novel properties of antimicrobial peptides. Acta Biochim. Pol., 2003, v.52(2), p.461-469]. Учитывая наличие выраженной антибиотической и иммуномодулирующей активности у природных антимикробных пептидов и их особую роль в функционировании системы врожденного иммунитета [Papagianni M. // Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnology Advances, 2003, v.21, p.465-499], многие зарубежные фармацевтические и биотехнологические компании приступили к созданию нового класса антибиотиков на их основе. В настоящее время в технологически развитых странах клинические испытания проходят пептидные антибиотики, рекомендуемые в качестве терапевтических средств при лечении сепсиса, менингита, пневмонии, легочных инфекций при муковисцидозе (кистозном фиброзе), язвенной болезни желудка, инфекций диабетической стопы, а также при лечении кандидоза слизистой оболочки полости рта, мукозита, гингивита, акне, импетиго, микозов, при заживлении ожогов и ран, осложненных вторичной инфекцией, и т.п. [Mcphee J.B., Hancock R.E.W.// Function and therapeutic potential of host defense peptides. J. Peptide Science. - 2005, vol.11, p.677-687].

Известен способ получения антимикробного пептида индолицидина, включающий культивирование штамма E.coli BL21 (DЕ3), трансформированного плазмидой pET32a:Ind3, химический лизис клеток в буфере, содержащем 6 М гуанидин-хлорид, очистку гибридного белка с помощью метало-хелатной хроматографии, расщепление бромцианом в кислой среде по остаткам метионина, разделение продуктов реакции и очистку индолицидина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ [Morin K.M., Arcidiacono S., Beckwitt R., Mello C.M. // Recombinant expression of indolicidin concatamers in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, v.70, p.698-704]. Главным недостатком способа является низкий выход рекомбинантного пептида, составляющий 150 мкг с 1 л клеточной культуры.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения антимикробного пептида аденорегулина, включающий культивирование штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/pET32a-adr, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение растворимой фракции клеточного белка с помощью центрифугирования, очистку гибридного белка с помощью металло-хелатной хроматографии, расщепление бромцианом в кислой среде по остаткам метионина, разделение продуктов реакции и окончательной очистки аденорегулина методами обращенно-фазовой и эксклюзионной ВЭЖХ [Zhou Y.X., Cao W., Luo Q.P., Ma Y.S., Wang J.Z., Wei D.Z. // Production and purification of a novel antibiotic peptide, adenoregulin, from a recombinant Escherichia coli. Biotechnology Letters, 2005, v.27(10), p.725-730]. Недостатком системы являются трудности, возникающие при хроматографической очистке целевого пептида после расщепления гибридного белка бромцианом. Исходная плазмида рЕТ32а кодирует остаток метионина в составе природной последовательности тиоредоксина А и четыре остатка метионина в линкере, отделяющем тиоредоксин А от последовательности целевого полипептида. Вследствие этого при расщеплении бромцианом гибридного белка наряду с основным продуктом образуется пять дополнительных коротких полипептидных фрагментов, затрудняющих дальнейшую очистку целевого пептида.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента антимикробных пептидов и получения антимикробного пептида ареницина.

Поставленная задача решается за счет культивирования штамма-продуцента, индукции синтеза рекомбинантного белка, разрушения клеток, отделения нерастворимой фракции клеточного белка, аффинной очистки гибридного белка His8-TrxL-Ar2 с помощью металло-хелатной хроматографии, его солюбилизации и расщепления бромцианом в кислой среде по остатку метионина, разделения продуктов реакции и окончательной очистки ареницина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Для получения гибридного белка, содержащего ареницин, используют новый штамм бактерии Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2. Данный штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli штамма BL-21(DE3) плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2, состоящей из BglII/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида His8-TrxL-Ar2, содержащего гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и ареницин, и BglII/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2 клеток Escherichia coli к ампициллину. Биосинтез продукта проводят следующим образом: клетки штамма BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 выращивают в богатой среде (например, LB) с добавлением 100-200 мкг/мл ампициллина до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀ 0,5-1,0 при температуре 37°С, ступенчато увеличивая объем культуральной жидкости путем последовательных пересевов материала, после чего индуцируют синтез белка изопропил-β-D-галактозидом в концентрации 0,1-1,0 мМ или лактозой и растят еще 5-6 часов при температуре 25-30°С. Увеличение выхода рекомбинантного белка может быть достигнуто с помощью принудительной аэрации культуральной жидкости и использования обогащенных питательных сред (например, с добавлением глюкозы).

