СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНАЛИЗИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА (ВАРИАНТЫ), ИЗМЕРИТЕЛЬНЫЙ ПРИБОР ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНАЛИЗИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА

Область техники

Изобретение относится к электрохимическому устройству для измерения концентрации анализируемого вещества в биологической жидкости, в частности, к механизму для определения времени, когда жидкость образует электрическое соединение между рабочим и контрольным электродами устройства.

Описание предшествующего уровня техники

Целый ряд медицинских диагностических процедур включает в себя исследование биологических жидкостей, таких как кровь, моча или слюна, чтобы определить концентрацию анализируемого вещества в этой биологической жидкости. Одним из представляющих наибольший интерес анализируемых веществ является глюкоза, и для исследования проб биологических жидкостей на концентрацию глюкозы в клинических лабораториях, медицинских учреждениях и домашних условиях широко используются сухофазные индикаторные полоски, содержащие ферментные составы. Фактически, индикаторные полоски стали ежедневной необходимостью для огромного числа больных диабетом, насчитывающего около 16 миллионов человек. Так как диабет вызывает возникновение опасных аномалий в химическом составе крови, он может приводить к потере зрения, отказу почек и другим серьезным медицинским последствиям. Для снижения опасности таких последствий большинство больных диабетом должны периодически самостоятельно проверять себя, а затем соответственно корректировать концентрацию глюкозы в своем организме, например, с помощью диеты и/или инъекций инсулина. Некоторым пациентам требуется проверять концентрацию глюкозы в крови до четырех и более раз в сутки.

Для больных диабетом, которые должны контролировать свою диету, чтобы корректировать прием сахара и/или делать инъекции инсулина, и которые должны при этом руководствоваться частыми проверками концентрации глюкозы в крови, особую важность представляет наличие быстродействующей, недорогой и точной системы определения глюкозы.

Известна система измерения глюкозы по электрохимическому принципу, в которой определяется окисление глюкозы крови на индикаторной полоске с сухим реагентом. Этот реагент обычно содержит фермент, такой как глюкозооксидаза или глюкозодегидрогеназа, окислительно-восстановительный медиатор, такой как ферроцен или феррицианид. Такой тип измерительной системы описан в патентах CШA №4224125, выданном 23 сентября 1980 г. на имя Накамура и др. (Nakamura et al.), №4545382, выданном 8 октября 1985 г. на имя Хиггинс и др. (Higgins et al.), и №5266179 выданном 30 ноября 1993 г. на имя Нанкаи и др. (Nankai et al.), упоминаемых здесь для сведения.

Электрохимические измерители глюкозы могут быть кулонометрическими, амперометрическими или потенциометрическими в зависимости от того, что измеряется в системе для определения концентрации глюкозы: заряд, ток или потенциал соответственно. При этом в любом случае важно определить момент времени, когда проба крови вступает в контакт с реагентом, так как электрический сигнал должен подаваться на полоску после этого в точно определенное время.

В патенте США №5266179, выданном 30 ноября 1993 г. на имя Нанкаи и др. (Nankai et al.), описана электрохимическая система для измерения глюкозы крови, в которой определяется время падения сопротивления между двумя электродами, к которым прикладывается постоянное напряжение.

В патенте США №5366609, выданном 22 ноября 1984 г. на имя Уайт и др. (White et al.), описан такой же принцип контроля за падением сопротивления между электродами для определения падения сопротивления между электродами, чтобы установить время, когда на сухую индикаторную полоску для определения глюкозы наносится кровь. В обоих патентах между рабочим и контрольным электродами подается постоянное напряжение, чтобы проследить за изменениями сопротивления, возникающими в результате нанесения пробы крови на сухую индикаторную полоску.

Для получения точных результатов процедура обнаружения пробы не должна влиять на концентрацию анализируемого вещества, и было предложено несколько методов минимизации возмущения анализируемого вещества.

В заявке №148387 на патент Германии, поданной 28 декабря 1979 г. (Quade et al.), описано электрохимическое измерение, в котором используется новая электронная схема, обеспечивающая быстрое переключение между потенциостатическим (постоянное приложенное напряжение) и гальваностатическим (постоянный подводимый ток) режимами, и в то же время позволяющая сократить число электронных элементов. Задача, решаемая этой схемой, состоит в уменьшении возмущения пробы перед началом измерения.

В заявке №208230 на патент Германии (DDR), поданной 24 ноября 1981 г. (Bartels et al.), раскрыто электрохимическое измерение, целью которого также является уменьшения возмущения пробы. Это измерительное устройство включает в себя схему, в которой используется диод для уменьшения потока тока перед началом измерения без использования дополнительного амперометрического контура. Кроме того, схема обеспечивает точное и быстрое переключение на потенциометрический режим.

