ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОСКОП

Изобретение относится к оборудованию для научных исследований, в частности к флуоресцентным микроскопам, предназначенным для получения изображения люминесцирующих объектов, иммобилизованных на стекле или другой плоской поверхности, точнее к люминесцентно-микроскопическому анализу объектов, обладающих флуоресценцией при освещении возбуждающим светом.

В настоящее время для наблюдения люминесцирующих объектов применяются различные по конструкции устройства. В одном из них источником света служит мощная дуговая лампа или лампа накаливания. Свет от источника света с помощью системы линз направляется на объект, возбуждая его флуоресценцию (иногда применяется схема освещения объекта через объектив с использованием светоделительного дихроичного зеркала). Свет флуоресценции объекта собирается объективом, который передает изображение объекта на детектор света, а именно в глаз при визуальном наблюдении, на фотопленку или ПЗС камеру для регистрации изображения. Недостатком данной системы является необходимость применения в качестве источника света высокомощных ламп, которые дают свет в широкой области спектра, включая инфракрасную область, так что более 90% излучения лампы является паразитным, и с ним необходимо бороться установкой специальных теплозащитных и интерференционных фильтров. Осветитель требует мощного источника питания, обычно располагающегося в отдельном блоке. ("Каталог люминесцентных микроскопов фирмы LEITZ", 1977) [1].

Известно также устройство, в котором возбуждение люминесценции объекта осуществляют лазером и регистрируют изображение люминесцирующего объекта с помощью ПЗС камеры. Лазер помещается сбоку от образца и освещает его под углом Брюстера. Изображение образца создается с помощью двух одинаковых фотографических объективов, расположенных навстречу друг другу, и передающих изображение объекта в масштабе 1:1. Особенностью данной схемы является то, что она необходима для создания параллельного пучка света между объективами, что позволяет расположить между ними интерференционный светофильтр. Вместе с тем, эта схема резко ограничивает области применения системы и уменьшает ее чувствительность. Система дает увеличение 1:1 и позволяет анализировать объекты, размеры которых сопоставимы с размерами чипа ПЗС камеры. Одним из недостатков системы является ее недостаточная чувствительность, что заставляет использовать длительные (порядка 10 минут) экспозиции при записи изображения. Увеличение экспозиции приводит к выцветанию образца во время анализа, а также требует охлаждения ПЗС камеры жидким азотом (-196^oC) для снижения темнового тока. Другой существенный недостаток системы вызван тем фактом, что луч лазера неоднороден в своем сечении (в нем имеются так называемые "спеклы"), в результате чего разные места объекта освещаются с разной интенсивностью. ("Fluorescence Array Detector for Large-Field Quantitative Fluorescence Cytometry" K.D.Wittrup, R.J.Westerman, R.Desai, Cytometry" v. 16, p. 206-213, 1994) [2].

Наиболее близким аналогом данного изобретения может служить флуоресцентный микроскоп, в котором образец освещается сфокусированным лазерным лучом, двигающимся по отношению к образцу. В каждый момент времени освещается небольшой участок препарата (обычно, освещаемая площадь имеет диаметр 0,1-1,0 мкм), флуоресценция которого возбуждается, и интенсивность объекта измеряется высокочувствительным фотодетектором (фотоумножителем или фотодиодом). С помощью специальных устройств лазерный луч сканирует объект (либо объект двигается по отношению к лазерному лучу). Основными недостатками этой системы являются: необходимость применения высокоточных и быстродействующих механических узлов, отвечающих за перемещение лазерного луча по отношению к объекту (или объекта - по отношению к лазерному лучу), невозможность визуального наблюдения объекта, необходимость использования компьютера и соответствующего программного обеспечения, как правило, более длительное время анализа (объект анализируется "точка за точкой"). Кроме того, этот метод требует обязательного знания оператором (исследователем) хотя бы основ компьютерных программ анализа изображения. ("Каталог микроскопов фирмы CARL ZEISS", Confocal Laser Scan Microscope (LSM). 1994) [3].