Получение из клеток продуцента гибридного белка His8-TrxL-Ar2 включает следующие стадии: отделение бактерий от культуральной среды с помощью центрифугирования, их разрушение одним из обычно применяемых способов (ультразвуковой дезинтеграцией, химическим лизисом с использованием детергентов и хаотропных агентов), отмывку буферными растворами телец включения от водорастворимых компонентов клетки, солюбилизацию телец включения и очистку гибридного белка с помощью металло-хелатной хроматографии в денатурирующих условиях.

Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме:

1. Тельца включения подвергают двукратной отмывке 50 мМ фосфатным буфером (рН 7,8) или 25 мМ трис-HCl буфером (рН 8,1).

2. Отмытые тельца включения растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,8) или 50 мМ трис-HCl буфере (рН 8,1), содержащем 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. Осадок отделяют центрифугированием.

3. Раствор, содержащий целевой гибридный белок, подвергают аффинной хроматографии на смоле с хелатированными ионами Ni²⁺ или Со²⁺. В качестве промывочного раствора используют 100 мМ фосфатный буфер (рН 7,8) или 50 мМ трисовый буфер (рН 8,1), содержащий 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. В качестве элюирующего раствора используют буфер, содержащий 6 М гуанидин-HCl и 0,5 М имидазол.

4. Фракцию элюата, содержащую гибридный белок His8-TrxL-Ar2, подвергают диализу против деионизированной воды при температуре 4°С в течение 12-18 ч. Выпавший осадок собирают и лиофильно высушивают.

5. Навеску очищенного His8-TrxL-Ar2 растворяют в 80% трифторуксусной кислоте, либо в 70% муравьиной кислоте, либо в 6 М гуанидине-HCl с добавлением 0.1 М HCl и добавляют равную массу бромциана. Реакционную смесь инкубируют в темноте 16-20 ч при температуре 20-25°С. Реакцию останавливают добавлением трех-пятикратного объема воды, после чего упаривают образец под вакуумом при температуре 37°С. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют не менее трех раз.

6. Навеску продуктов реакции растворяют в 10% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты и подвергают очистке методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентрации ацетонитрила. Фракцию, содержащую ареницин, лиофильно высушивают.

7. При необходимости может быть проведена дополнительная очистка целевого продукта методом ВЭЖХ.

8. Идентичность рекомбинантного ареницина природному пептиду устанавливают методами ПААГ-электрофореза в трис-трициновой системе, MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, секвенированием N-концевой аминокислотной последовательности по методу Эдмана, а также сравнительным тестированием антимикробной активности методом серийных разведении в жидкой питательной среде. Степень очистки ареницина определяют методами ПААГ-электрофореза в трис-трициновой системе и MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.

Изобретение иллюстрирует пример.

Пример.

Получение ареницина.

Культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Аr2 проводят следующим образом.

Клетки штамма BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 выращивают в жидкой среде LB с добавлением 150 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀ 1,0 при температуре 37°С. Индукцию синтеза белка проводят с помощью изопропил-β-D-галактозида в концентрации 1,0 мМ, после чего инкубируют 5 часов при температуре 30°С.

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин, ресуспендируют в лизирующем буфере (100 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (рН 7,8), 0,5 М NaCl, 1% Triton X-100) и разрушают с помощью ультразвукового гомогенизатора. Все работы по выделению гибридного белка проводят при температуре 4°С. Нерастворимую фракцию клеточного белка (тельца включения), содержащую гибридный белок, отделяют центрифугированием. Тельца включения дважды ресуспендируют в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,8) и центрифугируют.

Отмытые тельца включения растворяют в концентрации 20 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,8), содержащем 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. Осадок отделяют центрифугированием. Супернатант наносят на предварительно уравновешенную колонку с Ni-NTA агарозой (Qiagen) из расчета 1 г суммарного белка на 100 мл смолы. Колонку промывают 100 мМ фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. Фракцию, обогащенную рекомбинантным белком, элюируют 100 мМ фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 6 М гуанидин-HCl и 0,5 мМ имидазол, и подвергают диализу против 100 объемов деионизированной воды при температуре 4°С в течение 18 ч через диализную мембрану, удерживающую молекулы с массой более 1 кДа. Выпавший осадок собирают и лиофильно высушивают.