В патенте США №4940945, выданном 10 июля 1990 г. (Littlejohn et al.), описано портативное устройство, которое может измерять рН в пробе крови. Это устройство обнаруживает наличие пробы в ячейке посредством подвода постоянного тока между электродом заполнения снаружи камеры с пробой и одним из электродов внутри камеры. Когда полное сопротивление уменьшается, по меньшей мере, на два порядка, измерительный прибор признает, что представлено достаточное количество пробы, и выдает звуковой сигнал. Затем электрод заполнения выключается из схемы, которая содержит два электрода внутри ячейки с пробой, и измерения выполняются потенциометрическим путем.

Сущность изобретения

Предложен способ измерения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости, которая наносится на полоску для электрохимической диагностики, включающую наложенные друг на друга рабочий и контрольный электроды. Этот способ заключается в том, что

(a) подводят заранее определенный постоянный ток источника между рабочим и контрольным электродами,

(b) контролируют разность потенциалов на электродах,

(c) наносят пробу на полоску,

(d) определяют время обнаружения пробы, отмечая время, когда разность потенциалов падает ниже заранее определенного порогового напряжения,

(e) прикладывают заранее определенное постоянное напряжение к пробе,

(f) измеряют электрический отклик в заранее определенное время после приложения постоянного напряжения, и

(g) вычисляют концентрацию анализируемого вещества с помощью измеренного электрического отклика.

Измерительный прибор для измерения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости, нанесенной на диагностическую полоску, содержащий связанные электрически

(a) средство для подвода заранее определенного постоянного тока между рабочим и контрольным электродами,

(b) средство для контролирования разности потенциалов на электродах,

(c) средство для определения, когда разность потенциалов падает ниже заранее определенного порогового напряжения, для индикации обнаружения пробы,

(d) средство для приложения заранее определенного постоянного напряжения к пробе в ответ на обнаружение пробы,

(e) средство для измерения полученного электрического отклика, и

(f) средство для вычисления концентрации анализируемого вещества с помощью измеренного электрического отклика.

Согласно изобретению предложены способ и устройство для электрохимического измерения концентрации анализируемого вещества, которые позволяют очень точно определить время, когда проба, поступившая в реакционную зону полоски для электрохимической диагностики, замыкает зазор между электродами. Определение времени нанесения пробы (точнее, времени обнаружения пробы, эти термины используются как взаимозаменяемые) позволяет произвести более аккуратный и точный анализ пробы.

Преимущество предложенного способа для определения времени нанесения пробы заключается в том, что подвод постоянного тока малой величины для обнаружения пробы сводит к минимуму возмущения пробы по сравнению с известными способами, в которых прикладывается постоянное напряжение. При последнем подходе нанесение пробы вызывает образование тока, который превосходит определенный порог, для начала измерения времени. Так как скорость отбора проб ограничена, этот ток обычно имеет значительную величину, прежде чем сенсор признает превышение порога. При большом токе соответственно наблюдается большое возмущение в медиаторе. Это может привести к неточности измерения, особенно при малых концентрациях анализируемого вещества.

Еще один недостаток известного способа приложения постоянного потенциала для обнаружения нанесения пробы заключается в том, что начальный ток обычно уменьшается с уменьшением концентрации анализируемого вещества. Поэтому при проведении анализа с малым содержанием исследуемого вещества гораздо труднее определить первоначальное время обнаружения пробы. По той же причине, если установить слишком низкий порог тока, может произойти ошибочный запуск под действием шума. Ситуация еще больше осложняется тем, что наличие высокой концентрации эритроцитов также снижает начальный ток.

Предлагаемый способ не зависит от концентрации анализируемого вещества и эритроцитов. Также не представляет существенной проблемы шум, так как запуск обнаружения происходит в результате большого изменения в напряжении сигнала.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 изображает график зависимости подведенного тока и измеренного напряжения от времени, который иллюстрирует процесс обнаружения пробы согласно изобретению;

фиг.2 изображает график зависимости приложенного напряжения и результирующего отклика тока от времени для способа проведения анализа согласно изобретению;

фиг.3 изображает график зависимости приложенного напряжения и результирующего отклика тока от времени для альтернативного способа проведения анализа согласно изобретению;

фиг.4 изображает график зависимости заряда от времени для другого альтернативного способа проведения анализа согласно изобретению;

фиг.5 изображает электрохимическое устройство, пригодное для использования при проведении анализа согласно предложенному способу;

фиг.6 изображает схему, пригодную для использования в настоящем изобретении.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к электрохимическому способу измерения концентрации анализируемого вещества в биологической жидкости. Для краткости далее описывается измерение концентрации глюкозы в пробах цельной крови, однако специалисту в области медицинской диагностики будет понятно, как использовать данное описание для контроля других анализируемых веществ (таких как холестерин, кетоновые тела, алкоголь, и т.п.) в других жидкостях (таких как слюна, моча, тканевая жидкость и т.п.).