Задачей настоящего изобретения, наряду с расширением арсенала технических средств для люминесцентно-микроскопического анализа объектов, является разработка микроскопа, позволяющего использовать преимущества бокового лазерного освещения (весь свет излучателя используется для возбуждения флуоресценции объекта, находящегося в поле зрения объектива оптической системы) в сочетании с такими достоинствами флуоресцентного микроскопа, как возможность визуального наблюдения объекта, возможность смены увеличения, возможность регистрации изображения на фотопленку.

Спецификой изучения объектов, например типа "биочип", является сравнение с высокой точностью интенсивностей люминесценции отдельных его элементов (ячеек), при этом разница в яркостях люминесценции различных ячеек может быть велика. В этой связи желательно, чтобы анализирующий прибор обладал одинаковой чувствительностью в различных участках поля зрения и большим динамическим диапазоном. В случае неравномерного по яркости освещения объекта, обычно используют математические программы для выравнивания чувствительности (нормализация). Недостатком этих программ является то, что они снижают анализируемый динамический диапазон, причем это снижение тем выше, чем больше неравномерность освещенности. Поэтому во всех случаях целесообразно добиваться максимальной равномерности освещенности объекта. Эта задача не является тривиальной, в частности, при использовании лазера.

Данная задача решается за счет того, что во флуоресцентном микроскопе, содержащем оптическую систему для наблюдения и/или фиксирования изображения образца на носителе информации, держатель образца, расположенного напротив объектива оптической системы, источник возбуждения флуоресцентного излучения, набор сменных запирающих фильтров для выделения света люминесценции образца, источник возбуждения флуоресцентного излучения содержит по меньшей мере два лазера, установленных сбоку от держателя образца и под углом к нему, при этом угол установки лазеров и/или угол фокусировки лазерных лучей выбраны из условия обеспечения требуемой интенсивности и равномерности освещенности поля зрения объектива оптической системы.

Использование двух и более лазеров, установленных как описано выше, позволяет существенно уменьшить неравномерность освещенности за счет распределения спеклов лазеров, что необходимо для получения количественных характеристик люминесценции объекта в большом динамическом диапазоне, а также увеличить яркость освещения объекта.

Кроме того, в ряде случаев, анализирующее устройство должно определять интенсивность люминесценции каждой ячейки микрочипа в двух разных длинах волн при различном возбуждении. На практике это можно осуществить либо с помощью последовательного измерения интенсивности люминесценции ячеек микрочипа в нескольких длинах волн при последовательном освещении различными лазерами, либо параллельным измерением интенсивности люминесценции этих же ячеек в различных длинах волн разными детекторами при одновременном освещении разными лазерами. В соответствии с изложенным, в настоящем изобретении лазеры могут различаться длиной волны излучения.

Для обеспечения тонкой настройки системы лазеры могут быть установлены с возможностью регулировки угла наклона по отношению к образцу.

С целью устранения недостатков, связанных с неоднородностью лазерного луча, лазеры устанавливают с возможностью вращения относительно их оптических осей. При этом лазеры могут быть снабжены приводами вращения.

Лазеры флуоресцентного микроскопа могут быть установлены с возможностью вращения относительно оптической оси системы. Это позволяет свести практически на нет влияние неравномерности светового луча лазера в поперечнике при увеличении экспозиции и интегрировании светового потока от участков объекта, освещаемых с разной интенсивностью в разные моменты времени. При этом они также могут снабжаться приводом вращения лазеров относительно оптической оси системы.

Однако для специалиста является очевидным, что изобретение, охарактеризованное в прилагаемой формуле изобретения, может быть модифицировано различными способами без отхода от основной идеи изобретения.

На представленном чертеже изображена схема флуоресцентного микроскопа согласно данному изобретению.

Флуоресцентный микроскоп, как показано на чертеже, имеет держатель образца 1, объектив 2, призму 3, окуляр для визуального наблюдения 4, окуляр для фотографирования 5, промежуточную линзу 6 для согласования размера изображения с размером детектора света, фотопленку 7, ПЗС камеру 8, запирающий фильтр 9, лазеры 10 (с целью упрощения дальнейших пояснений на схеме изображен один из лазеров).