Анализ фракций, а также степень чистоты гибридного белка на разных стадиях выделения определяют с помощью ПААГ-электрофореза в трис-трициновой буферной системе и методом MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.

Навеску очищенного гибридного белка растворяют в 80% трифторуксусной кислоте в концентрации 2%, добавляют равную массу бромциана (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°С в защищенном от света месте при постоянном встряхивании в течение 20 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего упаривают образец при 37°С. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют трижды.

Навеску продуктов реакции растворяют в концентрации 10 мг/мл в 10% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты. В данных условиях полностью растворяются как искомый пептид, так и нерасщепленный гибридный белок и белок-носитель. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Разделение продуктов реакции расщепления и очистку ареницина проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на препаративных колонках в системе, состоящей из буфера А (5% ацетонитрил, 0,1% ТФУ) и буфера В (80% ацетонитрил, 0,1% ТФУ). Ареницин элюируют линейным градиентом буфера В от 10 до 40%. Детектирование ведут при длине волны 214 нм. Фракцию элюата, соответствующую ареницину, собирают и лиофильно упаривают. Выход ареницина с чистотой не менее 99%, полученного заявленным способом (без использования ферментера), составляет не менее 5 мг/л культуры.

Аминокислотная последовательность полученного пептида идентична природному ареницину (Arg¹-Trp²-Cys³-Val⁴-Tyr⁵-Ala⁶-Tyr⁷-Val⁸-Arg⁹-Ile¹⁰-Arg¹¹-Gly¹²-Val¹³-Leu¹⁴-Val¹⁵-Arg¹⁶-Tyr¹⁷-Arg¹⁸-Arg¹⁹-Cys²⁰-Trp²¹). Для определения N-концевой аминокислотной последовательности ареницина применяют автоматическое микросеквенирование на приборе Precise 491 cLC Protein Sequencing System (Applied Biosystems, США). Идентификацию фенилтиогидантоин-производных аминокислот проводят на анализаторе 120А РТН Analyzer (Applied Biosystems, США). В основе методики автоматического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи по методу Эдмана, позволяющему последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов и идентифицировать отщепленные производные аминокислот методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате автоматического микросеквенирования установлена полная идентичность аминокислотных последовательностей генно-инженерного и природного ареницина.

Для определения молекулярной массы ареницина используют MALDI (matrix-assisted lazer desorption ionization) масс-спектрометрический анализ на приборе VISION 2000 (ThermoBioAnalysis, OK). В качестве матрицы используют 0,15 М 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 25% метанол и 0,1% трифторуксусную кислоту. Образец облучают УФ-лазером с длиной волны 337 нм и максимальной энергией 250 мкДж в импульсном режиме с частотой 3 нс. При масс-спектрометрическом исследовании ареницина (мощность лазера - 45%, число лазерных ударов - 69) получен пик с m/z 2772 (см. чертеж), соответствующий молекулярному иону природного ареницина (расчетная молекулярная масса составляет 2772,35 Да).

Антимикробную активность ареницина определяют методом радиальной диффузии пептидов в агарозном геле с тест-культурой микроорганизма, позволяющим оценивать микробицидную активность, расходуя минимальное количество препарата. Для определения антимикробной активности отдельных фракций полипептидов используют культуры следующих микроорганизмов: Escherichia coli, штамм ML-35p (грамотрицательная бактерия); Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия); Candida albicans (гриб класса аскомицетов). Антимикробное действие выделенных пептидов фиксируют через 24 часа по наличию зон ингибирования роста тест-культуры (таблица 1). Показано, что генно-инженерный и природный ареницины в количестве ˜1 мкг проявляют микробицидную активность в отношении всех трех микробов. Действие обоих пептидов в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также их противогрибковая активность практически одинаковы. Так, например, минимальная ингибирующая концентрация как природного, так и рекомбинантного пептида в отношении E.coli составляет 25 мкг/мл.