Электрохимический (амперометрический) способ измерения концентрации анализируемого вещества в водной пробе включает помещение пробы в реакционную зону в электрохимическом элементе, содержащем два электрода, которые имеют полное сопротивление, пригодное для амперометрического измерения. Исследуемому веществу дают прореагировать непосредственно с электродом или с окислительно-восстановительным реагентом, чтобы образовалось окисляемое (или восстанавливаемое) вещество в таком количестве, которое соответствует концентрации анализируемого вещества. После этого электрохимическим путем определяют количество окисляемого (или восстанавливаемого) вещества. Такой тип анализа должен точно определять момент времени, когда в реакционной зоне обнаруживается проба. Это позволяет подавать электрохимический сигнал (т.е. напряжение) сразу после нанесения пробы и точно определять период инкубации или время реакции. А это, в свою очередь, повышает аккуратность и точность анализа, как будет описано ниже.

Согласно изобретению предложены усовершенствованные способ и устройство для определения времени обнаружения пробы. Способ включает подачу постоянного тока малой величины от источника на электрод полоски для электрохимической диагностики и контроль за разностью потенциалов между электродами. Поскольку между электродами имеется сухой зазор, вначале протекает пренебрежимо малый ток. Когда на полоску наносится проба и заполняет этот зазор, измеряемое напряжение быстро падает, вызывая начало отсчета времени анализа. Признав таким образом, что нанесена проба, устройство переключается из режима постоянного тока в режим постоянного напряжения. В режиме постоянного напряжения измеряется ток или заряд как функция времени, чтобы вычислить концентрацию анализируемого вещества. Такой способ сводит к минимуму ошибку, вводимую в выходной сигнал схемой инициирования отсчета времени, и тем самым обеспечивает малые пределы обнаружения. Используются простые и недорогие электронные элементы.

На фиг.1 изображен график подаваемого тока и измеренного напряжения, который иллюстрирует процесс обнаружения пробы согласно изобретению. Перед моментом времени 0 (т.е. перед введением пробы) между электродами подается постоянный ток (например, в данном случае 1 мкА), но протекающий ток имеет пренебрежимо малую величину. Меньший ток уменьшает возмущения и является предпочтительным особенно для малых концентраций анализируемого вещества. Измеренное напряжение определяют по напряжению питания схемы, в данном случае 5 В. После введения пробы в элемент (в момент времени 0) подводимый ток может протекать между электродами, и измеряемое напряжение быстро падает. Когда напряжение падает ниже какого-то порогового значения, устройство переключается от постоянного подводимого тока к постоянному прикладываемому напряжению.

На фиг.2 изображен график, показывающий зависимость прикладываемого потенциала и измеренного тока от времени после обнаружения пробы. Проба обнаруживается в момент t=0, и сразу после этого прикладывается напряжение между рабочим электродом и противоэлектродом. В результате между электродами течет ток. После калибровки системы с использованием проб, имеющих известную концентрацию анализируемого вещества, этот ток после заранее определенного времени является мерой концентрации анализируемого вещества. Продолжительность упомянутого, заранее определенного времени не имеет особого значения. Обычно она составляет, по меньшей мере, около трех секунд, если жидкостью является кровь, а анализируемым веществом - глюкоза. Такая продолжительность, как правило, обеспечивает достаточно времени для растворения реагентов и восстановления такого количества медиатора, которое легко измерить. При прочих равных условиях и высоком гематокрите требуется более продолжительное время. С точки зрения практического применения, пользователь обычно заинтересован в наиболее быстром получении показаний. Обычно удовлетворительным временем считается продолжительность десять секунд, если нет никаких оснований для более длительного ожидания. Конечно, после установки заранее определенного времени для получения аккуратных и точных результатов требуется, чтобы каждый раз использовалось одно и то же время. В любом случае точность определения тока зависит от точности определения в момент t=0.

На фиг.3 показан график зависимости измеренного тока и приложенного напряжения от времени в альтернативном варианте способа. Согласно этому способу на электроды через заранее определенное время подается второй импульс напряжения. Обычно, второй импульс подается сразу после заранее определенного времени (для уменьшения общего времени измерения), но допускается также и некоторая задержка. В этом случае также для воспроизводимых результатов требуются воспроизводимые процедуры, следовательно, для этого способа также важно точное определение момента t=0. Второй импульс вызывает возникновение положительного пика в токе, протекающем через электроды, за которым следует затухающий ток. После калибровки системы концентрацию анализируемого вещества можно определять по скорости затухания, взятой отдельно или в комбинации с измерением тока, показанным на фиг.2. Обычно ток затухает экспоненциально в течение времени, которое начинается приблизительно через 1 секунду после приложения второго импульса и продолжается приблизительно, по меньшей мере, в течение нескольких секунд после этого.