Устройство работает следующим образом. Луч лазера 10 освещает образец, при этом величина и форма освещаемой площади зависят от величины расходимости луча лазера и от угла, под которым луч освещает образец. Обычно площадь, освещаемая лазером на объекте, составляет несколько квадратных миллиметров. Излучение люминесценции образца после прохождения через объектив 2 и фильтр 9 либо направляется с помощью призмы 3 и окуляра 4 в глаз для визуального наблюдения, либо при выведенной призме направляется объективом 5 на фотопленку или промежуточной линзой 6 на фотопленку 7 или ПЗС камеру 8 для регистрации изображения.

Для увеличения равномерности освещенности анализируемого объекта используются описанные выше варианты в любых комбинациях.

Примеры
По изложенной схеме была собрана установка для изучения люминесценции биологических микрочипов.

Источником света служил гелий-неоновый лазер с длиной волны 594 нм, и мощностью 2,5 мВт. Диаметр лазерного луча около 1,5 мм в диаметре, при падении на объект под углом около 75^o освещал эллипс с осями 1,5 и 3,5 мм. Диаметр поля зрения примененного объектива составлял 4,3 мм, апертура объектива 0,4. В качестве анализируемого флуорохрома использовали Техасский красный. Люминесценцию объекта наблюдали либо с помощью визуальной насадки, либо регистрировали на фотопленку с помощью фотонасадки с черно-белой фотопленкой чувствительностью 3000 ед. ISO.

Пример 1. Специфичность, чувствительность и работоспособность установки проверяли с помощью биологических микрочипов, представляющих собой предметное микроскопное стекло с упорядоченно нанесенными на его поверхность ячейками геля размером 60 х 60 мкм и толщиной 20 мкм. В каждой ячейке геля иммобилизована индивидуальная проба - олигонуклеотид определенной структуры. Микрочип инкубируется с раствором, содержащим исследуемые фрагменты ДНК, меченные флуоресцентным красителем. ДНК взаимодействует с олигонуклеотидами, вызывая специфическую люминесценцию некоторых ячеек. Интенсивность люминесценции и взаимное расположение люминесцирующих ячеек позволяет судить о структуре анализируемого фрагмента.

В качестве объекта был выбран микрочип, в разных ячейках которого было иммобилизовано различное количество меченного Техасским красным олигонуклеотида. Микрочип освещался лазером и его люминесценция оценивалась на глаз и регистрировалась на фотопленку. При визуальном наблюдении адаптированным к темноте глазом были видны ячейки геля, содержащие 100 амоль метки на одну ячейку и больше. При регистрации на фотопленку и выдержке 20 с, была получена такая же чувствительность, то есть были видны ячейки геля с содержанием вещества 30 амоль на ячейку размером 60 х 60 мкм. При проекции этой ячейки на ПЗС матрицу, обычно она анализируется 64 пикселями, то есть на один пиксель попадает изображение 1/64 ячейки, или 0,2 амоль. Таким образом, чувствительность системы составляет менее, чем 2 х 10⁴ молекул флуорохрома на пиксель. Эта чувствительность легко может быть повышена самыми разными способами, например, применением более высокоапертурного объектива, использованием более мощного лазера или нескольких лазеров, увеличением времени экспозиции.

Пример 2. Был изготовлен микрочип для выявления бактериального заражения, то есть микрочип, содержащий ячейки геля с иммобилизованными в них олигонуклеотидами, специфичными к различным бактериям. Этот микрочип был обработан (проведена гибридизация со специфической РНК, выделенной из бактерий и меченной Техасским красным). Распределение интенсивности люминесценции между ячейками геля наблюдали визуально и регистрировали на фотопленку. Визуальный анализ микрочипа показал, что распределение интенсивности люминесценции между ячейками геля соответствует ожидаемому. Изображение микрочипа было зарегистрировано на фотопленку при выдержке 2,5 мин.

Эти опыты показали, что данный микроскоп обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, он гораздо проще и компактнее, чем существующие устройства, не требует от исследователя специальных знаний.

Выше приведены предпочтительные примеры осуществления изобретения, допускающие различные изменения и дополнения, не выходящие за пределы существа и объема изобретения. Соответственно следует понимать, что данное описание настоящего изобретения имеет лишь иллюстративное, а не ограничивающее назначение.