На фиг.4 проиллюстрирован способ по фиг.3, в котором измеряется не ток, а заряд. Как и на графике на фиг.3, концентрацию анализируемого вещества можно определить по общему заряду за фиксированное время и/или по скорости затухания после приложения второго напряжения.

На фиг.5 изображено "тонкослойное" устройство 10, пригодное для использования в описанных выше способах. Подложка 12 представляет собой полиэфирную основу 14, на которую нанесено, обычно методом напыления, Pd покрытие 16, образующее рабочий электрод. Сухой реагент, состоящий из буфера, медиатора и фермента, нанесен вблизи одного конца 18 электрода. Промежуточный слой 20 представляет собой двусторонний связующий материал с вырезом 22, который образует гальванический элемент. Обычно, промежуточный слой имеет толщину менее чем около 200 мкм. Верхний слой 24 представляет собой полиэфирный слой 26, на который нанесено, обычно также методом напыления, Au покрытие 28, образующее контрольный электрод.

В устройстве описанного выше типа можно использовать систему глюкозооксидаза (GOD) /феррицианид для определения концентраций глюкозы через следующие реакции, где GOD* - восстановленный фермент.

Реакция 1

глюкоза + GOD → глюконовая кислота + GOD*.

Реакция 2

GOD* + 2феррицианид → GOD + 2 ферроцианид.

Феррицианид ([Fe(CN)₆]^3-) является медиатором, который возвращает GOD* в его каталитическое состояние. GOD, катализатор фермента, будет продолжать окислять глюкозу до тех пор, пока присутствует избыточный медиатор. Ферроцианид ([Fe(CN)₆]^4-) является продуктом общей реакции. В идеальном случае в начале ферроцианид отсутствует, хотя на практике всегда есть его небольшое количество. После завершения реакции концентрация ферроцианида (измеренная электрохимическим путем) показывает исходную концентрацию глюкозы. Общая реакция является суммой реакций 1 и 2.

Реакция 3

GOD

глюкоза + 2феррицианид → глюконовая кислота + 2ферроцианид.

Под "глюкозой" подразумевается конкретно β-D-глюкоза. Более подробное описание этой системы имеется в международной заявке WO 97/18465, упоминаемой здесь для сведения.

На фиг.6 представлен вариант выполнения электронных схем для реализации настоящего изобретения. Вначале на полоски подается постоянный ток при положении 1 переключателя 105. Источник тока состоит из операционного усилителя 104, источника 102 опорного напряжения и сопротивлений 101 и 103. Ток определяется по отношению источника 102 опорного напряжения к сопротивлению 103. Сопротивление 101 используется для создания требуемого смещения. Операционный усилитель 110 и сопротивление 109 используются в качестве вольтамперного преобразователя. Вначале, при отсутствии пробы на полоске сопротивление между точками 107 и 108 очень большое, и ток, протекающий через полоску, пренебрежимо мал. В этом состоянии выходное напряжение операционного усилителя 104 (V1) высокое. Когда на полоску наносится проба, ее сопротивление значительно падает, и поскольку через полоску протекает постоянный ток, V1 падает. V1 подается в микропроцессор 112 через аналого-цифровой преобразователь 111. Микропроцессор 112, признавая это упавшее напряжение как обнаружение пробы, переключает 105 в положение 2, отсоединяя полоску от источника тока и соединяя ее с источником напряжения 106. В этом условии можно произвести хроноамперометрическое измерение, измерив напряжение на выходе операционного усилителя 110 (V2). Это напряжение пропорционально току, протекающему через полоску.

Представленный ниже пример демонстрирует принцип настоящего изобретения, ни в коей мере не ограничивая его.

Пример

Использовалась схема, показанная на фиг.6, где полоска S представляет собой тонкослойную полоску для электрохимического анализа глюкозы такого типа, как показана на фиг.5, с электродами Pd и Аu. Электрод Pd покрыт слоем буфера, глюкозодегидрогеназы (PQQ) и феррицианида. Постоянный невозмущающий ток малой величины (около 1 мкА) подавали между рабочим электродом и контрольным/противоэлектродом сухой полоски глюкозы. Так как полоска сухая, сопротивление между рабочим и контрольным /противоэлектродом было практически бесконечным. После нанесения пробы полной крови на гальванический элемент наблюдали падение напряжения. Порог около 50-500 мВ инициировал время пуска (предпочтительный порог составляет около 300 мВ). После обнаружения пробы прибор переключали с подачи постоянного тока на подачу постоянного напряжения. Измерение тока, протекающего через пробу, в зависимости от времени позволяло вычислить концентрацию глюкозы.

Специалистам будет понятно, что представленные выше описание изобретения и его конкретный пример являются только иллюстрацией реализации настоящего изобретения. Можно внести изменения в его детали, не выходя за рамки объема притязаний изобретения.